专利名称：源自Glaucocystophytes的质体转运肽的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物的遗传修饰、特别是将感兴趣的多肽转运到植物质体(plastid)上。
背景技术：
质体包含它自身的基因组。然而，在进化过程中，许多质体基因被转移到核基因组 中。因此，已经发展了机制用于将核编码的质体蛋白转运回到质体上。这些蛋白是通过使 用位于被转运蛋白的N端的转运肽序列来进行转运的。这些肽将这些蛋白引导(direct) 到质体上并且可以随后被特异性的蛋白酶识别，这可能导致转运肽(transit peptid)的去 除。细胞生物学中的一个根本性问题是将由细胞质核糖体合成的蛋白精确并且有效 的靶向到它们的适当的细胞内的位置上。对于其中在适当的细胞器中需要该转基因产物的 转基因高等植物而言尤其是这样。本发明提供了将异源多肽有效地转运进入转基因高等植 物的叶绿体中的质体转运肽。出人意料地，这可以使用源自Glaucocystophyte的蓝色小体 (cyanelle)转运肽来完成。发明概述在此提供了用于将多肽靶向至叶绿体的组合物和方法。组合物包括转运肽以及编 码转运肽(即，靶向质体的肽或运输肽(transport peptide))及其变异体的多个核苷酸序 列。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体包括对该转运肽进行编码的核苷酸序列，该 核苷酸序列与编码异源多肽的核苷酸序列可操作连接。这些DNA构建体在表达以及将异源 多肽的靶向到质体中找到了用途。组合物还包括多个表达盒、载体、转化的植物、转化的植 物细胞、以及稳定转化的植物种子，它们包含对异源多肽进行编码的多核苷酸，该异源多肽 通过本发明的质体转运肽而靶向至叶绿体。发明详细说明本发明的质体靶向或转运肽介导了可运作地连接的多肽进入质体的靶向、定位、 或转运。质体是在植物和藻类中发现的细胞器。质体负责光合作用、储存产物(如淀粉)， 并且负责许多类别的分子(如脂肪酸、萜类、以及作为细胞构造单元(celluar building blocks)所需要的其它分子)的合成。质体有能力来分化、或再分化成几种形式，这取决 于它们在细胞中的作用。未分化的前质体可以发展成为以下质体中的任何一种，包括叶绿体、色质体(chromoplasts)、白色体(Ieucoplasts)、造粉质体(amyloplasts)、平衡石 (statoliths)、造油质体(elaioplasts)、以及蛋白质体(proteinoplasts)。“叶绿体转运肽”或“质体运输肽”或“质体转运肽”或“靶向质体的肽”或“转运肽” 或“靶向肽”是必要的并且足以协助将蛋白输入其天然宿主细胞的质体之中。该质体可以 是蓝色小体或叶绿体。转运肽被定位于输入质体中的蛋白质的N端。转运肽协助将可运作 地连接的多肽进入质体中的共翻译的或翻译后的转运。这些转运肽一般包括40和100个之间的氨基酸。研究表明转运钛包含一些共同 的特征。这些包括它们几乎没有带负电的氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰 胺；N端区域没有带电的氨基酸、并且没有如甘氨酸或脯氨酸的氨基酸；它们的中心区域包 含非常高比例的碱性或羧基化的氨基酸，如丝氨酸或苏氨酸；并且，它们的C端区域富含精 氨酸并且有能力形成两亲的β折叠二级结构。根据一个权威著作(Clineand Henry, Annu Rev Cell Dev Biol 12 1-26(1996))，来自高等植物的叶绿体转运肽共享以下特征(1)它们具有与线粒体的转运 肽表面上类似的特性。即它们富含羧基化的残基并且缺少酸性残基。(2)它们为30-120个 残基长。(3)N端的10-15个氨基酸没有甘氨酸、脯氨酸以及带电的残基。(4)可变的、中间 的区域富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸。(5)C-近端区域包含用于蛋白分解过程的宽 松保守的序列(Ile/Val-x_Ala/Cys*Ala)。(6)不存在延长的序列保护(conservation)或 保守的二级结构基序。(7)理论上，它们采取主要是随机螺旋的构象。存在着几种计算方法，它们使用以上特征来预测来自高等植物的叶绿体靶向序 列。计算工具包括PSORT (Nakai and Kanehisa, Proteins 11(2) 95-110 (1991) ；Horton et al. , Proceedings of the 4th Annual Asia PacificBioinformatics Conference APBC06, Taipei, Taiwan pp. 39-48 (2006) ；http://www. psort.org) > ChloroP(Emanuelsson et al. ,J Mol Biol 300 1005-1016(1999) ；http://www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/)或 TargetP(Nielsen et al. ,Protein Engineer 10:1-6(1997) ；Emanuelsson et al. ,J Mol Biol 300 1005-1016(2000) ；http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/).Glaucocystophytes是藻类的这样一家族，包含蓝色小体作为光合细胞器。 