用于预防和治疗过敏的益生菌衍生的无活力材料的制作方法

专利名称：用于预防和治疗过敏的益生菌衍生的无活力材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及从益生菌菌株鼠李糖乳杆菌Goldin Gorbach (Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach, LGG)采集无活力的生物活性材料的方法。特别是，本发明涉及制备通过所述采集方法可获得的抗过敏益生菌材料的方法和包含所述益生菌材料的饮食或营养产品。
背景技术：
乳杆菌GG (乳杆菌G. G.，菌株ATCC 53103)是天然存在于人消化道的细菌。它是经过许多研究的细菌，一般认为有保健益处。它被公认是益生菌，因此掺入许多营养产品内，比如乳制品、营养补充物、婴儿配方等。在本领域目前限定益生菌是活的微生物，当适量给予时对宿主提供保健益处。但是，当将其掺入营养产品时益生菌的活的性质带来挑战。这些挑战在数量级方面可不同，尤其取决于所用益生菌株的类型，接受产品的个体的健康状态，或两者皆有。而且从加工技术方面来看，将活的微生物掺入产品内时需要克服相当大的障碍。如果要将益生菌掺入长期保存产品例如粉状产品如婴儿配方，这特别起作用。而且，随着营养产品基质的复杂性增加，挑战增加。特别是关于孕妇、婴儿和儿童的饮食产品，使用益生菌细菌的安全和功效受到进一步评估。具体安全问题涉及对营养利用的可能效果、排除抗生素耐药性的转移，和对肠道定殖、免疫反应和感染的短期和长期效果。虽然这并非意味益生菌不可用于此类产品中，但增加了使用活的或活力细菌的操作复杂性。另一方面，尤其是在婴儿和儿童饮食产品的情况下，存在提供益生菌有益效果的重要需求。而且，特别有挑战性的是确保在通过零售或医院渠道可获得且暴露于环境温度的营养产品中活力细菌的稳定性和活力。在这方面通过应用(加工的)培养上清液使用细菌产品将提供相当大的优点。已知婴儿的肠道微生物群发育远不如成人。虽然成人的微生物群由大于IO13接近500种微生物组成，一些有害和一些有益，而婴儿的微生物群仅含有那些微生物中的一部分，不仅在绝对数上而且在种类多样性上均如此。婴儿出生时肠道是无菌的，但从产道、 他们最初的环境和他们的摄入物获得肠道菌群。因为在新生儿早期肠道微生物群非常不稳定，婴儿肠道经常难以维持有害与有益细菌之间的脆弱平衡，所以降低了免疫系统正常发挥功能的能力。配方喂养的婴儿维持这种平衡尤其困难，因为配方喂养与母乳喂养婴儿肠道的细菌种类不同。母乳喂养婴儿的粪便主要含有双歧杆菌，通常较少见链球菌和乳杆菌。相反，配方喂养婴儿的微生物群更多样化，含有双歧杆菌和拟杆菌以及更多致病物种、葡萄球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌。母乳喂养与配方喂养婴儿粪便中双歧杆菌的各种物种也不同。已提出多种因素作为母乳喂养与配方喂养婴儿不同粪便菌群的原因，包括母乳蛋白含量较低和组成不同，母乳磷含量较低，母乳低聚糖种类多，和母乳中有许多免疫功能的体液禾口细胞介质。Agostoni 等，Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition (婴儿饮食产品中的益生菌 ESPGHAN 营养委员会的评论)，J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38 :365-374 (2004 年 4 月)。正常肠道菌群的建立对于健康和疾病具有重要意义。肠道微生物群的主要功能， 从宿主方面来看，是预防病原生物肠内定殖和抑制潜在的病原微生物的增殖，增加肠道对传染性疾病的天然抵抗力。益生菌通过预防病原菌与肠细胞的结合而发挥这种作用，这通过产生抗微生物化合物直接预防或通过合成短链挥发性脂肪酸改变肠腔的PH间接预防。此外，正常菌群可刺激胃肠免疫，提高黏膜IgA产生，刺激抗炎细胞因子的局部产生和减少过敏性炎症的特征性促炎症细胞因子的产生。