专利名称：用于检测gi癌转移的方法
技术领域：
本发明总体上涉及一种用于检测在一个从病人身上得到的样品中的一种生物标记靶标的方法。具体地，本发明提供了一种检测在其中通常不表达GCC的人类组织中或生物流体中的鸟苷酸环化酶C(GCC或⑶CY2C)表达细胞的存在的方法。更具体地，本发明提供了一种用于检测在从病人身上得到的淋巴结、血液或另一种组织样品中的转移性癌细胞存在的方法，这些转移性癌细胞源于胃肠(GI)道的癌性损害，特别是结肠直肠癌型。本发明还涉及用于GCC mRNA的定量的RT-qPCR方法的使用，用于癌症病人的分期或者用来预测结肠直肠癌病人会在治愈性手术(curative surgery)之后复发的可能性。
背景技术：
以下对本发明背景的讨论只是供帮助读者理解本发明。尽管在对此疾病的了解和治疗方面已经发生了显著的变化，但在发达国家结肠直肠癌(CRC)仍是第二大最常见的死亡原因。尽管如此，大多数早期结肠直肠癌的治疗方案是无效的并且目前的治疗模式(treatment paradigm)是不清楚的。CRC是许多在分期与结果之间存在一个紧密联系的疾病之一。一旦病人被诊断为CRC，复发的可能性与肿瘤通过肠壁渗透的程度以及淋巴结累及的存在或缺乏有关。这些特征是由美国癌症联合委员会 (AJCC)规定的CRC分期系统的基础。病理学家、肿瘤学家和外科医生对检测在淋巴结中的转移显示了很大的兴趣，因为在许多实体瘤中淋巴结累及是一个很强的预后因子。虽然组织病理学(HP)依然是CRC分期的主体(mainstay)，但是在来自其他的细胞类型的单个肿瘤细胞或甚至小的肿瘤细胞团存在的情况下，淋巴结(LN)检查可能是困难的。目前鉴定CRC 在淋巴结中转移存在的方法是对用苏木精和曙红(H和E)染色的组织切片进行组织病理学检查。此项技术局限于这样的事实即，通常对每个LN只有小比例的(典型地一个或两个 4-5微米的组织切片)就CRC转移的存在进行了评定，留下了每个淋巴结的大部分体积(典型地>99%)未经检查。其结果是，对通过HP检查被认为没有淋巴结转移的CRC病人的预测结果仍然是有挑战性的，因为这些病人的大约20%将出现疾病复发。对于揭示更好的鉴定胃肠道转移性癌细胞的存在的技术显然存在着需要。为了改善CRC病人的手术后结果，已经证明鸟苷酸环化酶C(又称⑶CY2C，更常见地GCC，又称ST受体)和它的可替代的转录物(CRCA-I)两者都是转移性结肠直肠癌细胞在肠外/结肠直肠组织或体液中的存在的良好指示物。GCC基因的转录产物由肠上皮细胞唯一地表达并且是转录因子⑶X2的内源性下游靶标。在贯穿结肠直肠组织中的从腺瘤到癌的转变过程中，GCC的表达被保持。更近一些，已经披露了基于鸟苷酸环化酶C或基于CRCA-I的用于原发性和/或转移性胃癌或食道癌的筛选和诊断方法。具体地参见US 5, 601, 990 ；US 5, 731, 159 ；US 5, 928, 873 ；US 6, 060, 037 ；US 6, 120, 995 ；US 6，602，659 ；US 6，767，704 ；US 7，135，333 ；US 7，316，902 以及 US 7，402，401。临床研究已经证明，通过逆转录和实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测GCC 对于在淋巴结(LN)中的转移性癌症细胞的存在是指示性的，这些淋巴结在患有结肠直肠癌(CRC)的病人中在组织病理学上是阴性的。这些研究包括fikhulz描述的一例(Clin Cancer Res. 2006Aug 1 ；12(15) :4545-52)以及最近由 Waldman 公布的一例(JAMA，2009; 301 (7) :745-752),都是基于在部分(例如大约一半)的淋巴结的冰冻样品中的GCC生物标记(“靶标”)的检测。在癌症的诊断、分期和监测中使用GCC以及其它靶标需要开发有效的和高效率的系统、工艺和方法，这些系统、工艺和方法利用新鲜的或存档的(archived)组织样品。目前，大多数的病理学样品依照标准档案法保存在固定的石蜡包埋的(FPE)组织块中，该方法允许组织的形态在环境温度下保持多年。为了使一个使用GCC作为生物标记靶标的试验对临床管理具有有影响，这样的试验需要与FPE组织保存相一致。然而，这样的样品再现了一个主要的技术性问题，因为固定过程为人们所知的是，随着时间的过去通过蛋白质交联或氧化引起了核酸的降解(由于单甲基基团添加到核酸的碱基上)。因此，用于检测转移性癌细胞的方法必须迁移到更强的临床平台上，如使得逆转录和实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)能够进行的那些。在RT-qPCR中，发生在FPE临床样品中的RNA降解和化学修饰可以影响靶标检测的准确度。本申请人以前已经开发了一种用于结肠直肠癌分期的临床试验，该试验利用了 RT-qPCR能检测非常小的GCC mRNA片段的能力以适应带有降解的RNA的样品。GCC双重测定，使用Scorpions 技术来监测qPCR反应，用β-肌动蛋白(β -肌动蛋白或ACTB)作为内部对照RNA，通过考虑逆转录酶和PCR反应的效率并且监测逆转录酶和PCR抑制剂的存在而避免了大多数的时常发生的与绝对定量有关的问题。然而，在双重测定中，ACTB由于其高丰度而需要调节以防止与GCC竞争。因此，使用ACTB作为一个参考基因来检测RNA降解或 RNA输入目前是限制性的，因为该测定对变化(例如时间依赖性降解和苛刻的固定条件)不灵敏。在此背景下，只有高度降解的样品和/或高度抑制的样品和/或具有极低RNA浓度的样品引起ACTB Ct值低于一个确立的检测限(L0D)。因为GCC比ACTB更受到所有这些应激条件的影响，当前的绝对定量需要所有样品没有任何抑制剂，具有相似的降解状态和RNA 输入，因而降低测定的灵敏度和准确度。因此，对于用于检测一种靶标(例如在一个从病人得到的样品中的GCC)的敏感的和/或准确的和/或可重复的和/或有成本效益的方法和系统存在着一种需要。不幸的是，只是测量一个或更多个预测性RNA转录物(prognostic RNA transcript)的转录物水平并没有考虑产生一个有足够灵敏度和特异性的诊断试验以确定一个与分子标记相关的临床结果。必须处理从实时PCR得到的原始数据以获得目标mRNA 的相对量。在每个实验中绝对定量需要一个标准曲线以便通过内插法(interpolation) 确定在一个给定的样品中的mRNA拷贝的数量(相对于已知量的合成DNA或RNA转录物)。 通过表达这种相对于一个内源参考基因(RG ；有时被称为管家基因)(用作一个内部对照 RNA)的水平的变化，可以用相对定量(ACt(ACt))来确定跨越样品的一个靶基因(即， GCC)的mRNA水平的变化。一个这样的熟知的并且经常使用的参考基因是ACTB。可替代地，一个目标样品的平均ACt(ACt)值与相应的对照样品的平均A-Ct(ACt)之间的差异(Δ - Δ Ct ( Δ Δ Ct))被用来计算表达水平变化值(expression fold change value)。在临床样品中的稳定内源参考基因的评估对于使用RT-qPCR平台或其他相关的扩增方法的相对基因表达的精确且准确的标准化是一个先决条件。使用一个单一的所谓的 “通用的”参考基因可能导致GCC基因表达的曲解。对于与GCC —起用于检测在一个病人样品中的CRC细胞的参考基因的鉴定也存在着一种需要，这个参考基因具有一种不受淋巴结中的癌细胞的存在的影响的表达、以及一种类似于在样品中由于长的保存期、差的储存条件或者其它应激因子而降解的GCC的行为。已经研究并发现许多这样的参考基因在不同背景下是有用的。然而，目前存在的一种舆论是，一种优化的、通用的参考基因所并不存在(Green et al. 2009, Diagn Mol Pathol 18(4),243-249以及其中的参考文献11)。
