减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统的制作方法

专利名称：减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明实施方案大体涉及減少精子群体中DNA断裂的方法和系统，具体地，涉及形成具有減少的DNA断裂的精子群体、以用于产生后代的辅助生殖过程。
背景技术：
精子和性分拣的精子(精子的分拣是基于携带X或者Y染色体分类的)是辅助生殖技术和畜牧养殖业中被赋予极大兴趣的生物材料。但是，损伤的和/或死亡的精子缺乏通过人工授精(Al)、体外受精(IVF)、卵子胞质内单精子注射(ICSI)或者其它辅助生殖技术产生后代的能力。损伤的细胞可以包括膜改变的细胞、经历细胞凋亡的细胞、以及具 有DNA断裂的细胞。损伤的精子，当其在辅助生殖技术中使用的有生活力的精子群体中出现时，可能能够使卵子受精，但是可能无法产生有生活力的胚胎或者产生的胚胎具有基因异常(其不会正常发育或稍后死亡)。以这种方式，具有DNA断裂的精子和有生活力的精子竞争，減少了成功妊娠的总体可能性，増加了产生畸形的后代的可能性。Simon等，HumanReproduction, Vol. 25 No. 7 pp. 1594-1608(2010)证明了 增加精子 DNA 断裂的比率对采用以下辅助生殖技术(例如IVF和ICSI)的妊娠率和胚胎发育具有不利影响。同样地，卵子、卵母细胞、胚胎或者其它具有损伤的DNA或DNA断裂的生殖细胞也減少成功妊娠的可能性。因此，需要关于精子处理的方法和系统，其能減少分拣的精子亚群体中的DNA断裂水平，特别是当在辅助生殖技术中使用的分拣的亚群体(其中性别选择是最终目标)。性分拣的精子是富含有性别的精子群体(其精子基于携带X染色体或携帯Y染色体而被分类)。利用所述性分拣的精子，可以产生具有高度确定性的期望的性别的后代，从而有利于乳制品和牛肉エ业。应用于精子性分拣的流式细胞分析，通常合并非毒性DNA结合荧光染料，其滲透细胞膜，以化学计量方式和每个精子的DNA相关联。与每个精子相关联的染料的量，与被包含在每个细胞中的DNA的量密切相关，激光激发使可以识别带有Y染色体和带有X染色体的精子。美国专利5，135，759,6, 357，307,7, 371，517和7，758，811，其每个都通过參考的方式并入，提供了适于精子分拣(基于X和Y染色体的差异)的系统和方法。虽然所有动物的新鮮精液本身含有一定的精子DNA断裂，从各个捐助者的精液中的DNA断裂水平可以有所不同，由于不同的因素，如氧化应激、细胞凋亡、组蛋白-鱼精蛋白的无法替代、和其他与精液产生相关的环境因素。在随后的精子处理过程中，ー些DNA损伤因子可以被复合。除此之外，假设精子是体外射精得到的易损的细胞、精子样品，其在大多数精子处理过程(同时准备受精样品)中能忍受额外的医源性的损伤。特别地，精子性分拣的方法学包括几个步骤，对细胞制造应激条件，其不仅是损伤，但也可以有助于和加强潜在的医源性损伤。由于所述分拣过程某些步骤中的制造的损伤，可以被复合，在整个分拣过程中通过化学或物理方式持续地进行；特别需要富集细胞群体(关于DNA断裂或者缺少DNA断裂的)。因此，需要富集考虑到DNA断裂水平的精子样品的方法和系统，来改善人工繁殖技术和使用性分拣的精子的后代健康发育的成功率。