关于益生菌在食物过敏、特应性皮炎和特应性一级预防中用途的大多数相关研究的综述已显示益生菌疗法缓解过敏性炎症，如通过临床症状的控制和局部和全身炎性标志的减少证明(Miraglia del Giudice Μ, De Luca MG. The role of probiotics in the clinical management of food allergy and atopic dermatitis (益生菌在食物过敏和特应性皮炎的临床管理中的作用).J Clin Gastroenterol 2004 ；38 (±曾干Ij 6) :S84-5 ；Prescott S, Bjorksten B, Probiotics for the prevention or treatment of allergic disease (用于予页防或治疗过敏性疾病的益生菌).J· Allergy Clin. Immunol. 2007 ；120 :255-26 。鉴于上文所述，将理解普遍期望提供具有益生菌的营养产品、饮食产品，特别是婴儿配方。术语“婴儿配方”指作为母乳代用品的满足婴儿营养需求的组合物。还将理解特别是在婴儿配方中，期望在不必掺入活的或活力细菌的情况下掺入益生菌。事实上，这称为“无活力益生菌”。关于此类无活力益生菌的研究正在进行。但是，正如Tao等的文章(Am J. Physiol Cell Physiol. 290 :C1018-C1030 (2006)所指出，虽然益生菌似乎改善许多疾病的过程，但很少了解它们的作用机制。仅在最近才尝试了解它们作用后面的机制和与宿主细胞的相互作用。已提出许多不同的可能机制，包括上调黏液产生，改善上皮屏障功能，增加IgA产生和增加对肠上皮粘附部位的竞争，以及产生有机酸、氨、过氧化氢和细菌素，其抑制病原菌的生长。在这方面Tao等提出对LGG可溶性因子某些作用的研究。推断某些生物活性存在于LGG-CM超滤液的低分子量部分(MW < IOkDa)。类似的教导是US 2007/123460。其中将无细菌、益生菌衍生的化合物，特别是低分子量部分(MW < IOkDa)代替活细菌用于治疗特别是炎性肠病(IBD)。触及无活力益生菌的其它参考文献是例如US 2004/208863，其主要涉及细菌的抗炎作用，及由其分泌的产物，和US 7052896，其涉及由鼠李糖乳杆菌物种产生的肽的抗炎和抗过敏性质。US 6，506，389描述从非病原微生物可获得的蛋白，所述蛋白具有黏膜结合活性和 20-40kD、优选20-30kD的分子量，或其同等多肽。该公开的要旨是提供鉴定能够与黏膜特异性结合的蛋白和多肽的筛选方法。无现有技术文献提出适当的直截了当的发酵和采集方法，以便从LGG获得支持抗过敏活性的无活力益生菌材料。而且，采集分泌的细菌产物带来问题，不能很容易地从培养基剥离不期望的组分。 这特别涉及用于相对脆弱受试者的营养产品，比如婴儿配方或临床营养物。如果将培养上清液的特殊组分首先分离、纯化，然后应用于营养产品中，则不产生该问题。但是，期望使用更完全(complete)的培养上清液。这将用于提供更好地反映益生菌(即LGG)天然作用的组合物。但是，目前不能只将培养上清液本身用作特别用于婴儿配方等的无活力益生菌材料的基础。因此更期望提供解决该问题的方法。发明概述为了更好地满足上述一项或多项期望，本发明一方面提出包含蛋白质混合物的组合物，所述组合物在LGG分批培养法后指数期从培养上清液可获得，用于治疗或预防过敏性疾病。另一方面，本发明涉及从LGG培养基采集具有抗过敏活性的组合物的方法，该方法包含使LGG在合适培养基中生长，确定LGG群生长的后指数期，在所述后指数期从细菌培养物分离培养上清液。又一方面，本发明提供饮食产品，其包含在LGG分批培养法后指数期从培养上清液可获得的无活力益生菌组合物，以及上述组合物作为添加剂在营养产品中的用途。再一方面，本发明提供治疗或预防受试者过敏性疾病的方法，该方法包含给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含在LGG分批培养法后指数期从培养上清液可获得的无活力益生菌材料。附图简述图1显示在培养后LGG群随着时间推移增加的曲线图；其中图Ia根据培养基的光密度(0D600)以及pH改变而描绘，图Ib呈现通过平皿培养技术确定的细菌计数。图2显示LGG培养采集的不同期(MJ1，MJ2，MJ3)细胞因子IL-10的产生；图3描绘体内卵白蛋白(OVA)致敏的时间线；用于测试本发明组合物的新生小鼠模型；图4描绘接受OVA模型和用包括活力LGG和LGG上清液在内的不同组合物口服处理的小鼠的染色肺组织的显微镜图像；图5显示代表在OVA过敏动物的肺中过敏细胞浸润的图；揭示在LGG和LGG上清液处理的小鼠的肺灌洗液中都存在过敏(嗜酸性)细胞减少。