发明概述现在已经发现β-葡萄糖醛酸酶(⑶SB)作为一种用于归一化PCR数据的参考基因是特别有用的。在评估GCC用于GI道癌诊断和/或预测的特定背景下，GUSB提供了未预见的优点，如允许人们测量比用其他参考基因所能够得到的低得多的检测限(LOD)。本发明提供了一种用于检测在一个样品中的癌细胞或GCC表达细胞的方法，这种方法检测和/或测量/量化了来自处理的所采集的组织或生物流体的GCC，与同一样品中的一个或多个参考基因的检测和/或量化进行组合。GUSB(i3-葡萄糖醛酸酶)被发现是一种优越的参考基因。具体地，在检测在淋巴结中的CRC细胞方面，发现GUSB是一种有待用于补充GCC的优越的参考基因。设计了 RT和PCR反应以获得一个有效的双重试验同时扩增了 GCC和⑶SB mRNA。证实了这个试验的分析性能，与GCC/ACTB试验相比显示出更好的强度。 当用诊断患有II期CRC的一群病人进行试验时，这些较好的GCC/GUSB试验的分析特征(更高的信息率、更高的分析灵敏度以及相对量化)可以导致复发风险(RR)的更准确的层次化。本发明还提供了一种用于检测从病人中收集的样品中的GCC的诊断方法，包括以下步骤检测样品中的GCC;检测(同时地或顺序地)同一样品中的β-葡萄糖醛酸酶 (⑶SB)，并且建立GCC对⑶SB的相对定量，其中在一个固定阈值以上的GCC对⑶SB的存在指示了该样品中GCC阳性细胞的存在。根据一个普通方面，在此提供了一种测量从病人中收集的一个样品中的GCC的方法，包括以下步骤通过RT-qPCR测量样品中的GCC以确立一个Cterc ；通过RT-qPCR测量同一样品中的⑶SB以确立一个CteusB ；并且确立CteusB减去Ctra的相对定量(Δ-Ct)，其中高于大约-12的Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在。本发明还提供了一种用于检测GCC的诊断方法，通过表达相对于⑶SB的RNA水平的变化，该方法使用表达水平变化(expression fold change) ( Δ - Δ-Ct)来确定跨越样品的在GCC的mRNA水平方面的变化。根据本发明的另一个方面，在此提供了一种对于一位已经诊断患有GI道癌的病人进行分期或监测的方法，包括以下步骤检测样品(包括在其中通常不表达GCC的人类组织或生物流体，如特别是结肠直肠外/肠外组织)中的GCC ；检测同一样品中的GUSB ；并且建立CteusB_Ctra的相对定量(Δ -Ct)，其中大于-12的一个Δ -Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，其中GCC阳性细胞的存在表明转移的结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌或食道癌。
根据本发明的另一个方面，在此提供了一种诊断被怀疑患有原发性胃癌、食道癌或胰腺癌的病人的方法，包括以下步骤检测在结肠直肠外/肠外样品中的GCC ；检测同一样品中的⑶SB ；并且建立CteusB-Ctra的相对定量(Δ-Ct)，其中大于-12的一个Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，其中GCC阳性细胞的存在表明原发性胃癌、食道癌或胰腺癌。本发明的方法允许检测在一种胃、小肠、食道、胰腺或结肠直肠的切除术之后所采集的淋巴结中的GCC的存在或缺乏，由此允许一种癌的分子分期。根据本发明的另一个方面，在此提供了一种包括以上所述的步骤的方法，用来在具有组织病理学阴性淋巴结以及组织病理学阳性淋巴结的癌症病人之间进行区分。根据这种方法，在一个或一些他们的淋巴结中具有GCC阳性细胞的癌症病人具有复发风险以及与那些经由组织病理学被认为具有较高风险的病人可比的存活率，由此表明这些病人可能受益于具有辅助化疗的治疗。根据这种方法，具有所有LN就GCC而言阴性的癌症病人处于较低的疾病复发风险并且将不需要辅助化疗，因此避免了这些治疗的消极副作用。本发明的方法检测了来自之前被诊断患有癌症的病人的血液中GCC的存在以预测复发的风险、监测癌症的复发以及对癌症治疗的反应。根据本发明的另一个方面，在此提供了一种包括以上所述的步骤的预测患有癌症的病人的方法，其中GCC阳性细胞的存在表明预后不良。根据本发明的另一个方面，在此提供了一种确定一位已经被诊断患有GI道癌的病人是否受益于治疗的方法，包括以下步骤测量从病人中收集的肠外/结肠直肠外的样品中的GCC的表达水平；测量相同的肠外/结肠直肠外样品中的⑶SB的表达水平；并且确定肠外/结肠直肠外样品中的相对于GUSB的量的GCC的量；其中当与GUSB相比时如果肠外/结肠直肠外样品中的GCC的量高于一个给定的水平，则该病人将受益于这种治疗。具体地，本发明提供了一种确定从已经被诊断患有GI道癌的病人收集的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的量的方法，包括以下步骤测量该样品中的GCC mRNA的表达水平； 测量同一样品中的⑶SB mRNA的表达水平；并且使用一种数学计算将GCC mRNA的表达水平归一化到⑶SB mRNA的表达水平以进一步确立一个相对GCC表达(⑶SB水平-GCC水平)； 其中如果该相对GCC表达高于一种外标准的检测限，则计算出样品中的GCC的绝对量并且以GCC拷贝的数量进行表示。具体地，本发明提供了一种预测在已经被诊断患有GI道癌的病人中的癌症复发可能性的方法，包括以下步骤确定从病人中收集的一个或多个淋巴结中的如以上所定义的GCC的量；将一个或多个淋巴结的每一个分类为GCC阴性或GCC阳性；并且确立一个淋巴结比率，其中淋巴结比率是GCC-阳性淋巴结的数目与GCC阴性淋巴结和GCC阳性淋巴结的总数的比值；由此淋巴结比率越大，表明癌症复发的可能性越大。具体地，本发明提供了一种预测在已经被诊断患有GI道癌的病人中的癌症复发可能性的方法，包括以下步骤测量从病人中收集的一个或多个淋巴结中的GCC的表达水平；测量相同的一个或多个淋巴结中的GUSB的表达水平；并且确定每个单独的淋巴结中的相对于⑶SB的量的GCC的量；其中高于预确立的截断值的GCC的相对量表明一个淋巴结中GCC 的存在，其中如果GCC存在于一个或多个淋巴结中，则该病人具有增加的癌症复发可能性。具体地，预确立的截断水平是在大约-6与-3之间。更具体地，截断水平是选自下组，该组由以下各项组成-5. 9、-5. 5、-5. 0、-4. 5、-4. 0、-3. 5、以及-3. 0。
