专利名称：鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的引物、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及鲤鱼两种类群的鉴别方法，具体地，涉及分布于我国的东亚类群鲤鱼 和分布于欧洲大陆的欧洲类群鲤鱼的简易、快速的分子鉴别技术和方法，属于遗传学领域
背景技术：
鲤鱼(Cyprinus carpio L.)自然分布于东亚和欧洲大陆，是目前世界上养殖范 围最广泛、历史最悠久的淡水鱼类。在长期的自然选择和人工驯养过程中，鲤已形成了数 量众多的品系或群体。综观鲤鱼的遗传亲缘关系和系统分类，这些数量众多的鲤鱼品系或 群体分为两大类群东亚类群和欧洲类群。关于这两大类群的起源问题，一直存在较大争 议。如国外学者Kohlmann 等在 2003 年《Aquatic Living Resources》16 卷 421-431 和 2005年《Aquaculture》247卷253-266报道了东亚鲤鱼起源于东亚，而欧洲鲤鱼起源于欧 洲；而许多作者研究表明，欧洲鲤鱼起源于欧洲很难得到支持，而认为欧洲鲤鱼是东亚鲤鱼 扩散而来，如 Froute 等 2002 年《Journal of Fish Biology)) 61 卷 301-304，Thai 等 2004 年《Animal Genetics)) 36 卷 23-28，Mabuchi 等 2005 年((Journal of FishBiology)) 66 卷 1516-1528和2006年《Aquaculture》257卷68-77。国内学者周建峰等于2003年《科学通 报》48卷第2期167-170报道中国长江野鲤与俄罗斯散鳞镜鲤属于东亚类群，而伏尔加野 鲤与德国镜鲤属于欧洲类群。可见，要弄清鲤鱼中这两大类群的起源问题，首先得对这两种 鲤鱼类群实施有效鉴别。我国是东亚鲤鱼群体最为丰富的国家，是鲤鱼东亚类群的最主要分布区。本发明 人近几年在对中国各主要水系鲤鱼的遗传分析中发现，在长江野鲤中16. 36%个体、黄河野 鲤中27. 59%个体、新疆额尔齐斯河鲤鱼31. 25%个体、黑龙江野鲤中40. 35%个体与欧洲 鲤鱼类群具有相同的鉴别性的线粒体DNA序列变异位点。此发现表明，在我国的鲤鱼群体 中，也具有欧洲类群的少部分鲤鱼。如何在我国鲤中有效快速地鉴别出东亚类群与欧洲类 群，这不仅在学术上，而且在种质资源保护与利用上均具有十分重要的意义和价值。除我国具有数量众多的土著鲤鱼群体或品系外，还从欧洲引进了鲤鱼群体。黑龙 江水产研究所1958年从前苏联引进了散鳞镜鲤(品种登记号GS-03-010-1996)；黑龙江 水产研究所1984年从德国引进了德国镜鲤，并开展了系统选育工作，成为一个优良养殖品 种(品种登记号GS-01-007-1996)在全国一些省、区养殖；全国水产技术推广总站1998年 从俄罗斯引进了乌克兰鳞鲤(品种登记号GS-03-001-2005)。这些具有不同来源和遗传背 景的鲤鱼类群在我国的广泛养殖，需发展相应的遗传鉴别技术予以甑别，有利于对这些鲤 鱼品种的保护。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快速地鉴别鲤的东亚类群与欧洲类群的引物、 试剂盒及方法，本发明是通过设计一对特异性的PCR引物，扩增它们基因组DNA，检测有无 PCR扩增产物而实现。
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本发明提供的技术方案是一种鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的引物，其上游引 物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，即5' -GACTATGAAAATCTAGGATTC-3‘，其下游引物核苷 酸序列如 SEQ ID No. 2 所述，即 5' -CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3 ‘。一种鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的试剂盒，包含上述的引物。上述的试剂盒，还包含10mmol/L Tris-HCL, 50mmol/L KCL,30mmol/L MgCL2, 0.01%明胶，0. lmmol/L dNTP混合液，2IU Taq酶和蒸馏水，所述的引物浓度为0. 2 y mol/L。一种利用上述的试剂盒鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的方法，包括下列步骤(1)提取待鉴定的鲤鱼的基因组DNA。(2)以提取的基因组DNA为模板，用所述的引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电 泳检测，有扩增条带的为鲤鱼的东亚类群，无扩增条带的为鲤鱼的欧洲类群。上述的方法中，所述待鉴定的鲤鱼是怀疑东亚类群还是欧洲类群的鲤鱼。本发明具有如下优点可简便、快速、有效、准确地鉴别鲤鱼的东亚类群和欧洲类 型，从而为欧亚大陆鲤鱼的遗传甑别、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科 学意义和实用价值。