发明概述本发明实施方案通常涉及分拣精子和产生精子群体的流式细胞分析方法和系统，所述精子群体与所述初始精子样品相比，具有減少的DNA断裂的量。这些具有減少的DNA断裂的量的精子群体，对通过生殖技术(例如Al，ICSI，IVF和其它相关技木)例如进行的授精和/或受精是有利的。因此，本文公开的实施方案提供用于使精子样品中的精子DNA断裂的水平相对于射精后的初始精子样品减少的方法和装置。在ー个方面中，本文公开的实施方案提供了用于减少精子群体中的DNA断裂的方法和装置。在另ー个方面中，本文公开的实施方案提供用于将精子分拣成具有不同的DNA断裂特征的精子群体的方法和系统，包括至少ー种富集的精子群体(其具有減少的DNA断裂的量)。甚至在另ー个方面中，精子的分拣是基于DNA断裂的特征、或者代表精子群体具有DNA断裂的较高发生率的特征。附图简述图IA示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光对于侧向角荧光的代表性绘图。图IB示出了染色质扩散试验中含有精子的ー侧，其中所述精子是从特殊分类的区域收集的。图IC示出了染色质扩散试验中含有精子的ー侧，其中所述精子是从特殊分类的区域收集的。图2A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光对于侧向角荧光的代表性绘图。图2B示出了流式细胞仪中精子的近门部分，绘制了前向荧光对于集成前向荧光的关系图。图3A示出了常规的精子样品中DNA断裂随时间的推移的示意性表述。图3B示出了性分拣的精子样品中DNA断裂随时间的推移的示意性表述。图3C示出了在常规样品和性分拣的精子样品中平均DNA断裂随时间的推移的示意性表述。图4示出了根据本文提出的某些实施方案的流式细胞仪。图5示出了根据本发明的实施方案的方法的流程图。
发明详述容易理解的，在详细地解释本方法之前，这不是对本文描述的实施方法的专门限制，其是可以以多种方式实施的。而且，所述方法和系统是以通常的方式公开的，因此一旦人们理解了通常的规律，这些方法就能运用于具体的系统中。一个实施方案涉及分拣细胞的方法，其形成不连续的亚种群，其中ー些富集的亚种群具有减少的DNA断裂水平或者没有DNA断裂，其它富集的亚种群具有增加的DNA断裂水平。这种分拣基于DNA断裂特征的存在，以减少富集的精子样品中DNA断裂的发生率。所述方法通过建立精子样品开始。所述精子样品可以从任意哺乳动物获得，所述哺乳动物没有限制，包括在 Wilson, D. E. and Reeder, D. Μ.，Mammal Species of the World,Smithsonian Institute Press (1993)中列出的，该文本整体通过參考方式并入本文。在一个实施方案中，均匀的精液可以用膨胀剂稀释处理，保存精子能动性和生殖力这是现有技术公知的。在另ー个实施方案中，所述精子样品的建立也可以通过融化先前冷冻保存和/或先前处理的精子(来自吸管)。在又一个实施方案，所述精子样品可以包括分别去除了它们的精子尾部的精子头部。在某些实施方案中，所述精子样品可以用标记或者染料染色。所述标记可以是DNA选择性的或 DNA 结合染料，例如 Hoechst 33342,Hoechst 33258、BBC、SYBR_14、SYBR GreenI、双苯酰亚胺染料，或其组合(其可以是荧色物)。在某些实施方案中中，所述精子可以被第二标记染色，例如红色食品染料或者碘化丙啶。在这些实施方案中，所述染色的精子可以单独使用流失细胞分析进行评估，或者使用其它的基于荧光或可见的显微镜法的分析技木。在流式细胞分析中，精子在液体流中输送，然后液体流被分裂成液滴，每个液滴理想地含有単一的精子，其在检查区用能量源单 独地照射，例如激光。所述DNA选择性荧色物染料能吸收所述激光的能量，发射不同波长的发射光，以对这种激发作出反应。这种发射光的量可以定量，以测定所述染料的相对量(与样品中其它精子相比)。可以检测或监测所述照射的精子的发射光，通过利用处理信号(表征来自照射的细胞的发射光的強度)的光电倍增管。