具体地，本发明提供了一种预测在已经被诊断患有GI道癌的病人中的癌症复发可能性的方法，包括以下步骤通过RT-qPCR来量化从病人中收集的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的RNA水平以确立GCC(Cteee)的循环阈值；通过RT-qPCR来量化同一样品中的 ⑶SB的RNA水平以确立对于⑶SB (CtGUSB)的循环阈值；并且计算CteusB减去Ctra ( Δ -Ct)的相对定量；其中等于或高于大约-6的一个Δ -Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，由此GCC 阳性细胞的存在表明病人具有增加的癌症复发风险。具体地，本发明提供了一种确定已经被诊断患有癌症的病人是否具有GCC淋巴结累及的方法，包括以下步骤测量从病人收集的淋巴结中的GCC的表达水平以确立 GCC(Ctccc)的一个循环阈值；测量从病人收集的相同淋巴结中的GUSB的表达水平以确立对于⑶SB (CtGUSB)的一个循环阈值；然后确定一个Ct⑶SB减去CtGCC的相对定量(Δ -Ct)；其中如果该Δ-Ct等于或高于大约_6，则该淋巴结是GCC阳性的。具体地，本发明提供了一种确定已经被诊断患有癌症的病人的GCC负荷的方法， 包括以下步骤测量从病人收集的肠外/结肠直肠外样品中的GCC mRNA的表达水平以确立GCC(Cterc)的一个循环阈值；测量从病人收集的相同的肠外/结肠直肠外样品中的GUSB 的表达水平以确立对于⑶SB(CteusB)的一个循环阈值；并且计算Ct⑶SB减去CtGCC的相对定量(Δ-Ct)；其中如果Δ-Ct等于或高于大约-12，则以拷贝数量的方式可以计算出GCC mRNA的量，由此以样品中GCC拷贝的数量表示GCC负荷。具体地，本发明提供了对已经被诊断患有结肠直肠癌的病人进行分期或监测的方法，包括以下步骤获得从病人中取得的肠外/结肠直肠外样品；测量样品中的GCC以确立 GCC(Ctccc)的循环阈值；测量同一样品中的⑶SB以确立对于⑶SB(CteusB)的循环阈值；并且确立(Δ-Ct)的CteusB减去Cteee的相对定量，其中大于大约-6的一个Δ-Ct表明样品中 GCC阳性细胞的存在，其中GCC阳性细胞的存在表明转移的结肠直肠癌。根据本发明的另一个方面，在隐藏不明起源(CUP)的转移的组织中检测到GCC阳性细胞的存在，证明其原发癌是结肠直肠癌、胃癌、肠癌、胰腺癌或食道癌。在本发明的又另一个方面，用于本发明的方法中的材料适合用于制备一种试剂盒。根据本发明的另一个方面，在此提供了用于对病人中的一种癌症进行检测、诊断、预测和/或分期的试剂盒，其中该试剂盒包括用于检测样品中的GCC的PCR试剂、用于检测在同一样品中的⑶SB的PCR试剂、以及对怎样计算在GCC与⑶SB之间的(Δ-Ct)或 (Δ-Δ-Ct)的说明书。本发明还提供了包括试剂的试剂盒，它可以包括基因特异性探针和/或引物，用于量化所披露的用于预测出现疾病复发可能性的基因的表达。此类试剂盒可以任选地包含用于从一种样品(特别是固定的石蜡包埋的组织样品)中提取RNA的试剂和/或用于RNA 扩增的试剂。
发明详细说明
附图简要说明所结合的并且构成本说明书的一部分的这些附图展示了本发明的不同实施方案， 并且与说明书一起用于解释本发明的原理。在这些图中
图1表示推定的参考基因的表达水平，表示为配对的新鲜冷冻的(FF)和FFPE结肠癌LN中的平均Ct值；图2表示推定的参考基因的表达水平，表示为GCC阴性和阳性FFPE LN中的平均 Ct值。定向的Ct范围通过两条虚线来分隔；图3表示对照基因的平均表达稳定性值；图4表示用于归一化的对照基因的最佳数目的确定；图5表示在GCC阳性和阴性LN中的所选择的参考基因的表达谱。在具有312. 5ng 的cDNA的单反应中测试的在FFPE样品中的GCC、⑶SB、HPRTl、PGKl以及TBP的Ct值。在负RT (minus RT)实验中，在cDNA合成步骤过程中不加入RT酶；图6表示NaOH处理对RNA质量的影响以及基因表达措施。使用Agilent 2100生物分析仪，通过毛细管电泳测定了在NaOH处理后的RNA降解的程度。组A)显示了与从新鲜冷冻的结肠组织以及配对的FFPE材料中分离的完整的RNA相比的代表性RNA断裂谱。B)在水解的每个时间点测定了对于GCC和5个参考基因测定(包括ACTB Scorpions )的Ct值；图7表示使用用于归一化的五个参考基因(⑶SB、HPRTl、PGKl、TBP以及ACTB)的在NaOH降解过程中的GCC表达变化(Δ-Δ-Ct)。在水解的每个时间点测定了在Δ Ct值 (Δ-Δ-Ct = [(CtGCC-CtEG)tx-(CtGCC-CtEG)t0])方面的变化。误差条线表示来自3个独立的 RNA集合体的SD。为了在这三个实验之间进行比较，对每个基因的阈值手动固定到0. 10 ；图8表示碳酸盐缓冲液碱处理对RNA质量以及基因表达谱的影响。使用 Agilent2100生物分析仪，通过毛细管电泳测量了在指示的时间点处分离的RNA的质量。A) 与从新鲜冷冻的结肠组织中分离的完整的RNA相比的代表性RNA断裂谱。B)RNA样品的电泳图谱。每个时间点包含了等量的材料。C)对于GCC和5个参考基因测定的Ct值，包括 GCC/ACTB双重测定；图9表示在碳酸盐缓冲液碱性条件下在控制RNA降解之后的GCC表达变化(Δ-Δ-Ct)。在水解的每个时间点测定了在ACt值(Δ-Δ-Ct = [ (CtGCC-CtEG) tx-(ctGCC-ctEG)t0])方面的变化；图10表示使用TaqMan单测定和GCC/ACTB双重体测定的在冷冻的并且固定的、石蜡包埋的(FPE)组织中的基因表达谱。使用Agilent 2100生物分析仪，通过毛细管电泳测量了从每个条件分离的RNA的质量(条件A和E是TRIzol 萃取物，B 中性缓冲的福尔马林10%，C 非缓冲的福尔马林10% ；D 鲍音液(Bouin' s solution))。将TaqMan单反应中的GCC和4个参考基因(⑶SB、HPRTl、PGKl以及TBP)的表达(Ct值)与GCC/ACTB双重测定进行比较；图11显示了在固定或没有固定的结肠癌组织样品的低温切片中的GCC表达水平(Δ-Ct)的比较。对于每种RNA提取物测定了在Δ-Ct值(Δ-Ct = (CtGCC-CtEG))方面的变化。根据制造商的建议，用 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen)进行了逆转录反应，使用基因特异性引物QyM)以及基于Quant-IT数据的 500ng 的总 RNA。在 20-μ 1 的反应体积中用 Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统使用TaqMan单测定或GCC/ACTB双重测定进行了实时PCR。对于每个单测定的引物和探针浓度分别是900nM和250nM。所有反应都一式两份来进行；图12表示从一种FFPE结肠组织中提取出的RNA中的GCC Taqman单扩增与双重扩增的比较。上组显示了使用基因特异性反向引物在2μ M和1. 25μ g的RNA下在单和双重反应中测试的FFPE样品中的GCC和不同的RG PCR扩增。