专利名称：Pina-D1r缺失型小麦的鉴定方法及其特异性引物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记领域，具体涉及一种鉴定待测小麦是否为Pina-Dlr的PINA 蛋白缺失型小麦的方法及其特异性引物与应用。
背景技术：
籽粒硬度是国内外小麦市场分级和定价的重要依据，严重影响着小麦的磨粉和食 品加工品质，是目前最为重要的品质性状之一。近年来，随着小麦品质性状研究的日趋深 入，籽粒硬度也越来越受到更多的关注。籽粒硬度是一个受基因控制的具有较高遗传力的 性状，该性状的分子生物学改良已经在最近十几年内成为一个较为热门的研究课题，目前 研究表明，籽粒硬度主要受位于5D染色体短臂上的一对主效基因控制，并已经相继发现了 多个籽粒硬度主效基因等位变异类型，不同变异类型之间除硬度数值有较大差异外，磨粉 和食品加工品质也具有明显差异。同时，多项研究也均表明，硬度值过高如PINA蛋白缺失 类型品种反而对小麦加工品质造成一定的负面影响，因此选育不同类型的专用小麦品种 时，籽粒硬度基因型是一个非常重要的选择指标。而之前多项研究也均表明，PINA蛋白缺失类型在CIMMYT硬质麦中一直占据有主 导地位，同时在我国春麦区尤其是东北春麦区也占有很高的比例，这对我国小麦的品种改 良较为不利。而由于该类型分子机制较为复杂，其大多数为包括编码区在内的大片段缺失， 很难直接利用PCR技术直接用于鉴定和分析该类型，尽管Chen等已开发了其中一种PINA 蛋白缺失类型(Pina-Dlb)的分子标记，但由于PINA蛋白缺失类型较多，难以全部检测，因 此，目前仍需结合改进的SDS-PAGE或双向电泳技术对PINA蛋白缺失类型进行检测，这无疑 极大提高了检测成本和降低了检测效率。因此，进一步明确该类型的分子机制，并开发相应 的分子标记，从而使用标记筛选方法进行品质改良将会大大加快我国小麦品质育种进程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可直接在分子水平上进行检测且能大大加 快籽粒硬度基因型的筛选效率和准确度的Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法及其特异性引 物与应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是本发明保护序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。所 述特异性引物对为与小麦籽粒硬度Pina基因有关的分子标记，特别为一种可鉴定小麦籽 粒硬度PINA蛋白缺失类型(Pina-Dlr)的分子标记。上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2、。本发明提供一种Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法，包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物 对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有436bp条带的待测小麦为候选的Pina-Dlr缺 失型小麦；所述Pina-Dlr缺失型小麦的基因组DNA的Ha位点有10415bp片段的缺失，即Ha 位点缺失序列表中序列3所示的核苷酸。所述Pina-Dlr缺失型小麦可为如下小麦品种中的任意一种江东门、和尚头和红蜷芒。Pina-Dlr缺失型小麦引起小麦中PINA(Pina)蛋白不能表达，所以所述方法可应 用于辅助筛选PINA蛋白缺失型小麦。本发明提供一种非Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物 对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中没有436bp条带的待测小麦为候选的非 Pina-Dlr缺失型小麦；所述非Pina-Dlr缺失型小麦是基因组DNA中具有序列表的序列3所 示核苷酸的小麦。所述非Pina-Dlr缺失型小麦可为中国春或豫农202。所述方法可应用于辅助筛选非PINA蛋白缺失型小麦。所述特异性引物对可应用于制备鉴定待测小麦是否为Pina-Dlr缺失型小麦的试 剂盒。所述特异性引物对还可应用于制备鉴定待测小麦是否为非Pina-Dlr缺失型小麦的 试剂盒。所述特异性引物对也可应用于制备辅助筛选硬麦(硬质麦)的试剂盒。本发明还保护一种试剂盒，所述试剂盒包括所述特异性引物对。所述试剂盒可用 于鉴定待测小麦是否为Pina-Dlr缺失型小麦或鉴定待测小麦是否为非Pina-Dlr缺失型小 麦或辅助筛选硬麦(硬质麦)。