图6(a_c)展示代表与过敏性疾病中炎性过程相关的3种不同细胞因子的体外响应的图；数据显示LGG上清液出众地刺激抑制性(IL-10)细胞因子产生。图7呈现对本发明LGG培养上清液围产期给药的体内研究流程；图8展示过敏反应性的结果，显示为在围产期给予本发明的LGG培养上清液后，肺灌洗液中存在过敏(嗜酸性)细胞减少。实施方案详述从广义上讲，本发明基于领悟到从LGG分批培养可采集具备抗过敏活性的培养上清液(还可将其称为“废培养基”)。在本发明上下文中，术语“抗过敏”包括“过敏预防活性以及抗过敏治疗活性”。尽管不希望受理论的约束，但本发明人相信这种活性可归因于组分(包括蛋白质材料，可能包括(表)多糖材料)的混合物，如发现在LGG分批培养指数(或“对数”)期的后期释放入培养基内。在下文将组合物称为“本发明的培养上清液”。LGG是从健康人肠道菌群分离的益生菌株。它公开于授予Gorbach等的美国专利号5，032，399，其通过引用全部结合到本文中。LGG对大多数抗生素耐药，在酸和胆汁的存在下稳定，热切地附着于人肠道的黏膜细胞。它在大多数个体中存活1-3天，在30%受试者中存活多达7天。除了它的定殖能力以外，LGG对粘膜免疫反应也产生有益影响。LGG保存在保存权威美国模式培养物收集中心(American Type Culture Collection)，登录号ATCC 53103。技术人员已知公认的细菌分批培养各期。这些是“滞后”、“对数”(“对数”或“指数”)、“静止”和“死亡”(或“对数衰退”)期。在存在活细菌的所有各期，细菌使来自培养基的营养物代谢，分泌(排出、释放)材料进入培养基内。一般不可预测在生长期给定时间点分泌的材料的组成。在本发明中，从后指数期采集分泌的材料。后指数期出现在中指数期之后的时间(中指数期是指数期期间的一半时间，因此后指数期指滞后期与静止期之间的后半段时间)。特别是，术语“后指数期，，用于本文指LGG分批培养法滞后期与静止期之间的后四分之一段时间。根据本发明，优选在指数期期间75% -85%时间点，最优选在指数期经过约5/6 的时间时采集培养上清液。术语“培养(cultivation)”或“培养(culturing) ”指将微生物(在这种情况下是LGG)在合适培养基上或在其中繁殖。此类培养基可以是多种类型，特别是液体肉汤，如本领域常规的。例如，优选肉汤是一般用于培养乳杆菌的MRS肉汤。MRS肉汤一般包含聚山梨醇酯、乙酸盐、镁和锰，已知其发挥乳杆菌特殊生长因子以及富营养基质的作用。典型的组合物包含(以g/升的量)酪蛋白胨10. 0 ；肉提取物8. 0 ；酵母提取物4. 0 ；D(+)_葡萄糖20. ο ；磷酸氢二钾2. ο ；Tween 801. ο ；柠檬酸三铵2. ο ；乙酸钠5. ο ；硫酸镁0. 2 ；硫酸锰 0. 04。本发明培养上清液的优选用途是婴儿配方。这里为了充分使用本发明，期望确保从LGG培养物采集的组合物不含有不期望或法律上不允许存在于此类配方中的组分(如可存在于培养基中)。关于通常存在于MRS肉汤中的聚山梨醇酯，用于培养细菌的培养基可包括乳化非离子表面活性剂，如基于聚乙氧基化脱水山梨醇和油酸(典型地作为Tween 聚山梨醇酯比如Tween 80获得)。虽然这些表面活性剂经常见于食品如冰淇淋中且一般公认是安全的，但在司法上它们并不都被视为可取，或者用作相对脆弱受试者的营养产品比如婴儿配方或临床营养物甚至是不可接受的。本发明因此在优选实施方案中还涉及使用其中可避免上述聚山梨醇酯的培养基。 为了这个目的，本发明的优选培养基不含吐温80，可包含选自油酸、亚麻籽油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油及其混合物的油性成分。将理解如果基本或完全避免聚山梨醇酯表面活性剂的存在则实现油性成分的全部益处。最优选MRS培养基不含吐温(Tween) 80，除了一种或多种上述油以外，包含胨(典型地为10g/L)、肉提取物(典型地为8g/L)、酵母提取物(典型地为4g/L)、D (+)葡萄糖(典型地为20g/L)、磷酸氢二钾(典型地为2g/L)、乙酸钠三水合物(典型地为5g/L)、柠檬酸三铵(典型地为2g/L)、硫酸镁七水合物(典型地为0. 2g/L)和硫酸锰四水合物(典型地为 0. 05g/L)。 培养一般在20 V -45 V，优选35 °C -40 V，最优选在37 °C的温度进行。