下组显示了在单和双重反应中对于GCC和不同的参考基因的负RT-PCR扩增的比较；图13显示了在双重反应与单反应之间的GCC和⑶SB Ct值的比较。使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统在20 μ 1的双重反应或单反应中进行了实时PCR。用250ι^/μ1(Α)或25ng/μ 1 (B)的 uRNA(用1X106GCC IVT加标(spiked)或未加标)进行了 cDNA的合成。对于单一的实时 PCR反应，引物浓度是900nM并且FAM或VIC-标记的探针浓度是250nM。对于双重反应，测试了 4个浓度的反向引物和正向引物，同时FAM和VIC-标记的探针两者在20 μ 1的PCR反应中固定在200ηΜ。图14表示在NaOH降解过程中在双重测定和单测定中的GCC和RG Δ -Ct变化。用 ⑶SB或HPRTl来归一化GCC的表达。在NaOH水解过程中的每个指定时间点测定了在GCC 相对量(Δ-Δ-Ct = [(Ctccc-Ct丄x-(CtGCC-CtKG) J)方面的变化。在非降解的与降解的样品之间的变化应该是低于1 Δ-Ct (被考虑为不是显著的)；图15表示用I1aqMan和Scorpions 双重测定的在负RT条件下测试的FFPE结肠癌LN的比较。组A和C显示了在双重反应中对于用312. 5ng的cDNA测试的在8个FFPE 样品中的ACTB、⑶SB、HPRTl以及GCC的Ct值。在负RT实验(B和D)中，在cDNA合成步骤过程中不加入RT酶；图16显示了固定或没有固定的结肠癌组织样品的低温切片中的GCC表达水平 (Δ -Ct)的比较。使用⑶SB (Α和B)或HPRTl (C和D)测定了对于每个RNA提取物的Δ Ct 值ACt= (Ctra-Ctlie)。在单测定中使用在2 μ M下的基因特异性引物并且在双重测定中用指示的引物浓度进行了逆转录反应。在20 μ 1反应体积中用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统使用TaqMan 单测定或双重测定进行了实时PCR，与korpions 双重反应进行比较。所有反应都是一式三份地进行。在冷冻且固定的样品之间的小于 ΙΔ-Ct的变化被认为是不显著的；图17表示在从具有不同的存档时间(从1个月到22年)的55FPE个结肠周淋巴结组织提取的RNA中的参考基因的扩增。A)从存档的FPE组织提取的RNA的毛细管电泳谱。 使用Agilent 2100生物分析仪和RNA Nano Chips来分析1 μ 1的每种RNA提取物(150ng/ μ L)。B)对于FPE结肠淋巴结组织中的ACTB和⑶SB的Ct值。使用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR 系统禾口 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 在 20μ1 的单反应中进行了实时PCR ；图18显示了在具有不同的存档时间的多个块的组中观察到的ACTB和⑶SBCt 值的比较。在FPE结肠淋巴结组织中的ACTB (A)和⑶SB (B)mRNA表达(Ct值)的 Box-和-Whisker标绘图。对于多重比较，使用了单向ANOVA和后hoc Turkey试验并且P < 0. 05被认为是统计学上显著的；图19表示在用TaqMan GCC/⑶SB测定来测试的在组织病理学阴性的且GCC/ ACTB 阴性的(pNO (mol-))且 III 期 GCC/ACTB 阳性的(pNl-2 (mol+)) LN 中的 GCC 相对表达水平。使用了 A-Ct(Ctara-Ctra)的相对定量的接受者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)分析被用来确定对于GCC/⑶SB双重测定的截断值；
图20表示用TaqMan GCC/⑶SB双重测定评估的GCC相对表达水平。在结肠癌I、II和III期组织病理学阴性(HP-)且III期阳性(HP+)的LN中的GCC相对表达 Δ Ct (CtGUSB-CtGCC)。GCC mRNA阳性状态是基于-5. 9的分析截断值；图21显示了在使用geNorm的血液样品中的对照基因的平均表达稳定性值；图22显示了用于使用geNorm进行归一化的参考基因的最佳数目的确定；图23表示在血液样品中的GCC表达水平。GCC mRNA阳性状态是基于75GCC单位 ML的分析截断值；图M显示了对于两个不同的病人同期组群的A)ACTB Ct值和B)葡萄糖醛酸酶 GUSB Ct值的分布。Wilcoxon秩和检验ρ值0. 0001 ；图25显示了对于GCC/ACTB和GCC/GUSB测定两者的HDQ和UMass同期组群(n = 73) ROC曲线分析的组合，采用任何给定的一个病例的LN的最高GCC拷贝数作为连续变量。 灵敏度定义为复发病例(36个月后)的检出率，同时特异性被定义为没有复发的阴性病例的比例；图沈展示了在具有GCC阳性试验结果的病人的复发风险与用来确定试验阳性的 GCC表达水平之间的关系；图27是基于GCC阳性的复发时间的Kaplan-Meier图解分析。A)具有100个拷贝截断的GCC/ACTB试验；B)具有100个拷贝截断的GCC/GUSB试验；C)具有25个拷贝截断的GCC/ACTB试验；D)具有25个拷贝的GCC/⑶SB试验。GCC阴性病例用直的黑线表示并且 GCC阳性病例用灰色虚线表示。失访的病人被删失(censored-out)并且用竖直标记表示；图28是基于GCC阳性的RFS的一个Kaplan-Meier图解分析，对于GCC/⑶SB试验具有-5. 9 Δ Ct用于截断。GCC阴性病例用直线表示并且GCC阳性病例用虚线表示。被删失的病例用竖直标记表示；图四是复发时间的Kaplan-Meier图解分析，对于GCC阳性病人具有2个分层水平。A)具有100个拷贝截断的GCC/ACTB试验；B)具有100个拷贝截断的GCC/GUSB试验； C)具有25个拷贝截断的GCC/ACTB试验；D)具有25个拷贝的CC/GUSB试验。对于每个组还指示了处于风险中的病人的数目；图30是复发时间的Kaplan-Meier图解分析，对于GCC阳性病人具有2个分层水平。A)GCC/⑶SB试验，具有-5.9(A-Ct用于切断用于截断。对于每个组还表示指示了处于风险中的患者病人的数目。B)在GCC/GUSB ( Δ -Ct = _5· 9)与GCC/ACTB (GCC拷贝=25) 之间的总复发率的比较；以及图31是复发时间的Kaplan-Meier图解分析，具有每位病人的GCC阳性LN的数目的分层。A)具有25个拷贝截断的GCC/ACTB试验；B)具有25个拷贝截断的GCC/GUSB试