本发明还保护一种辅助筛选硬麦的方法，包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物 对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有436bp条带的待测小麦为候选的硬麦。所述硬麦可为如下品种小麦中的任意一种江东门、和尚头和红蜷芒。本发明具有积极有益的效果所提供的特异引物对(分子标记)能够取代传统的SDS-PAGE和双向电泳技术，直 接在分子水平上进行Pina-Dlr类型的检测，准确度和可信度大大提高，能大大加快籽粒硬 度基因型的筛选效率和准确度，对小麦籽粒硬度的基因工程改良起到重要作用，同时也有 助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大
眉、ο
图1为测定Pina-Dlr类型缺失片段大小的引物步移法19对引物设计图；图2为SDS-PAGE电泳图；从左向右依次为中国春、江东门、红蜷芒和和尚头，上 下箭头依次为PINA和PINB蛋白；图3为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，从左向右，第1泳道为DNAladder DL2000 ；第2、3和4泳道为小麦品种江东门；第5、6和7泳道为小麦品种红蜷芒；第8和9泳道为小麦品种和尚头；第10泳道为阴性对照(即水做模板进行扩增)；第11和12泳道 分别为中国春和豫农202。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。； Chen F, Beecher B, Morris CF. Physical mapping and anew variant of Puroindoline b~2 genes in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2010,120 :745_751。“中国春”是中国四川的一个地方品种，是目前世界上最常用 的野生型普通小麦对照品种。豫农202 河南农业大学；孙继冰.小麦新品种豫农202最佳播期研究.种业导刊， 2009,6 :20-21。“豫农202”河南农业大学农学院小麦分子育种室2007年育成的小麦品种。和尚头河南农业大学；董珑丽，魏茶花，马晓娟，张荣.春小麦竞争能力与产量的 关系.生态学报，2007，27 =4023-4028.和尚头是我国早期应用较为普遍的一个地方品种。红蜷芒河南农业大学；薛飞，翟雯雯，段霞瑜，周益林，吉万全.小麦地方品种小 白冬麦抗白粉病基因分子标记.作物学报，2009，35 :1806-1811。红蜷芒是我国早期应用较 为普遍的一个地方品种。江东门河南农业大学；石元春主编.二十世纪中国学术大典-农业科学中国小 麦育种上贡献卓越的品种.2002 16-19.江东门是我国早期在长江中下游地区应用范围较 大的一个地方品种。实施例1不同小麦品种籽粒硬度的测定检测5个小麦品种的籽粒硬度(中国春、豫农202、红蜷芒、江东门、和尚头)。籽 粒硬度测定方法用单粒谷物硬度仪(SKCS 4100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品 的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。SKCS分析结果表明，5个小麦品种中，中国春属于软麦，其余4个小麦品种均为硬 麦(硬度均在60以上)。SKCS硬度平均值分别为中国春为12，豫农202为60，江东门为 73，和尚头为61，红蜷芒为70。实施例2特异性引物对的发现以江东门、和尚头和红蜷芒为实验材料采用引物步移法进行目的片段扩增。弓丨物 设计如图1所示，引物扩增为采用最佳退火温度重复扩增三次。其中第1、2、3、4、15、16、 17、18和19对引物能够扩增出目标片段，而第5、6、7、8、9、10、11、12、13和14对引物则不 能扩增出目标片段，表明缺失片段发生在第4对引物的下游和第15对引物的上游序列之 间，然后在第5对引物和第14对引物之间重新设计特异性引物对进行扩增，得到了 436bp 的片段。将片段进行测序后，与野生型Ha位点(NCBI编号CT009735)的同序列对比，发现 Pina-Dlr类型Ha位点序列缺少了 10415bp的片段缺失，缺失片段为自Pina基因第-5118bp 位核苷酸(相对于起始密码子ATG)至+5301位核苷酸，缺失片段核苷酸序列见序列表3。特异性引物对如下上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；