可确定培养期间采集培养上清液的优选时间点，即在上述后指数期，如基于 0D600nm和葡萄糖浓度。0D600指在600nm的光密度，这是与培养基中细菌浓度直接相关的已知密度测量。
除了上述以外，应指出乳杆菌包括LGG的分批培养，是本领域技术人员可获得的一般普通知识。因此这里不需要进一步阐明这些方法。优选本发明的组合物通过大规模发酵(如在大于100L，优选约200L或更大的发酵器中)制备。本发明的组合物可通过将培养上清液与细菌培养物分离的任何已知技术采集。此类技术在本领域众所周知，包括例如离心、过滤、沉降等。上清液可以立即使用，或者贮存用于未来使用。在后一种情况下，一般将上清液冷藏、冷冻或冻干。根据期望，可将上清液浓缩或稀释。根据本发明采集的组合物，据信包含蛋白质组合物。术语“蛋白质”为技术人员已知，表明该组合物包含一种或多种肽、蛋白或其它包含氨基酸残基的化合物。关于化学物质，本发明培养上清液的组合物据信是各种分子量的多种氨基酸、寡肽和多肽和蛋白的混合物。组合物进一步据信包含多糖结构。与现有技术不同，强调本发明优选涉及完整，即未分馏(imfractionate)的培养上清液。在上述后指数期采集的明智选择，和保留上清液的实际上所有组分，据信促成随之获得的惊人结果，特别是在抗过敏活性方面，更特别是在婴儿和新生儿，和围产期分别给予孕妇和哺乳妇女后此类活性方面。完整的培养上清液更特别限定为基本排除一般低于6kDa的低分子量组分。这涉及组合物优选不包括乳酸和/或乳酸盐的事实。本发明的优选上清液因此具有大于6kDa的分子量，因为这是除去乳酸和乳酸盐后获得的典型上清液。这通常涉及过滤或柱层析。事实上，这种过滤的保留物代表大于6kDa的分子量范围(换句话说，滤出低于6kDa的成分)。本发明上清液的组合物一般将不仅是蛋白质的，还包含多糖，特别是表多糖(如由LGG产生的由糖残基组成的高分子量聚合物)。尽管不希望受理论的约束，本发明人相信，如上文讨论从后指数期采集的蛋白质材料的量与碳水化合物材料的量之间的比率，与从其它阶段如中指数期或静止期采集的组合物相比，促成抗过敏性质。根据本发明采集的培养上清液，可按各种方式使用，以便得益于发现的抗过敏活性。此类用途将一般涉及将本发明组合物给予有需要的受试者的一些形式。在这方面，可以这样使用培养上清液，如掺入胶囊内用于口服给药，或者在液体营养组合物比如饮料中， 或者可将其在进一步使用之前加工。优选后者。此类加工一般涉及将蛋白质组合物从上清液的一般液体连续相分离。这优选通过干燥法比如喷雾干燥或冷冻干燥(冻干)进行。优选喷雾干燥。在喷雾干燥法的优选实施方案中，可在喷雾干燥之前加入载体材料，如麦芽糊精DE^。据信这是有利的，考虑到在乳酸(由LGG产生且存在于废培养基中)是液体的条件下还产生干燥粉末。已发现本发明的组合物具备抗过敏(预防和/或治疗)活性。可确定抗过敏活性， 如在新近发展的变应性致敏和肺炎症的新生小鼠模型中。该模型事实上是所谓OVA模型的改变，OVA模型广泛用于研究过敏性疾病和哮喘的免疫病理学以及用于鉴定具有抗过敏活性的化合物。过敏性疾病包括，但不限于哮喘(可能基于过敏)、特应性湿疹(也可能基于过敏)、食物过敏和过敏性鼻炎/结膜炎。为了使本发明组合物发挥其有益的抗过敏作用，将其由受试者，优选人受试者消化。特别是，在优选实施方案中，受试者是孕妇、哺乳期妇女、新生儿、婴儿或儿童。如上所述，使用可被视为“无活力益生菌”的材料的优点大多数将得益于婴儿的饮食产品。术语“婴儿”指出生后的小于约1岁的人。将理解由受试者消化将需要口服给予本发明的组合物。本发明组合物的给药形式不是关键。在一些实施方案中，将组合物经片剂、丸剂、包囊、囊片、软胶囊(gel cap)、胶囊、 油滴或扁囊剂给予受试者。在另一个实施方案中，将组合物包裹在糖、脂肪或多糖中。在又一个实施方案中，将组合物加入食品或饮品中消费。食品或饮品可以是儿童营养产品比如后续(follow-on)配方、成长奶、饮料、奶、酸奶、果汁、水果基饮料、咀嚼片、 小甜点、饼干或奶粉。在其它实施方案中，产品可以是婴儿营养产品，比如婴儿配方或母乳增强剂。本发明的组合物，无论是以单独剂型或经营养产品加入，一般以有效治疗或预防过敏的量给予。有效量优选等于IX IO4-约IX IO12个细胞当量的活益生菌每公斤体重每天，更优选108-109。细胞当量的反算充分地在技术人员的知识范围内。如果经婴儿配方给予本发明组合物，婴儿配方可能在营养上是全面的，含有合适类型和量的脂质、碳水化合物、蛋白、维生素和矿物质。