验。对于每个组还指示了处于风险中的病人的数目。 _为了促进对本发明的理解，定义了以下的多个术语。以下所使用的术语“大约”是指所指示的数目的+或-5%的界限。为了精确起见， 术语“大约”当与例如整数10 一起使用时是指10+/-5%，即从9. 5到10. 5。如在此所使用的，术语“GCC”旨在是指基因转录产物(RNA)，它表达细胞蛋白鸟苷酸环化酶2C(GUCY2C还称为热稳定肠毒素受体或ST受体)，它是由正常的结肠直肠细胞、连同原发的以及转移的结肠直肠癌、肠癌、胃癌以及食道癌细胞表达的。在正常个体中，专有地在肠细胞中特别是十二指肠、小肠(空肠和回肠)、结肠(盲肠、升结肠、横结肠、降结肠以及乙状结肠)以及直肠细胞中发现了 GCC。术语“GCC”还包括一个GCC基因转录物的片段， 它们相对于具有全长序列的核酸分子是功能性的，如作为寡核苷酸或核酸探针、引物、反义寡核苷酸或核酸分子或一个编码序列有用的一个功能性片段。术语“GCC”还包括CRCA-I 替代的转录物。如在此所使用的，术语“结肠直肠癌”旨在包括公认的医学定义，定义了结肠直肠癌作为一种医学病症，其特征在于在低于小肠的肠道(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、 横结肠、降结肠、以及乙状结肠、以及直肠)中癌细胞的存在。此外，如在此所使用的，术语 “结肠直肠癌”旨在进一步包括其特征是在十二指肠和小肠中(空肠和回肠)中存在癌细胞的医学病症。如在此所使用的结肠直肠癌的定义比通常的医学定义是更宽泛的，但是如这样来提供是因为十二指肠和小肠的细胞也含有GCC。如在此所使用的，术语“GI道癌”或“胃肠癌”旨在包括其特征是在食道、胃、胰腺、 小肠连同结肠和直肠中存在癌细胞的医学病症。此外，如在此所使用的，术语“GI道癌”旨在进一步包括其特征是在胰腺中存在癌细胞的医学病症，胰腺像肝脏和胆囊一样是GI道的附属器官。如在此所使用的GI道癌的定义比通常的医学定义是更宽泛的，但是如这样来提供是因为已知胰腺癌细胞表达GCC。如在此所使用的，术语“上部GI道”包括口腔、唾液腺、咽、食道、膈、胃、胆囊、胆管、肝脏、以及十二指肠。如在此所使用的术语“上部GI道癌”特别是指食道、胃以及胰腺。如在此所使用的，术语“下部GI道”是指肠(bowel)或肠(intestine)以及直肠， 并且包括小肠，包括十二指肠、空肠、回肠；以及大肠或结肠，包括盲肠(以及阑尾)；结肠 (升、横以及降)以及直肠(肛门)。如在此所使用的，术语“胃癌”旨在包括公认的医学定义，它将胃癌定义为一种其特征是在胃内存在癌细胞的医学病症。如在此所使用的，术语“食道癌”旨在包括公认的医学定义，它定义了食道癌是一种其特征是在食道内存在癌细胞的医学病症。如在此所使用的，术语“胰腺癌”旨在包括公认的医学定义，它定义了胰腺癌是一种其特征是在胰腺内存在癌细胞的医学病症。如在此所使用的，术语“转移”是指其中起源于一个器官或身体的一部分的癌细胞在有或无体液的运输下迁移到身体的另一个部分并且继续重复的过程。转移的细胞可以随后形成可以进一步转移的肿瘤。转移因此称为癌症的扩散，从它最初发生的身体的部分扩散到身体的其他部分。如在此所使用的，术语“转移的结肠直肠癌细胞”旨在是指已经转移的结肠直肠癌细胞。转移的结肠直肠癌细胞被局限于除十二指肠、小肠(空肠和回肠)、大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、以及乙状结肠、以及直肠以外的身体或体液的一部分。如在此所使用的，术语“转移的胃癌细胞”旨在是指已经转移的胃癌细胞。转移的胃癌细胞被局限于除胃之外的身体的一部分。如在此所使用的，术语“转移的食道癌细胞”旨在是指已经转移的食道癌细胞。转移的食道癌细胞被局限于除食道之外的身体的一部分。如在此所使用的，术语“转移的胰腺癌细胞”旨在是指已经转移的胰腺癌细胞。转移的胰腺癌细胞被局限于除胰腺之外的身体的一部分。如在此所使用的，术语“非肠的/非直肠的”以及“肠外/结肠直肠外”在此是可互换地使用的并且旨在是指来自除了肠(小肠和结肠)和直肠组织之外的来源的组织或体液样品。在一些优选的实施方案中，肠外/结肠直肠外样品是如淋巴结的组织的一种样品。 在一些优选的实施方案中，非肠的/非直肠的样品是未证实起源的腺癌的肠外/结肠直肠外组织的一种样品。在一些优选的实施方案中，非肠的/非直肠的组织是一种可疑的胃癌、 胰腺癌或食道癌的一种活组织检查组织。在一些优选的实施方案中，非肠的/非直肠的样品是一种血液样品。如在此所使用的，“遭受一种未证实起源的腺癌的个体”或“原发起源不明的癌症”(cancer of unknown primary origin,CUP)旨在是指具有其中起源尚未确定地鉴定的一种肿瘤的个体。如在此所使用的，术语“受试者”和“病人”是指任何动物，如哺乳动物类家畜、宠物、并且优选人类。“受试者”和“病人”的具体例子包括但不局限于需要医学辅助的个体， 并且特别是患有癌症的病人。如在此所使用的，术语“靶标”或“靶标记”或“生物标记靶标”是指可以从真核细胞得到的任何分子。靶标包括但不局限于蛋白质或核酸分子。在本发明中，测量了在胃肠起源的细胞中特定地表达的信使RNA的水平。可替代地，一种组织特异性蛋白或DNA改变 (例如甲基化或突变)可以是一种等效靶。在本发明的优选的实施方案中，单独地检测了单一的靶标(如mRNA)。在本发明的替代的实施方案中，组合地检测了多个靶标。如在此所使用的，术语“参考基因”或“参考标记”或“参考靶标”或“对照”或“对照标记”或“对照靶标”是指一种参考分子，该分子控制了和/或可以用于控制潜在的过程干扰因子和/或提供了关于样品质量、有效样品制备和/或在样品中的RT-PCR反应的组装的一个或多个指标。一个对照可以是与靶标共同检测的或分开检测的。如在此所使用的，术语“样品”是指一种生物材料，该材料含有从病人中取得的细胞或其他材料。样品材料包括但不局限于组织如淋巴结组织；活组织检查材料；呼出的气体；或体液如血液(包括血清或血浆)；尿液；精液；痰；唾液；以及这些的组合。为了实行本发明的这些方法，将样品进行处理(例如将一个淋巴结从其他组织中分离出来和/或切成多个切片或核心、暴露或不暴露于一个化学反应、经历一个分离过程、或将血液在肿瘤循环细胞方面进行富集)。每个过程可以导致一部分的样品保留，在下文中称为“保留样品” 或简单地“样品”。样品的部分可以随机地或根据预定的方案或数学公式决定来定大小。样品可以定义为一个单个的组织样品，如一个单个的淋巴结，或样品可以定义为多个样品，如多个淋巴结或淋巴结链(lymph node chain)。在本发明的优选的实施方案中，单独地处理了单个的样品如单个的淋巴结。在本发明的替代的实施方案中，多个样品被“集合”或一起处理。在另一个优选的实施方案中，该样品包括至少一个整个的淋巴结。如在此所使用的术语“外标准”是指一种以已知量或浓度存在的合成DNA或RNA 转录物，该转录物与试验样品是分开测试的(但是在相同的条件下)，从而允许定性鉴定和 /或定量，即通过内插或外推到一个标准曲线上。