下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2)。实施例3应用特异性引物对鉴定Pina-Dlr缺失型小麦5个小麦品种中国春(软麦)、豫农202 (硬麦)、江东门(硬麦)、红蜷芒(硬麦) 和和尚头(硬麦)。分别对上述5个小麦品种按如下步骤进行鉴定(1) SDS-PAGE鉴定各个小麦品种是否属于PINA蛋白缺失类型①提取籽粒蛋白每个品种的小麦取一粒种子，分别按下述步骤提取籽粒蛋白1)研磨后放入一个 2mL离心管中，加入ImL预冷的TBS溶液和0. 15mL 12% Triton-Xl 14(Sigma公司)，混合 后4°C放置12 24h ；2) 12000rpm离心3分钟，移上清至1. 5mL离心管中，37°C温育半小时； 3) 12000rpm离心5min，弃上清，移下层至一新的离心管中，加入ImL预冷的TBS溶液，37°C 温育30min ；4) 12000rpm离心3min，弃上清，加入900 μ L预冷的丙酮，涡旋后在_20°C冰箱 中放置30min ；5) 12000rpm离心2min，弃上清，用丙酮再洗一遍后置于空气中进行干燥，得 到小麦籽粒蛋白。②SDS-PAGE电泳鉴定a)向步骤1提取的籽粒蛋白中加入150 μ L样品缓冲液(含7. 57mg/mL Tris, 10% 甘油，0. 02mg/mL SDS, 0. 0125mg/mL 溴酚兰)；b)将加入样品缓冲液的籽粒蛋白在70°C下温育15min，取25μ L进行SDS-PAGE 电泳。电泳条件为用浓缩胶(浓度T为4%，胶联度C为2. 67%)在40mA下电泳，待 指示剂到达分离胶(浓度T为13. 5 %，胶联度C为2. 6 % )后将电压功率转换成12W，待 指示剂到达分离胶底部后再电泳30min。为减少蛋白的扩散，用10%甘油代替水配制分 离胶。凝胶配制时用PDA^iperiazinediacrylamide)代替甲叉以使背景更为清晰，胶更 加结实和富有弹性。按 Morris 等(Morris C F, Massa A N. Puroindoline genotype of the U.S.nationalinstitute of standards & technology reference material 8441, wheathardness. Cereal Chemistry, 2003,80 674-678)的方法进行染色(用三氯乙酸和甲 醇固定、银染显色，用柠檬酸停止显色)。SDS-PAGE电泳结果表明，除中国春和豫农202具有PINA蛋白，其余材料均属于 PINA蛋白缺失类型。部分样品电泳结果见图2。(2) PCR鉴定各个小麦品种是否属于Pina-Dlb缺失型小麦每个品种的小麦取有代表性的一粒种子，提取基因组DNA作为模板，采用 Pina-Dlb基因全长引物对进行PCR扩增(用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增作为对 照)，以保证DNA质量。参照Chen等(2010)开发的标记，鉴定是否属于Pina-Dlb类型引物对(详见申请 号为201010033760. 4的中国发明专利申请)引物 3 (上游)5，-AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3，；引物 4 (下游)5，-GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3，。控制DNA质量所用的Pinb基因全长引物对引物 5 (上游)5，-GAGCCTCAACCCATCTATTCATC-3，；
引物 6 (下游)5，-CAAGGGTGATTTTATTCATAG-3，。
PCR反应体系的组成1. 5mmol/L MgCl2,0. 3mmol/L dNTP，上、下游引物各 lOpmol， 模板 DNA 200ng，0.5U Taq 酶，加 IXPCR 缓冲液(含 lOmmol/LTris-HCl，pH9. 0,50mmol/L KCl, 1. 0% Triton X-100)定容至 25 μ L。PCR反应程序先94°C预变性5min ；然后94°C变性50s，58°C退火45sec，72°C延伸 lmin，共35个循环；最后，72°C延伸5min。PCR扩增结束后，取上述两种PCR扩增产物各10 μ L分别进行1. 5%琼脂糖凝胶电 泳(采用IXTAE缓冲液；溴化乙锭(EB)染色，160V, 1. 5小时)，电泳结束后用凝胶成像系 统(MultiGenius Gel Documentation and Analysis System)扫描成像并用计算机进行分 析，部分样品扩增图见图3。分析结果表明5个小麦品种采用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增，均可以 得到597bp条带；而用Pina-Dlb特异引物则未扩增出任何条带，表明5个材料均不属于 Pina-Dlb 类型。