发射光的強度可以提供关于每个精子的性能的信息，其每个精子与使用的不同染料之间差异性相互作用；也可以提供关于所述精子的DNA断裂特征的信息。由于具有较大量的DNA断裂的细胞可能有较少的与DNA选择性染料结合的位点，所以细胞可能产生较低強度的发射以允许评估DNA断裂特征(基于检测的发射值)。DNA断裂特征可以包括其它可识别的细胞特性，例如免疫能力下降的或改变的膜，在这种情况下，淬火剂或者第二标记可以大大减少受刺激的精子细胞荧光的量。基于对ー个或多个的这些特征的评估，亚种群细胞可以被表征为相对于样品中剰余的精子群体含有较高或者较低的DNA断裂水平，或者相对于样品中剰余的精子群体较大或较小的具有这种损坏的可能性。通过选择表征为具有较小的DNA断裂的可能性的精子群体，分拣和收集了具有较低水平的DNA断裂的富集群体。例如，在使用流式细胞分析的某些精子分拣系统中，分拣精子可以通过基于产生的信号使夹带所述精子的流体带电。分离自液体流的带电的液滴，然后保持带电荷，并通过弓I导所述液滴进入ー个或几个容器的偏转平板而发生电磁偏转。这种流式细胞仪系统可以设定，以将精子样品分拣成第一群体、第二群体和可能的第三群体，其中所述第一群体可以含有更大的比率的死亡的细胞或者DNA损伤的细胞，而所述第二群体和所述第三群体可以含有X/Y分拣的产物。所述精子的第一群体(具有较高的DNA断裂的发生率)，可以作为废物收集，也可以被包括在认为是非-活精子的群体中。所述剩余的第二和第三群体可以包括X/Y分离的群体(具有減少的精子损伤)。用于分拣细胞(基于DNA断裂特征的水平)的流式细胞仪系统。可以包括基本的流失细胞仪部件，直到包括接受细胞或精子样品的入ロ、以及与振荡器(产生夹带精子的液滴)连接的出口。所述精子可以具有与它们的DNA相关联的DNA选择性染料。产生电磁辐射能量的激发装置可以用来刺激与所述精子DNA相关联的染料。激光是激发装置的ー个例子，但是弧光灯和其它辐射能源可以用来辐射或刺激荧色物染色的精子。
分拣精子的系统可以包括检测器，定位以检测所述标记的激发装置关联所述检查区的DNA的相互影响，产生基于照射的精子的发射光的信号。该信号然后可以和分析仪连通，以评估检测器产生的信号。所述信号可以被评估在每个样品単独的精子中DNA断裂特征的存在。DNA断裂特征可以是指示精子的亚种群具有断裂的DNA的可能性増大的特征。作为非限制性的实例，DNA断裂特征可以由发射荧光强度来代表，因为其荧光染料结合位点数量減少；和其一祥，第二淬火染料(其只与具有免疫能力下降的胞膜的精子相关联)引起荧光減少。一旦通过分析仪测定，信号可以通过将样品分离成不同的群体的分离器。ー个或多个群体可以被分拣成富集的精子样品，其相对于初始样品具有较高的或较低的DNA断裂水平。所述系统可以包括收集分拣精子的第一群体的第一收集元件、和收集精子的第二群体的第二收集元件。所述系统还可以包括第三或者更多收集元件，用于收集精子的第三、或者更多的群体。这种分拣可以同时进行，或者以两步或者更多步骤顺序进行。容易理解，任意ー个群体可以单独地根据DNA断裂分离，同时其它两个群体可以根据携帯X染色体还是Y染色体分离。在分拣的精子中的DNA断裂本文提供的四个实验证明分拣技术能将死亡的和DNA损伤的精子从有生活力的精子样品中分离出。在所述死亡的和染色的精子群体中的所述精子有较高的DNA断裂频率，同时从有生活力的亚种群分离的所述精子具有減少的精子DNA断裂水平。通过合并多种分拣技术，可以检测具有高水平的精子损伤；例如使用流式细胞分析的性分拣，其中所述精子可以分拣成死亡的亚种群，而剩余部分可以含有活亚种群，例如携帯X-和/或Y-染色体的活亚种群。所述死亡的和所述活亚种群可以含有受损伤的或者经历DNA断裂的细胞，但是其在所述活亚种群细胞中的比率分布是最小的。