图1为本发明中PCR扩增图谱，其中1-14号为鲤鱼欧洲类群样本号，15-18为鲤鱼 东亚类群样本号；M为入DNA+EcoRI+HindIIIDNA分子量标记。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的 限制，仅仅作示例说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。一、设计引物设计一对特异性的PCR扩增引物，引物序列为SEQ ID No. 1 5，-GACTATGAAAATCTAGGATTC-3，和 SEQ ID No. 2 :5’ -CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3，。二、采取样本取待鉴别的鲤鱼个体。本发明人选择了鲤鱼的东亚类群和欧洲类群各50尾，有足 够数量，因此获得的结果具有统计学意义，准确可靠。三、提取样本的DNA取每尾鱼的尾鳍组织约0. 2cm2，装入1. 5ml的离心管中，加入400 u L STE缓冲液 (30mmol/L Tris-HCl, pH8. 0, 200mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl)。混勻后加入浓度为 10% 的SDS 90 ii L和20mg/mL的蛋白酶K 10 u L，55°C消化8 lOh ；加入等体积饱和酚于转轮 上缓慢转动lh，10，000r/min离心8min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚氯仿异戊 醇=25 24 1)；缓慢转动30min，10，000r/min离心8min，取上清液加入等体积的氯仿 和异戊醇混合液(氯仿异戊醇=24 1)，缓慢转动5min，10, 000r/min离心5min，取上清液后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗涤，干燥，加入300 y L的TE
液溶解备用。四、进行PCR扩增以提取的DNA为模板，用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为 20iiL，内含 2iiL PCR 缓冲液(10mmol/L Tris-HCL, pH9. 0,50mmol/L KCL, 30mmol/LMgCL2, 0. 01 % 的明胶)，0. 8 ii L dNTP 混合液(每种 dNTP 0. lmmol/L) ,1.6uL 的引物(0. 2 u mol/ L)，0. 8iiL 基因组 DNA(50ng/iil)，0. 8iiL Taq 酶(2IU)，14 y L 的蒸馏水。扩增反应条件 为94°C预变性5min，接下来进行35个循环，每个循环包括94°C 30s,53°C 30s,72°C lmin, 35个循环后，72°C延伸lOmin。五检测扩增产物PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压下电泳40min之后，经凝胶成 像分析系统确定PCR扩增产物的大小；其片段大小如附图1所示，片段大小约为600bp。检测结果出现扩增片段为鲤鱼的东亚类群，没有出现扩增片段为鲤鱼的欧洲类 群。在本实施例中，1-14没有出现扩增条带，为鲤鱼的欧洲类群样本号，15-28出现了扩增 条带，为鲤鱼的东亚类群样本号。
权利要求
一种鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的引物，其特征在于其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即5′-GACTATGAAAATCTAGGATTC-3′，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即5′-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3′。
2.一种鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的 引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含lOmmol/LTris-HCL, 50mmol/L KCL,30mmol/L MgCL2，0. 01 % 明胶，0. 1 讓ol/L dNTP 混合液，2IU Taq 酶和蒸馏水，其中，所 述引物浓度为0. 2iimol/L。
4.一种利用权利要求2或3所述的试剂盒鉴别鲤鱼东亚类群与欧洲类群的方法，包括 下列步骤(1)提取待鉴定的鲤鱼的基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，用所述的引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检 测，有扩增条带的为鲤鱼的东亚类群，无扩增条带的为鲤鱼的欧洲类群。
全文摘要
本发明公开了鲤(Cyprinus carpio L.)的东亚类群与欧洲类群的简易、快速鉴定方法。采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，从而为欧亚大陆鲤鱼的遗传甑别、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。
文档编号C12N15/11GK101857897SQ201010145400
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者王成辉 申请人:上海海洋大学