(3)应用特异性引物对鉴定Pina-Dlr缺失型小麦①特异性引物对的制备人工合成如下特异性引物对上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2、。②应用特异性引物对鉴定Pina-Dlr缺失型小麦每个品种的小麦取一粒有代表性的种子，提取基因组DNA作为模板，采用特异性 引物对进行PCR扩增(用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增作为对照)，以保证DNA质量。结果表明除中国春和豫农202没有任何扩增产物外，其余3个小麦品种中，均能 扩增出436bp片段。(4)测序验证每个品种的小麦取一粒有代表性的种子，提取其基因组DNA进行测序验证，并将 测序结果与野生型5D染色体上的Ha序列(NCBI编号CT009735)进行比对，结果表明，除 中国春和豫农202外，江东门、和尚头和红蜷芒3个小麦品种的Ha位点均有10415bp片段 的缺失，属于Pina-Dlr类型。
权利要求
一种用于鉴定小麦籽粒硬度PINA蛋白缺失类型的特异性引物，包括下述引物对上游引物5’ TCAACATTCGTGCATCATCA 3’；下游引物5’ CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT 3’。
2.—种Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法，包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有436bp条带的待测小麦为候选的Pina-Dlr缺失型 小麦，所述Pina-Dlr缺失型小麦的基因组DNA的Ha位点有10415bp片段的缺失，即Ha位 点缺失序列表中序列3所示的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法，其特征在于，所述 Pina-Dlr缺失型小麦为农家品种江东门、和尚头、红蜷芒中的任意一种。
4.一种非Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法，包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增，所述特异引物对为权 利要求1所述的引物对；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中没有436bp条带的待测小麦为候选的非Pina-Dlr缺 失型小麦；所述非Pina-Dlr缺失型小麦的基因组DNA中的Ha位点具有序列表的序列3所 示核苷酸的小麦。
5.根据权利要求4所述的非Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定方法，其特征在于，所述非 Pina-Dlr缺失型小麦为中国春或豫农202。
6.一种辅助筛选硬麦的方法，包括如下步骤1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为 序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有436bp条带的待测小麦为候选的硬麦。
7.根据权利要求6所述的辅助筛选硬麦的方法，其特征在于，所述硬麦为普通小麦中 PINA蛋白缺失类型中的Pina-Dlr类型。
8.权利要求1所述特异性引物对在制备Pina-Dlr缺失型小麦鉴定试剂盒、非 Pina-Dlr缺失型小麦鉴定试剂盒或硬麦辅助筛选试剂盒上的应用。
9.一种Pina-Dlr缺失型小麦或非Pina-Dlr缺失型小麦的鉴定试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒含有权利要求1所述特异性引物对。
全文摘要
本发明涉及Pina-D1r缺失型小麦的鉴定方法及其特异性引物与应用。鉴定Pina-D1r缺失型小麦的特异性引物对5’-TCAACATTCGTGCATCATCA-3’和5’-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3’；以待测小麦的基因组DNA为模板，用该引物对进行PCR扩增，检测出扩增产物中有436bp条带的为候选Pina-D1r缺失型小麦，反之则不是。上述引物对可应用于辅助筛选硬麦、制备Pina-D1r缺失型小麦鉴定试剂盒等方面。该引物对可直接在分子水平上进行Pina-D1r类型的检测，能大大加快籽粒硬度基因型的筛选效率和准确度，对小麦籽粒硬度的基因工程改良及优良品种的培育起到重要作用。
文档编号C12Q1/68GK101921839SQ20101020862
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者崔党群, 张福彦, 董中东, 陈锋 申请人:河南农业大学