脂质或脂肪的量典型地可在约3-约 7g/100kcal变化。脂质来源可以是本领域任何已知或使用的来源，如植物油比如棕榈油、大豆油、棕榈油精(palmolein)、椰子油、中链甘油三酯油、高油酸葵花籽油、高油酸红花油等。 蛋白的量典型地可在约1-约5g/100kcal变化。蛋白来源可以是本领域任何已知或使用的来源，如脱脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、(部分或广泛地)水解蛋白、氨基酸等。碳水化合物的量典型地可在约8-约12g/100kcal变化。碳水化合物来源可以是本领域任何已知或使用的来源，如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖、淀粉、米糖浆固体等。方便地，可使用市售获得的产前、早产儿、婴儿和儿童的营养产品。例如，可将 Expecta Enfamil , Enfamil 早产儿配方，Lactofree
Nutramigen ’ Gentlea^ ，Pregestimil , ProSobee ，Enfakid ， Enfaschool , EnfagroW , Kindercal (可得自 Mead Johnson &Company， Evansville, Ind.，U. S. A.)用合适水平的本发明组合物补充并用于实施本发明的方法。在一个实施方案中，可将本发明组合物与一种或多种活力益生菌组合。在该实施方案中本领域已知的任何活力益生菌都可接受，前提是获得预期结果。如果活力益生菌与本发明组合物组合给药，活力益生菌的量可相当于约 IX IO4-I X IO12菌落形成单位(Cfu)每公斤体重每天。在另一个实施方案中，活力益生菌可包含约IX IO6-I X IO12Cfu每公斤体重每天。在又一个实施方案中，活力益生菌可包含约 IX IO9Cfu每公斤体重每天。在又一个实施方案中，活力益生菌可包含约IX IOltlCfu每公斤体重每天。在另一个实施方案中，本发明组合物可与一种或多种益生元组合。“益生元”指刺激益生菌生长和/或活性的不可消化的食物成分。在该实施方案中本领域已知的任何益生元都可接受，前提是获得期望的结果。可用于本发明的益生元可包括乳果糖、葡萄糖-低聚糖、菊粉、聚葡萄糖、半乳糖-低聚糖、果糖-低聚糖、异麦芽糖-低聚糖、大豆低聚糖、低聚乳果糖(lactosucrose)、木糖低聚糖和龙胆糖低聚糖。在本发明又一个实施方案中，婴儿配方可含有其它活性剂比如LCPUFA。合适的LCPUFA包括，但不限于，[α]-亚油酸，[Y]-亚油酸，亚油酸，亚麻酸，二十碳五烯酸(EPA)， 二十碳四烯酸(ARA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。在实施方案中，联合给予本发明组合物和DHA。在另一个实施方案中，联合给予本发明组合物和ARA。在又一个实施方案中，联合给予本发明组合物与DHA和ARA两者。可将含有DHA、ARA或其组合的市售获得的婴儿配方用本发明组合物补充，用于本发明。例如，Enfamil LIPIL ，其含有有效水平的DHA和 ARA，可市售获得，可用本发明组合物补充，用于本发明。如果包括，在本发明实施方案中ARA 的有效量典型地为约5mg每公斤体重每天-约150mg每公斤体重每天。在本发明一个实施方案中，该量在约IOmg每公斤体重每天-约120mg每公斤体重每天变化。在另一个实施方案中，量在约15mg每公斤体重每天-约90mg每公斤体重每天变化。在又一个实施方案中， 量在约20mg每公斤体重每天-约60mg每公斤体重每天变化。如果使用婴儿配方，DHA在婴儿配方中的量可在约5mg/100kcal-约80mg/100kcal变化。在本发明一个实施方案中，DHA 在约10mg/100kcal-约50mg/100kcal变化；在另一个实施方案中，在约15mg/100kcal_约 20mg/100kcal变化。在本发明特定实施方案中，DHA的量为约17mg/100kCal。如果使用婴儿配方，ARA在婴儿配方中的量可在约10mg/100kcal-约100mg/100kcal变化。在本发明一个实施方案中，ARA的量在约15mg/100kCal-约70mg/100kCal变化。在另一个实施方案中，ARA的量在约20mg/100kcal-约40mg/100kcal变化。