在 Glaucocystophyte 中存在几个属，包括 Cyanophora、灰胞藻属(Glaucocystis)禾口 Gloeochaete0蓝色小体本质上是原始性质体。不同于其它真核的质体，蓝色小体具有肽聚 糖层，该肽聚糖层据信是来自蓝细菌的质体的内共生起源的残遗物。Glaucocystophyte包 含光合色素叶绿素a。与红藻类和蓝细菌一起，它们通过藻胆体(phycobilisomes)(主要由 藻胆蛋白构成的)结构来收获光。绿藻类和陆生植物已经失去了这种色素。在所有这些质体之中，Glaucocystophyte蓝色小体与自由生存的蓝细菌最接近 的亲缘物。在蓝色小体的细胞壁中存在的肽聚糖层有可能是蓝色小体的蛋白输入机构 的关键部分。参见 Steiner and Loffelhardt, MolecularMembrane Biology 22(1-2) 123-132(2005)对于蓝色小体蛋白质转位的综述。高等植物的叶绿体已经失去了这种肽 聚糖层并且因此在它们的膜结构上与蓝色小体不同。已经进一步证实，蓝色小体与高等 植物的输入机构不同之处在于因为蓝色小体靶向的蛋白(铁氧还蛋白-NADP+-氧化还原 酶)被输入分离的豌豆和菠菜叶绿体中(Steiner and Loffelhardt, Trends Plant Sci 7:72-77(2002))；然而，高等植物叶绿体靶向的蛋白与蓝色小体不能作用(Steiner and
5Loffelhardt Mol. Memb. Biol. 22 123-132(2005))。蓝色小体转运肽序列与靶向叶绿体基质的肽不同之处在于在其N端结构域中含 有不变的苯丙氨酸残基，这对于通过蓝色小体的输入是关键性的。参见，例如Steiner and Loffelhardt Trends Plant Sci. 7 72-77(2002)；禾口Steinerand Loffelhardt Mol. Memb. Biol. 22 :123-132 (2005)。这种不变的苯丙氨酸残基对于蓝色小体以及藻红体(红藻质 体)是独特的并且不是绿色谱系的生物体(绿藻、裸藻属(Euglena)、硅藻(diatoms)以 及高等植物)中的质体转运肽的特征。蓝色小体转运序列与来自高等植物的靶向基质的 肽类在它们的氨基酸组成、在它们的正的净电荷并且在它们的结构域结构方面对应。蓝 色小体转运肽的N端显示了短的共有序列。参见Steiner et al. (2005)ThePlant J. 44 646-652(2005)。尽管不受限于任何作用机理，据信N端的苯丙氨酸残基仅对于输入蓝色小 体中是必要的，因此，这种残基在实践本发明时可以被修饰并且仍然将多肽有效地转运进 入高等植物叶绿体中。一起来看，以上数据对靶向蓝色小体的序列将异源蛋白引导至高等植物的叶绿体 上的能力产生了疑问。尽管Cyanophora paradoxa的前-FNR分子能够进入从豌豆中分离 的叶绿体中，但是并非必须能够得出该FNR转运肽在附接到异源蛋白时将能够与该高等植 物分泌系统相互作用以将异源蛋白有效地靶向至叶绿体上。出人意料地，本申请描述了使 用蓝色小体转运肽将异源蛋白靶向至高等植物中的叶绿体上的方法。在本发明的一个实施方案中，该转运肽是来自Glaucocystophyte，它在可运作 地连接至异源蛋白并且在转基因高等植物中表达时，将该异源蛋白靶向至该叶绿体。该 Glaucocystophyte 选自下组Cyanophora、灰胞藻属(Glaucocystis)、Gloeochaete 以及 Cyanophora paradoxa0本发明的另一个实施方案是将异源蛋白靶向至转基因高等植物的叶绿体的方法， 该方法包括以下步骤将来自Glaucocystophyte的转运肽可运作地连接至异源蛋白上并 且产生含该异源蛋白的转基因植物，其中该异源蛋白在该转基因植物的叶绿体中被检出。 该Glaucocystophyte 选自下组Cyanophora、Glaucocystis、Gloeochaete 以及 Cyanophora Paradoxa0这些组合物包括对转运肽连同其变异体进行编码的核苷酸序列。在一个实施方案 中，该转运肽包括SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列或其片段及变异体，连同SEQ ID NO=I 中列出的核苷酸序列及其变异体。