如在此所使用的术语“参数”，也称为“过程参数”，包括在本发明的方法和系统中使用的用来检测一个或多个靶标的一个或多个变量。参数包括但不限于引物类型；探针类型；扩增子类型；物质浓度；物质的质量或重量；过程时间；过程温度；循环阈值(Ct)；过程中的活性，这些过程如离心、旋转、振荡、切割、研磨、液化、沉淀、溶解、电修饰、化学修饰、 机械修饰、加热、冷却、保存(例如持续数天、数周、数月、以及甚至数年)并且保持在一个静止(未搅动)的状态下。参数可以进一步包括在本发明的方法中使用的一个或多个数学公式中的一个变量。参数可以包括一个阈值，该阈值用来确定本发明的方法的一个后续步骤中的一个或多个参数的值。在一个优选实施方案中，该阈值是一个循环计数阈值。如在此所使用的，术语“循环阈值”(Ct)是指在qPCR中的阈值，于此在一个反应中产生的荧光远远超过了一个确立的阈值或截断水平。循环阈值是指相同的值，除了由于产品的差异由实时PCR仪器的竞争制造商使用的术语“交叉点” (Cp)和“分支点” (TOP)以外。 为了标准化目的，MIQE 指南(Bustin etal.，Clinical Chemistry,55 :4，pp. 611-622(2009)) 提出了术语“定量循环”(Cq)的使用是优选的(胜过所有其他的替代物)。术语“杂交”应理解为一种寡核苷酸沿着样品DNA的沃森-克里克碱基配对线结合到一种互补序列上，形成一个双链结构。如在此定义的“严谨杂交条件”涉及在68°C下在5X SSC/5X Denhardt溶液/1. 0% SDS中杂交，并且在0. 2X SSC/0. 1 % SDS中在室温下进行洗涤，或涉及本领域公认的它的等效条件(例如，其中在60°C在2.5X SSC缓冲液中进行杂交、随后在低缓冲液浓度下在37°C 进行若干洗涤步骤，并且保持稳定)。如在此所定义的中度严谨条件涉及包括在42°C在3X SSC中进行洗涤，或它的本领域公认的等效条件。盐浓度和温度参数可以是不同的以实现探针与靶核酸之间的一致性的最佳水平。关于此类条件的指导在本领域中是可得的，例如 Μ Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,N. Y.；以及Ausubel et al. (eds. ), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons，N.Y.)at Unit 2. 10。如在此所使用的，表述“临床评估”旨在包括用于筛选、诊断、分期、预测、治疗计划、监测、并且监视癌症病人的一个潜在范围或连续的或离散的值。如在此所使用的，表述“临床结果”或“结果”旨在以不同的终点进行表述，如无病生存率(DFS)、无复发生存率(Rre)、复发时间(TR)、癌症特异性存活率(CSQ或总存活率 (OS)，根据 Punt CJ et al. , J. Natl. Cancer Inst. (2007)99(13) :998-1003 的建议。如在此所使用的，“复发时间”(TR)被定义为到与相同癌症有关的任何事件的时间。来自相同癌症的所有相同的癌症的复发和死亡是事件。忽略第二原发的相同癌症以及其他的原发癌。来自其他癌症的死亡、非癌症相关性死亡、治疗相关性死亡、以及失访是设限观察值(censored observation)。如在此所使用的，表述“无复发存活率”(Relapse-Free Survival)或“无复发存活率”(Recurrence-Free Survival, RFS)被定义为到任何事件的时间，不论这个事件的起因(除了任何第二原发癌之外)。事件是来自相同癌症的复发或死亡以及所有治疗相关的死亡或来自其他原因的死亡。忽略来自相同癌症以及其他原发癌的第二原发癌，并且删失了失访。如在此所使用的，“癌症特异性存活率”(CSQ被定义为到由相同癌症引起的死亡的时间，不论死亡是由原发肿瘤还是由第二原发相同癌症引起的。忽略局部复发、远端转移、第二原发相同癌症、以及第二其他原发癌。删失了来自其他癌症的死亡、非癌症相关性死亡、治疗相关性死亡、以及失访。如在此所使用的，表述“无病生存率”(DFS)被定义为到任何事件的时间，不论这个事件的原因。包括了所有的事件，除了删失的失访以外。如在此所使用的，“总存活率”(OS)被定义为不论原因、死亡是否由于癌症引起的到死亡的时间。忽略了局部复发、远端转移、第二原发结肠直肠癌、以及第二其他原发癌。删失了失访。如在此所使用的，一种癌症的“分期”或“期”是指 Μ (肿瘤/淋巴结/转移)系统，来自美国癌症联合委员会(American_Joint Committee on Cancer) (AJCC) (Greene et al. (eds.), AJCC Cancer Staging Manual,6th edition, New York, NY :Springer ；2002), 它取决于局部侵袭的程度、淋巴结累及的程度以及是否存在远端转移。分期是在手术已经进行并且评述了病理报告后完成的。在TW系统中，“T”是指肠壁侵袭的程度，“N”是指淋巴结累及的程度，并且“M”是指转移的程度。更宽泛的癌症期通常被引证为源于根据预测进行分组的 Μ值的数I、II、III、IV ；较高的数表明较晚期的癌症并且可能更坏的结果。 对于结肠直肠癌的这个系统的细节如下
权利要求
1.一种用于检测在从受试者体内收集的样品中的GCC的方法，包括以下步骤 检测所述样品中的鸟苷酸环化酶C(GCC)； 检测同一个所述样品中的葡萄糖苷酸酶(⑶SB)；并且 计算相对于GUSB的量的GCC的量。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括以下步骤 测量所述样品中GCC mRNA的表达水平； 测量同一个所述样品中的⑶SB mRNA的表达水平；并且 使用一种数学计算将GCC mRNA的表达水平归一化到⑶SB的表达水平进行标准化以确立一个相对GCC表达(⑶SB水平减去GCC水平)或(GCC水平减去⑶SB水平)。
3.根据权利要求2所述的方法，包括以下步骤 通过RT-qPCR测量样品中GCC的表达水平以确定一个GCC的循环阈值(Ctra)； 通过RT-qPCR测量同一样品中的β -葡萄糖苷酸酶(⑶SB)以确定⑶SB的循环阈值 (CtGUSB)；并且其中GCC的检测使用相对定量(Δ -Ct)以确定样品中GCC的mRNA水平的变化，并且相对于β -葡萄糖醛酸酶(⑶SB)的mRNA水平将它表示为(Δ -Ct = CtGUSB减去Cterc)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中高于大约-12的Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在。
5.根据权利要求3所述的方法，其中使用表达水平变化(Δ-Δ-Ct)来确定所述样品中的GCC的mRNA水平的变化，并且相对于同一样品中的β -葡萄糖醛酸酶(GUSB) WmRNA 水平将它进行了表示。
6.如权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述样品是一种肠外/结肠直肠外样品并且所述受试者是人类。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述人类被怀疑患有选自下组的癌，该组由以下各项组成结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、食道癌以及胰腺癌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述肠外/结肠直肠外样品是选自下组，该组由以下各项组成活检组织、一个或多个淋巴结、以及血液。