在本发明特定实施方案中，ARA的量为约3%ig/100kCal。如果使用婴儿配方，可将婴儿配方以含有DHA和ARA的油用本领域已知的标准技术补充。例如，可将DHA和ARA通过替换等量的正常存在于配方中的油比如高油酸葵花籽油而加入配方中。作为另一个实例，可将含有DHA和ARA的油通过替换等量的正常存在于无DHA和ARA配方中的总脂肪共混物的其余部分加入配方中。如果使用，DHA 和ARA的来源可以是本领域已知的任何来源比如海产油(marine oil)、鱼油、单细胞油、蛋黄脂、脑脂等。在一些实施方案中，DHA和ARA源自单细胞Martek油，DHASCO ，或其变体。DHA和ARA可采用天然形式，前提是LCPUFA来源的残余物对婴儿不产生任何实质性有害作用。或者，可使用精炼形式的DHA和ARA。在本发明一个实施方案中，DHA和ARA来源是单细胞油，如在美国专利号5，374，567 ；5, 550，156 ；和5，397，591中所教导，其公开通过引用完全结合到本文中。但是，本发明并非只限于此类油。在一个实施方案中，含有EPA 的LCPUFA来源与至少一种本发明组合物组合使用。在另一个实施方案中，基本不含EPA的 LCPUFA来源与至少一种本发明组合物组合使用。例如，在本发明一个实施方案中，将含有小于约16mg EPA/100kcal的婴儿配方用本发明组合物补充。在另一个实施方案中，将含有小于约IOmg EPA/100kcal的婴儿配方用本发明组合物补充。在又一个实施方案中，将含有小于约5mg EPA/100kcal的婴儿配方用本发明组合物补充。本发明另一个实施方案包括甚至不含有痕量EPA、用本发明组合物补充的婴儿配方。据信提供本发明组合物与DHA和/或ARA的组合在含有这些剂的制剂的抗过敏性质方面提供互补或协同作用。在进一步优选的实施方案中，本发明的饮食产品包含一种或多种正常存在于人母乳中的生物活性材料，比如蛋白或多糖。本发明的组合物优选用于预防、减轻、改善或治疗过敏和/或其症状。将过敏限定为“对正常耐受且一般视为无害的物质的异常超敏反应”。过敏的症状范围可从流鼻涕至过敏性休克。接近5千万美国人患过敏性疾病，并且这些疾病的发病率正在增加。过敏反应涉及两个基本阶段。第一阶段涉及对过敏原的速发型超敏反应的早期发展。过敏原首次到达免疫系统，不发生过敏反应。取而代之的是，免疫系统本身准备与过敏原的未来相遇。作为清除细胞的巨噬细胞，和所谓树突状细胞包围和破坏入侵的过敏原。然后细胞在其细胞壁上将过敏原片段向T淋巴细胞展示，所述T淋巴细胞是机体免疫反应的主要协调者(orchestrator)。这种认知信号加几种非认知信号(如细胞因子)激活原初T 细胞，指示T细胞分化为T细胞效应亚群。在过敏级联中发挥关键作用的是Th-2表型的T 细胞(TH-2)。TH-2型T细胞的特征在于分泌几种细胞因子包括白介素-4(IL-4)、IL-5和 IL-13。然后细胞因子IL-4和IL-13激活B淋巴细胞以产生指向抗特定过敏原的亚类E的抗体(IgE)。效应细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)表面上特异性IgE抗体与过敏原的相互作用触发速发型超敏反应的早期。这种肥大细胞活化通常发生在第二次或另外暴露于过敏原后几分钟内。肥大细胞上的IgE抗体，在致敏期间构成，识别过敏原并与该入侵物结合。一旦过敏原与受体结合， 肥大细胞中的颗粒即释放其内容物。这些内容物，或介质，是促炎症物质比如组胺、血小板活化因子、前列腺素、细胞因子和白三烯。这些介质实际上触发过敏发作。组胺刺激粘液产生和引起发红、肿胀和炎症。前列腺素收缩气道和扩张血管。过敏免疫反应第二阶段的特征在于在过敏原暴露后炎性细胞比如嗜酸性粒细胞浸润入气道内。致敏与炎症之间的重要链接由T细胞表示，其分泌不仅参与IgE合成，还负责嗜酸性粒细胞募集、活化和存活的介质。组织肥大细胞和邻近的细胞产生化学信使，其向循环的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞及其它细胞发出信号以移行入该组织内并帮助对抗外来物。嗜酸性粒细胞分泌其自身的化学物以维持炎症，引起组织损伤，和募集更多免疫细胞。该阶段可发生在过敏原暴露后几小时至几天内任何时间，可持续几小时甚至几天。呼吸道过敏是影响呼吸道的特定过敏类型。