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体含有编码转 运肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码异源多肽的核苷酸序列可操作连接。这些DNA构 建体在表达以及将该异源多肽的靶向到质体中找到了用途。组合物还包括表达盒、载体、转 化的植物、转化的植物细胞、以及稳定转化的植物种子，其中异源多肽通过本发明的转运肽 靶向到质体上。在本发明的一个实施方案中，这种转运肽是来自Glaucocystophyte，它在可运作 地连接至异源蛋白并且在转基因高等植物中表达时，将该异源蛋白靶向至该叶绿体上。转运肽是源自将靶向至该Glaucocystophyte的蓝色小体的蛋白进行编码的核 酸序列。转运肽可以在已知的要在宿主细胞的细胞核中被编码但是在翻译时将被靶向至 该宿主细胞的光合细胞器的基因中发现，并且可以选自下组，其组成为二磷酸核酮糖酯 羧化酶/加氧酶，5-烯醇丙酮酸莽草酸_3磷酸合成酶、乙酰乳酸合成酶、叶绿体核糖体蛋白CS17、Cs蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、二磷酸核酮糖羧化酶活化酶、色氨酸合成酶、酰 基载体蛋白、质体伴侣素-60、细胞色素C552、22-kDA热休克蛋白、33-kDA放氧增强蛋白 1 (oxygen-evolving enhancer protein 1)、ATP 合成酶 γ 亚基、ATP 合成酶 ω 亚基、叶绿 素-a/b-结合蛋白11-1、放氧增强蛋白2、放氧增强蛋白3、光系统I P21、光系统I P28、光 系统I P30、光系统I P35、光系统I P37、甘油-3-磷酸乙酰转移酶、叶绿素a/b结合蛋白、 CAB2蛋白、羟甲基-胆色烷合成酶(hydroxymethyl-bilane synthase)、丙酮酸-正磷酸二 激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素 还原酶、淀粉_粒子结合型淀粉酶合成酶、光系统II的集光叶绿素a/b-结合蛋白、主要花 粉变应原Lol ρ 5a、质体ClpB ATP依赖性蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化 还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合成酶、ATP 合成酶CFO亚基1、2、3或4 ；细胞色素f、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、谷酰胺合成酶、谷酰胺 合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热休克蛋白hsp 21、磷酸转运体、质体CIpAATP依赖性蛋白 酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋白 PsCL25、DAHP合成酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白11、甜菜碱_醛脱氢酶、GapB蛋白、谷 酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸盐还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体 蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、磷酸丙糖-3-磷酸甘油酸磷酸转运体、铁氧还蛋 白依赖性谷氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADP依赖性苹果酸酶、以及NADP苹果酸 脱氢酶。表1识别了含有质体靶向序列的另外的核编码的基因。在本发明的一个实施方案 中，转运肽是来自Cyanophora pardoxa、具体来自C. pardoxa铁氧还蛋白-NADP+-氧化还原 酶并且包括SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列。表1 对靶向到质体上的蛋白进行编码的核基因。参考文献以其全文通过引用结 合在此。
7_
权利要求
分离的核酸，该核酸包括编码来自Glaucocystophytes的质体转运肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与编码异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora。
3.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxB。
4.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该质体转运肽选自下组SEQID N0s:2、3、5 禾口 7。
