专利名称：生产活的四倍体牡蛎的方法
技术领域：
本发明的实施方式涉及以高效率生产活的四倍体牡蛎的方法。
背景技术：
大多数有性繁殖的动物具有两组染色体，它们被称为二倍体。减数分裂是一种使染色体数量减半的过程，以避免各代的染色体数量加倍。这种过程有两个步骤，通过所述步骤，一个二倍体细胞变为四个单倍体细胞，每个单倍体细胞具有一组染色体。一个或所有四个单倍体细胞可以成熟为有功能的卵子或精子，其被称为配子。四倍体牡蛎对于实现多种目的是重要的，包括三倍体、杂交和其它育种方案。已知的是，在二倍体牡蛎的正常繁殖期期间，与二倍体牡蛎相比，三倍体牡蛎具有更好的口味和更高的生长速度的商业优点。当前，已经利用特别的染色体组改变技术从正常的二倍体牡蛎生产三倍体牡蛎，其中卵母细胞中的减数分裂被改变，从而在第二次减数分裂期间在卵母细胞中保留第二极体，而不是从卵母细胞中排出。细胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)已知作为在受精卵的减数分裂期间防止第一极体(PBl)从细胞中排出的化合物。然而，即使根据上述常规技术，已知还没有利用细胞松弛素B(CB)和6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)的组合生产四倍体牡蛎的方法。
发明内容
因而，本发明的目的是提供以高效率生产活的四倍体牡蛎的方法。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了生产活的四倍体牡蛎的方法， 包括步骤用二倍体雄性牡蛎的精子使三倍体雌性牡蛎的卵受精；阻止第一极体从所述受精卵中排出；以及通过培养所述受精卵来生产活的四倍体牡蛎，其中阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤 (DMAP)。所述方法包括用二倍体雄性牡蛎的精子使三倍体牡蛎的卵受精的步骤。三倍体雌性牡蛎可以是商业上可获得的(Allen, Jr. , S. K. (1988) ；Oceanus 31,58-63) 可以利用特别的染色体组改变技术从二倍体牡蛎生产三倍体牡蛎，其中卵母细胞中的减数分裂被改变，从而在第二次减数分裂期间在卵母细胞中保留第二极体，而不是从卵母细胞中排出。可以在产卵之前利用流式细胞计验证三倍体牡蛎的倍性。三倍体牡蛎的卵可以通过切开三倍体雌性牡蛎(剥离产卵(strip spawning))来采集。采集的卵可以用海水清洗并保持在合适的筛网上，例如25μπι筛网。本发明的实施方式中使用的三倍体牡蛎可以通过将它们置于高温和富含饲料的环境中来调节。这种调节优选地在紧接着冬眠之后的配子发生的初始期开始。接下来，用获自正常的二倍体雄性牡蛎的精子使所述卵受精。用于受精的精子可以包括每个卵约10个或多于10个精细胞。受精可以根据本领域已知的任何方法来进行，例如，在海水中使卵和精子接触。所述方法包括阻止第一极体从受精卵中排出的步骤。这个步骤可以包括使受精卵接触细胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。所述接触可以在受精卵排出第一极体的时间的30% 90%的时间范围内进行。 此外，所述接触可以在卵受精之后进行5 15分钟。阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵同时接触细胞松弛素 B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。此外，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵相继接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵接触细胞松弛素B(CB)以及然后使受精卵接触 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括在受精卵排出第一极体的时间的30% 90%的时间范围内使受精卵接触细胞松弛素B(CB)，然后在受精卵排出第一极体的时间的50% 90%的时间范围内使受精卵接触6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。更具体地，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括在卵受精之后使受精卵接触细胞松弛素B (CB) 5 15分钟，然后在卵受精之后使受精卵接触6- 二甲基氨基嘌呤 (DMAP) 8. 3 15 分钟。此外，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括将受精卵加入到二甲亚砜 (DMSO)中0. 25 1. Oppm浓度的细胞松弛素B (CB)以及二甲亚砜(DMSO)中0. 25 1. Oppm 浓度的6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括将受精卵加入到二甲亚砜(DMSO)中0.25 0.75 111浓度的细胞松弛素8(08)以及二甲亚砜(DMSO)中0. 25 0. 75ppm浓度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。所述方法进一步包括通过培养所述受精卵来生产活的四倍体牡蛎的步骤。所述培养可以根据本领域已知的任何受精卵培养方法来进行。例如，培养可以在 18°C 30°C，优选23°C 的温度条件下进行。此外，培养可以在17ppt 33ppt，优选约20ppt 22ppt的盐度条件下进行。在所述方法中，使用的牡蛎可以属于巨蛎(crassostrea)属。巨蛎属的牡蛎可 [=| ix^i^lj (crassostrea gigas) > crassostrea sikamai> τ Γ^Jg (crassostrea
revularis)和美洲牡蛎(crassostrea virginica)中之一。此外，使用的牡蛎可以属于珠母贝(pinctada)属。例如，牡蛎可以是黑蝶珠母贝(pinctada mar gar it if era)。根据本发明的方法，可以生产四倍体牡蛎，其可以在天然培育正常二倍体牡蛎的自然环境下生长和成熟，以及可以通过四倍体牡蛎和二倍体牡蛎之间的杂交生产三倍体牡蛎。根据本发明的实施方式，可以以高效率从三倍体牡蛎和二倍体牡蛎生产四倍体牡蛎。