从鼻至肺的气道内层在结构上相似， 经常相似地受过敏过程影响。因此，影响鼻或鼻窦的过敏原还可影响肺。例如，过敏性鼻炎，也称为枯草热，是由鼻和气道中的黏膜对空气中过敏原的过敏反应引起。过敏性鼻炎的症状经常包括鼻痒、咽痒和眼痒和过多喷嚏。经常接着是鼻塞或流涕。因为在呼吸道一个区域的过敏原可影响呼吸道其它区域，所以在鼻道中的鼻炎可导致哮喘，这是发生在肺下气道的严重得多的疾病。哮喘的特征在于发生气道高反应性，气促，呼气喘鸣，干咳和胸部紧缩感。反复过敏原暴露可维持气道中的炎性免疫反应，导致气道重塑，通常称为慢性哮喘。并非每个有过敏性鼻炎的人都发生哮喘症状，但相当数量，尤其是有复发、未治疗过敏的人将显示肺部炎症变化。大约40%有过敏性鼻炎的人将确实发生充分发展的哮喘。如果伴随过敏性鼻炎的鼻部炎症到达鼻窦，结果可能是不舒服的感染称为鼻窦炎，或者鼻-鼻窦炎，其中鼻窦本身不能排空细菌。症状包括鼻充血、流涕、咽痛、发热、头痛、疲劳和咳嗽，以及前额、颊后疼痛，和甚至牙痛和下巴痛。呼吸道过敏是儿童期最常见的病痛之一。至于成人，在儿重中的呼吸道过敏最可能表现为过敏性鼻炎和哮喘的形式。婴儿和幼儿预防呼吸道过敏尤其重要，因为似乎对过敏原的早期变应性致敏与正常免疫反应的成熟延迟有关。另外，变应性致敏一般被视为发生特应性疾病的第一步。 Baena-Cagnani, Role of Food Allergy in Asthma in Childhood( M^l311 AmSJ 哮喘中的作用)，Allergy. Clin. Immun. 1 (2) =145-149 (2001) 0经常地，幼年开始的哮喘与特应性关联，因此早期变应性致敏看来在持续哮喘中也发挥重要作用。Martinez，F.， Development of Wheezing Disorders and Asthma in Preschool Children(喘鸣疾病禾口哮喘在学龄前儿童中的发展)，Pediatr. 109 :362-367 Q002)。不仅变应性致敏与哮喘之间有强关联，而且该关联似乎呈年龄依赖性。虽然在生命前几年期间很少儿童被过敏原致敏，但在此期间被致敏的绝大多数在以后的生命中逐渐形成哮喘样症状° Martinez, F. , Viruses and Atopic Sensitization in the First Years of Life (在生命前几年中病毒和特应性致敏)，Am. J. Respir. Crit. Care Med.，162 S95-S99(2000)。因此，重要的是发现预防早期过敏原致敏、过敏反应性和预防以后的生命中呼吸道过敏的方法。越来越多证据显示健康和疾病的许多方面不仅在婴儿期决定，而且也在怀孕期决定。过敏性疾病尤其如此，其中出生时的免疫反应牵涉子宫内暴露作为初次致敏事件。例如，过敏原特异性T细胞在出生时已存在，并且对食物过敏原的早期致敏被识别为以后发生呼吸道过敏的预报因子。IHi 等，The Natural Course of Atopic Dermatitis from Birth to Age 7 Years and the Association with Asthma( /Aiij7 ^'WM'H^.^t^i 自然过程和与哮喘的关联)，Clin. Exp. Allergy 27:28-35(1997)。此外，在受精后很早肺就开始发育并在出生后持续至少2或3年。因此，产前和产后气道发育都对婴儿和儿童呼吸道过敏的发病很重要。也已显示在妊娠早期人的胎儿逐渐形成产生IgE的B细胞，能够响应适当的抗原刺激产生IgE抗体，其方式类似于在各种产前感染中看到的公认的IgM反应。Weil， G.等，Prenatal Allergic Sensitization to Helminth Antigens in Offspring of Parasite-Infected Mothers (在感染寄生虫的母亲的子代中对蠕虫抗原的产前变应性致敏)，J. Clin. Invest. 71 :1124-1129 (1983) 0这还说明预防对呼吸道过敏原的产前和产后变应性致敏的重要性。对呼吸道过敏的传统药物包括抗组胺药、局部鼻类固醇、减充血剂和色甘酸溶液。 作为传统药物的替代，已出现益生菌作为某些类型过敏的可能治疗物。关于使用活的或活力益生菌的上述缺点，本发明特别有利于在用于预防、减轻、改善或治疗过敏性疾病和/或其症状的产品中替代此类益生菌。为达到该目的，优选将组合物经饮食或营养产品给药，更优选产前、婴儿或儿童配方或营养组合物，医疗食品，或用于特殊医疗目的的食品(即标记限定医疗目的的食品)，最优选婴儿配方，或用于孕妇或哺乳妇女的围产期营养物，基本如上文讨论。此外，本发明还能够以改良方式提供益生菌。因为，本发明无活力益生菌衍生的材料可通过标准化和可再生产的方式在工业环境中制备，避免活益生菌固有的那些问题。 而且，因为无活力的性质且特别是当作为干粉提供时，可将其充分地掺入并配药到营养组合物中，用于预防或治疗过敏反应性或疾病。下文将参考以下非限制性实施例和