9.一种诊断在被怀疑患有癌症的病人体内的癌症的方法，包括以下步骤根据权利要求1至5中任何一项对所述病人的肠外/结肠直肠外样品中的GCC进行定量；并且确定所述样品是否隐藏GCC阳性细胞；由此GCC阳性细胞的存在指示了结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、 食道癌或胰腺癌。
10.一种将已经被诊断患有癌症的人类病人进行分期的方法，包括以下步骤a)根据权利要求1至5中任何一项所述检测或测量GCC；以及b)基于步骤a的结果确立一种疾病分期。
11.根据权利要求10所述的方法，包括以下步骤 通过RT-qPCR测量所述样品中的GCC以确定来自所述病人的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的循环阈值(Ctecc)； 通过RT-qPCR测量所述样品中的β-葡萄糖苷酸酶(⑶SB)以确定所述样品中⑶SB 的循环阈值(CteusB)；并且 确立CtGUSB_CtGCC的相对定量(Δ -Ct)，其中高于大约-12的Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，其中GCC阳性细胞的存在表明转移的结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌或食道癌。
12.如权利要求11所述的方法，其中高于约-6的Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，由此GCC阳性细胞的存在表明该病人具有增加的癌症复发风险。
13.如权利要求11所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是至少一个淋巴结。
14.一种监测或诊断在已经被诊断患有癌症的人类中的转移的方法，包括以下步骤 通过RT-qPCR测量所述样品中的GCC以确定来自所述病人的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的循环阈值(Ctecc)； 通过RT-qPCR测量所述样品中的β-葡萄糖苷酸酶(⑶SB)以确定所述样品中⑶SB 的循环阈值(CteusB)；并且 确立CtGUSB_CtGCC的的相对定量(Δ -Ct)，其中高于大约-12的Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，其中GCC阳性细胞的存在表明转移的结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌或食道癌。
15.如权利要求14所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是血液。
16.一种用于选择在具有组织病理学阴性淋巴结的癌症病人中可以受益于一种治疗过程的那些的方法，包括 进行根据权利要求13所述的步骤；并且 进行一种治疗过程；由此在至少一个淋巴结中具有GCC阳性细胞的癌症病人具有复发的风险以及与经由组织病理学被认为具有较高风险的病人可比的存活率，由此表明了这些病人可能受益于辅助化疗治疗，并且由此具有GCC阴性淋巴结的癌症病人处于较低的疾病复发风险并且可以避免所述治疗。
17.如权利要求16所述的方法，其中GCC阳性细胞的存在表明预后不良。
18.根据权利要求1至5所述的方法，其中在隐藏不明起源(CUP)的转移的组织中检测到GCC阳性细胞的存在，证明其原发癌是结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌或食道癌。
19.根据权利要求2所述的方法，由此如果该相对GCC表达高于⑶SB的检测限，则计算出样品中的GCC的绝对量并且相对于一种外标准以GCC拷贝的数量进行表示。
20.一种用于对病人体内的癌症进行检测、诊断、预测、监测和/或分期的试剂盒，其中该试剂盒包括 用于检测来自病人的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的试剂； 用于检测同一个样品中的GUSB的试剂；以及 关于如何测量相对于⑶SB的GCC的说明书。
21.一种用于对病人体内的癌症进行检测、诊断、预测、监测和/或分期的试剂盒，其中该试剂盒包括 用于检测来自病人的肠外/结肠直肠外样品中的GCC的PCR试剂； 关于如何确定GCC的循环阈值(Ctra)的说明书； 用于检测同一个样品中的⑶SB的PCR试剂； 关于如何确定GUSB的循环阈值(CteusB)的说明书；以及 关于如何计算在Ctecc与CteusB之间的(Δ-Ct)或(Δ-Δ-Ct)的说明书。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述试剂包括选自下组的多核苷酸，该组由以下各项组成SEQ ID N0:17至43。
23.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述试剂包括与SEQID N0:17至43具有90%—致性的多核苷酸。
24.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述试剂包括选自下组的多核苷酸引物，该组由以下各项组成SEQ ID NO 17、18、20、21、23、对、26、27、29、30、32、33、35、36、38、 39,41 以及 42。
25.根据权利要求20、21或对所述的试剂盒，其中所述试剂包括选自下组的多核苷酸探针，该组由以下各项组成SEQ ID NO 19、22、25、28、31、34、37、40以及43。
26.根据权利要求M或25所述的试剂盒，其中这些引物包括SEQID NO 20、21、38以及39的多核苷酸，并且这些探针包括SEQ ID NO 22和40的多核苷酸。
27.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述检测或测量是用选自下组的多核苷酸来进行的，该组由以下各项组成SEQ ID NO 17至43。
28.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述检测或测量是用与SEQID NO 17至43具有90% —致性的多核苷酸来进行的。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述的GCC或GUSBmRNA的表达水平的检测或测量是使用选自下组的多核苷酸引物来进行的，该组由以下各项组成SEQ ID NO 17、18、 20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41 以及 42。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述的GCC或GUSBmRNA的表达水平的检测或测量是使用选自下组的多核苷酸探针来进行的，该组由以下各项组成SEQ ID NO 19、22、 25、28、31、34、37、40 以及 43。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述多核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成=SEQ ID NO 20、21、22、38、39 以及 40。