具体实施例方式在下文中将详细描述本发明的优选实施方式。然而要理解的是，以说明性的方式、 而不是以限制性的方式来提供这个实施方式，以解释本发明的精神。这个实施方式利用第二年的三倍体太平洋牡蛎，其是通过阻止第二极体(PB2)排出来生产的。在产卵之前通过流式细胞计分别验证三倍体牡蛎。通过剥离产卵的方式采集它们的配子。使卵通过85μπι的筛网来除去大的组织碎片，在25μπι筛网上清洗。受精和处理全部在由2 μ m筛网过滤的25°C 的海水中进行。这个实施方式中使用的海水的盐度是约20ppt 22ppt。用来自二倍体牡蛎的单倍体精子使来自三倍体牡蛎的卵受精。将受精卵分成对照组、比较组和实验组。对照组的受精卵不用化学物质处理来培养。比较组1和2的受精卵用细胞松弛素 B(CB)处理以阻止第一极体的排出。将CB溶解在二甲亚砜(DMSO)中，在CB终浓度0. 25mg/ 1、含有0. 5% DMSO的情况下(比较组1)以及在CB终浓度0. 5mg/l、含有0. 5% DMSO的情况下(比较组2)加入受精卵。比较组3和4的受精卵用6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)处理以阻止第一极体的排出。将DMAP溶解在二甲亚砜(DMSO)中，在DMAP终浓度0. 25mg/l、含有0. 5% DMSO的情况下(比较组幻以及在DMAP终浓度0. 5mg/l、含有0. 5% DMSO的情况下(比较组4)加入受精卵。实验组1和2的受精卵用CB和DMAP处理以阻止第一极体的排出。将CB和DMAP 溶解在DMSO中，在终浓度0. 25mg CB/1和0. 25mg DMAP/1、含有0. 5% DMSO的情况下(实验组1)以及在终浓度0. 5mg CB/1和0. 5mgDMAP/l、含有0. 5% DMSO的情况下(实验组2) 加入受精卵。在对照组、比较组1和2以及实验组1和2中，处理从受精后五分钟开始持续15 分钟。在处理之后，受精卵用DMSO-海水清洗，以65个卵/ml的密度培养。实验组3的受精卵用CB和DMAP处理来阻止第一极体的排出。将CB和DMAP溶解在DMSO中，在终浓度0. 25mg CB/1、含有0. 5% DMSO的情况下加入受精卵，在受精后五分钟开始处理。在受精后经过10分钟，在终浓度为0.25mg DMAP/1的情况下加入受精卵，受精后连续处理15分钟(实验组3)。实验组4的受精卵用CB和DMAP处理以阻止第一极体的排出。将CB和DMAP溶解在DMSO中，在终浓度0. 5mg CB/1、含有0. 5% DMSO的情况下加入受精卵，在受精后五分钟开始处理。在受精后经过10分钟，在终浓度为0. 5mg DMAP/1的情况下加入受精卵，受精后连续处理15分钟(实验组4)。在实验组3和4中，在处理之后，受精卵用1 % DMSA-海水清洗，以65个卵/ml的密度培养。[表1]
权利要求
1.一种生产活的四倍体牡蛎的方法，包括步骤用二倍体雄性牡蛎的精子使三倍体雌性牡蛎的卵受精；阻止第一极体从所述受精卵中排出；和通过培养所述受精卵来生产活的四倍体牡蛎，其中阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵接触细胞松弛素 B(CB)和6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
2.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵同时接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
3.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵相继接触细胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
4.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵接触细胞松弛素B(CB)，然后使所述受精卵接触6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
5.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括在受精卵排出第一极体的时间的30% 90%的时间范围内使受精卵接触细胞松弛素B(CB)，然后在受精卵排出第一极体的时间的50% 90%的时间范围内使受精卵接触6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
6.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤包括在卵受精之后使受精卵接触细胞松弛素B (CB) 5 15分钟，然后在卵受精之后使受精卵接触6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)8. 3 15分钟。
7.根据权利要求1的方法，其中，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤包括将受精卵加入到二甲亚砜(DMSO)中0. 25 1. Oppm浓度的细胞松弛素B (CB)以及二甲亚砜(DMSO) 中0. 25 1. Oppm浓度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。
8.根据权利要求7的方法，其中，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤包括将受精卵加入到二甲亚砜(DMSO)中0. 25 0. 75 111浓度的细胞松弛素8(08)以及二甲亚砜(DMSO) 中0. 25 0. 75ppm浓度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。
9.根据权利要求1的方法，其中，所述接触在受精卵排出第一极体的时间的30% 90%的时间范围内进行。
10.根据权利要求1的方法，其中，所述接触在卵受精后进行5 15分钟。
11.根据权利要求1的方法，其中，所述培养在18°C 30°C的温度以及17ppt 33ppt 的盐度的条件下进行。
全文摘要
本发明的一个详细的实施例提供了利用细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的组合有效地生产四倍体牡蛎的方法。
文档编号C12N15/01GK102573453SQ201080046057
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月6日 优先权日2009年8月14日
发明者郑承勋 申请人:西亚益维株式会社