本发明。实施例1在分批发酵法中，使LGG在生理条件下生长。通过加入33% NaOH保持pH恒定为PH6，温度保持在37°C。搅拌器速度是50rpm，顶空用队冲洗。提供以下培养基(经改变的 MRS肉汤)(表1)。表 权利要求
1.一种包含蛋白质混合物的组合物，所述组合物在LGG分批培养法的后指数期从培养上清液可获得，用于治疗或预防过敏性疾病。
2.权利要求1用于治疗或预防过敏性疾病的组合物，其通过包含以下步骤的方法可获得(a)用分批法使LGG在合适的培养基中培养；(b)在培养步骤的后指数期采集培养上清液，将该期限定为LGG分批培养法滞后期与静止期之间的后半段时间；(c)任选从上清液除去低分子量成分以保留高于6kDa分子量的成分；(d)从培养上清液除去液体内容物以获得组合物。
3.权利要求1或2的组合物，其中将后指数期限定为LGG分批培养法滞后期与静止期之间的后四分之一段时间，优选指数期中经过0. 75-0. 85的时间。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其中LGG分批培养在不含吐温80的培养基中进行，培养基优选含有选自油酸、亚麻籽油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油及其混合物的油性成分。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中LGG分批培养在中性pH优选pH6进行，在生理温度优选37 °C进行。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其为干燥形式，优选喷雾干燥或冷冻干燥。
7.权利要求6的组合物，其中将药学上可接受的载体材料，比如麦芽糊精DE^jHAi 清液内，接着喷雾干燥。
8.一种婴儿或儿童配方，其在脂质、碳水化合物、蛋白、维生素和矿物质的存在方面营养全面，进一步包含权利要求1-7中任一项的组合物。
9.权利要求1-7中任一项的组合物，其为饮食产品优选营养产品的形式，或者为此类产品优选营养产品的添加剂形式。
10.权利要求9的组合物，其中饮食产品进一步包含一种或多种多不饱和脂肪酸 (PUFA)，优选长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)比如花生四烯酸(ARA)或二十二碳六烯酸 (DHA)。
11.权利要求9或10的组合物，其中饮食产品进一步包含一种或多种正常存在于人母乳中的生物活性成分，比如蛋白或多糖。
12.权利要求9-11中任一项的组合物，其中饮食产品进一步包含一种或多种益生元， 优选选自不可消化的低聚糖、不可消化的多糖，及其混合物。
13.权利要求9-12中任一项的组合物，其中饮食产品是产前、婴儿或儿童配方或者营养组合物或补充物、医疗食品或用于特殊医疗目的的食品。
全文摘要
公开了用于制备具有抗过敏(即预防过敏和/或治疗意义上的抗过敏)性质的无活力益生菌组合物的方法，该方法包含以下步骤(a)用分批法将LGG在合适的培养基中培养；(b)在培养步骤的后指数期采集培养上清液；(c)从培养上清液除去液体内容物以获得组合物。还公开包含蛋白质混合物的组合物，所述组合物通过以上方法可获得，及其在优选靶向怀孕的母亲、婴儿或儿童的饮食产品中的用途，以及在用于特殊医疗目的的食品中的应用。
文档编号C12R1/225GK102575224SQ201080040659
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月11日
发明者E·A·F·范托尔, H·伦斯, H·加恩, K·M·奥弗坎普, M·J·范德维尔夫, M·布拉克斯马, U·赫尔斯, W·M·拉塞尔 申请人:美赞臣营养品公司