5.转基因植物，包括编码来自Glaucocystophytes的质体转运肽第一核苷酸序列，其 中所述第一核苷酸序列与编码异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接，其中所述异源多肽 靶向叶绿体。
6.如权利要求5所述的转基因植物，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora。
7.如权利要求5所述的转基因植物，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxB。
8.如权利要求6所述的转基因植物，其中该植物是单子叶植物。
9.如权利要求7所述的转基因植物，其中该植物是双子叶植物。
10.如权利要求5-9任何一项所述的转基因植物，其中该质体转运肽编码选自下组的 多肽=SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
11.如权利要求8所述的转基因植物，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。
12.如权利要求9所述的转基因植物，其中该双子叶植物是大豆或甜菜植物。
13.用于在植物中稳定地表达异源多肽的方法，所述方法包括向所述植物中引入DNA 构建体，该构建体包括编码来自Glaucocystophyte的质体转运肽的第一核苷酸序列，其中 所述第一核苷酸序列与编码所述异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接。
14.如权利要求13所述的方法，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora。
15.如权禾丨J要求13所述的方法,其中该Glaucocystophyte是Cyanophoraparadoxa。
16.如权利要求14所述的方法，其中该植物是单子叶植物。
17.如权利要求15所述的方法，其中该植物是双子叶植物。
18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中该质体转运肽编码选自下组的多肽 SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
19.如权利要求16所述的方法，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。
20.如权利要求17所述的方法，其中该双子叶植物是大豆或甜菜植物。
21.分离的多肽，包括来自Glaucocystophyte的、与异源多肽可操作连接的质体转运肽。
22.如权利要求21所述的分离的多肽，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora。
23.如权利要求21所述的分离的多肽，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora paradoxB。
24.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该植物是单子叶植物。
25.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该植物是双子叶植物。
26.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该质体转运序列编码选自下 组的多肽:SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
27.如权利要求24所述的分离的多肽，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。
28.如权利要求25所述的分离的多肽，其中该双子叶植物是大豆或甜菜(sugarbeet) 植物。
全文摘要
在此提供了用于将多肽靶向到质体上的组合物和方法。组合物包括质体转运肽以及对此类转运肽及其变异体进行编码的核苷酸序列。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体含有对该质体转运肽进行编码的核苷酸序列，该质体转运肽可运作地与编码感兴趣的多肽的核苷酸序列相连。这些DNA构建体在对该感兴趣的多肽的表达以及将该感兴趣的多肽靶向到质体中找到了用途。组合物还包括表达盒、载体、转化的植物、转化的植物细胞、以及稳定转化的植物种子，其中通过本发明的质体转运肽将感兴趣的多肽靶向至质体上。
文档编号C12N15/11GK101960011SQ200980107578
公开日2011年1月26日 申请日期2009年1月19日 优先权日2008年1月30日
发明者斯泰西·米尔斯, 格雷戈里·W·沃伦, 约翰·希普斯金德 申请人:先正达参股股份有限公司