32.一种选自下组的多核苷酸，该组由以下各项组成SEQ ID NO 17至43。
33.根据权利要求32所述的多核苷酸，该多核苷酸与SEQID NO 17至43具有90%的一致性。
34.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中这些多核苷酸引物是选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID NO 17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41 以及42。
35.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中这些多核苷酸探针是选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID NO 19、22、25、28、31、34、37、40 以及 43。
36.根据权利要求32所述的多核苷酸，这些多核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成=SEQ ID NO 20、21、22、38、39 以及 40。
37.一种对已经被诊断患有癌症的病人预测癌症复发风险的方法，包括进行根据权利要求1至5中任一项所述的步骤，其中在-6与-3之间的Δ-Δ-Ct表明样品中GCC阳性细胞的存在，由此GCC阳性细胞的存在表明该病人具有增加的癌症复发风险。
38.如权利要求37所述的方法，其中该病人已经被诊断患有选自下组的一种癌症，该组由以下各项组成结肠直肠癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌以及食道癌。
39.如权利要求38所述的方法，其中该病人已经被诊断患有结肠直肠癌。
40.如权利要求39所述的方法，其中该病人患有I期或II期结肠直肠癌。
41.如权利要求37所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是一个淋巴结或血液。
42.如权利要求41所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是一个淋巴结。
43.如权利要求42所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是两个或更多个淋巴结。
44.如权利要求42所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是至少四个淋巴结。
45.如权利要求42所述的方法，其中该肠外/结肠直肠外样品是至少十二个淋巴结。
46.根据权利要求37所述的方法，其中一个等于或高于-6的Δ-Ct表示GCC阳性结果并且一个低于-6的Δ -Ct表示GCC阴性结果，由此所述结果允许辨别在GCC阴性与GCC 阳性结果之间的复发风险和无复发存活率(RFS)。
47.根据权利要求42或44所述的方法，其中当在同一个病人的1至3个淋巴结中发现阳性结果时，由此根据GCC/GUSB试验具有1至3个阳性LN的病人的相对复发风险是中等的。
48.根据权利要求42或44所述的方法，其中当在同一个病人的4或更多个淋巴结中发现阳性结果时，由此根据GCC/GUSB试验具有4个阳性LN或更多的病人的相对复发风险是高的。
49.如权利要求48所述的方法，其中对于每个单独的淋巴结计算了所检测的GCC的量。
50.如权利要求48所述的方法，其中GCC的量是在该病人的所有淋巴结中的GCC的单独量的总和。
51.根据权利要求37所述的方法，其中一个等于或高于-5.9的Δ-Ct表示GCC阳性结果并且一个低于-5. 9的Δ -Ct表示GCC阴性结果，由此所述结果允许辨别在GCC阴性与 GCC阳性结果之间的复发风险和无复发存活率(RFS)。
52.根据权利要求51所述的方法，其中当在同一个病人的1至3个淋巴结中发现阳性结果时，由此根据GCC/⑶SB试验具有1至3个阳性LN的病人的相对复发风险是中等的。
53.根据权利要求51所述的方法，其中当在同一个病人的4个或更多个淋巴结中发现阳性结果时，由此根据GCC/GUSB试验具有4个或更多个阳性LN的病人的相对复发风险是高的。
54.一种确定被诊断患有癌症的病人的GCC负荷的方法，该方法包括进行根据权利要求37所述的这些步骤，其中如果△ -Ct等于或高于大约-12，则以相对于一个外标准的拷贝数的方式计算GCC mRNA的量，由此以样品中的拷贝数表示该GCC负荷。
55.如权利要求M所述的方法，其中对于每个单独的淋巴结确立了该GCC负荷。
56.如权利要求M所述的方法，其中该GCC负荷是在该病人的所有淋巴结中的GCC的总量的基础上来确立的。
57.一种对被诊断患有癌症的病人的癌症复发风险进行预测的方法，包括根据权利要求55或56之一来确定该GCC负荷，其中一个大于10个拷贝的GCC负荷表明增加的癌症复发可能性。
58.一种对被诊断患有癌症的病人的癌症复发风险进行预测的方法，包括根据权利要求57所述来确定该GCC负荷，其中一个大于25个拷贝的GCC负荷表明增加的癌症复发可能性。
59.一种对被诊断患有癌症的病人的癌症复发风险进行预测的方法，包括以下步骤 确定从该病人体内收集的一个或多个淋巴结中GCC的量； 将这个或这些淋巴结中的每一个分类为GCC阴性或GCC阳性；并且 确立淋巴结比率，其中该淋巴结比率是GCC阳性淋巴结的数目与GCC阴性和GCC阳性淋巴结的总和的比率；由此，淋巴结比率越大，则癌症复发可能性越大。
全文摘要
本发明提供了一种新颖的用于对结肠直肠癌(CRC)中的淋巴结(LN)状态进行诊断、监测、预测以及分期的方法，相比于常规检测技术(如组织病理学)该方法是更灵敏且更准确的。鸟苷酸环化酶C(GCC)特异性地表达于从十二指肠至直肠的胃肠道的顶端上皮细胞中，并且在LN中检出GCC mRNA表明转移的存在。进行GCC mRNA的定量RT-PCR(RT-qPCR)检测以鉴定在LN中的结肠直肠癌(CRC)细胞的存在具有协助CRC分期的潜能。当与葡萄糖醛酸酶B(GUSB)相结合使用时，可以实现GCC的准确定量，其中在完整的并且高度降解的RNA样品之间具有小于2倍的变化。本发明还涉及一种使用相对定量的新设计的GCC/GUSB测定，它具有对于I期或II期结肠癌病人的复发时间和无复发存活率的改进的预测值。该GCC/GUSB测定还改进了对于相对复发风险和无复发存活率的预后分层的统计功效。
文档编号C12Q1/527GK102333887SQ201080009215
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月24日 优先权日2009年2月25日
发明者吉纳维芙·加龙, 尼古拉斯·贝特朗, 简-弗朗索瓦·海伊斯, 纪尧姆·博德里, 蒂莫西·J·霍尔泽, 迈克尔·霍德, 马丁·比利 申请人:戴格努生命科学公司