证明减少的DNA损伤的实验在接下来的实验中，在3和9岁之间的年龄选择5只Jersey公牛和15只Holstein公牛,制备精子样品。姆种性分拣的样品使用MoFlo SX TM (Beckman Coulter,Miami, Florida)进行分拣。精子的分拣根据有差异的突光信号进行，其使用Hoechst33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon)和红色食品染料(FD&C#40, Molecular ProbesEugene, Oregon)形成。具有较高DNA含量的所述最終的荧光信号较强，即X-染色体携帯群体相对于较低DNA含量的被称为Y-染色体携帯群体的最终荧光信号较强。所述红色食品染料被排除在健康完整的胞膜外，同时保留在有损伤的胞膜(其淬灭这些细胞中显著量的荧光)的精子内。在每个实验中，携帯X-和携帯Y-染色体、分拣的精子是根据不同的荧光信号选择的，使用 16. 2mM Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA),在含有 20%卵黄-TRIS膨胀剂的捕捉液中稀释。常规精液制备的相同标准，以及选择用于处理的精液的标准精液特征的截止值被应用。在所有实验中，为常规的或性分拣的吸管中的精液的用于处理的公牛精液，只有符合以下标准1)55%的最小活动カ；2) 900x106个精子/mL的最小浓度，使用 SPl-Cassette,Reagent SlOO和Nucleo Counter SP-lOO 系统(ChemoMetec A/S, Gydevang 43, DK-3450 Allerad, Denmark)测定；以及3) 15%的初级形态，15%的次级形态，和总形态不超过25%。此外，在解冻后、分析中使用的样品符合下列条件的质量标准I)精子前向运动活动ヵ(progressivemotility)在Oh时至少45%，在3h时为30%;和2)包括在3h时至少50%的完整的顶体。在3小时的冻解后运动和顶体测量，所有的样品在加湿室中37°C孵育3h。对于所有精子质量评估，使用75x25mm玻璃显微载玻片(Andwin, Addison, Illinois,美国)和22x22mm#l. 5盖玻片(Thomas Scientific, Swedesboro, New Jersey, USA)。所有活动カ评估(motilityassessment)使用明视野显微镜，后续的完整的顶体和形态评估使用微分干涉对比(DIC)显微镜(放大倍数为x400)。本实验中使用的所有膨胀剂的配方相同，具有6. 8的pH，对TRIS膨胀剂渗透压平衡在300m0sm。对于低温贮藏，分拣的和常规的精子样品使用甘油两步扩大处理。在所述实验中使用的所有冷冻-解冻的性分拣的样品含有2. Ix 106精子/吸管(0. 25cc)，同时常规样品的范围是25x 106至30x 106精子/吸管(0. 5cc)。来自每只单独公牛的均匀的精液被分成两等分试样。ー个等分试样是性分拣的，其后所述精子被冷冻，使用自动冷冻装置頂V Digitcool (IMV, Cedex, France)，贮藏在液氮 中进行低温冷冻。第二个等分试样被直接地冷冻保存，在解冻后进行DNA断裂水平的后续分析。所述精子DNA断裂分析在不同的亚种群(在X-和Y-染色体性别选择后)中进行，同时比较分别每只公牛的等分试样。在姆个实施例中，使用精子-Halomax试剂盒(Halotech DNA, Madrid, Spain)测定DNA断裂。每个精子样品被溶解，然后在载玻片上琼脂糖中制备。所述载玻片然后用SYBR I(Invitrogen,Molecular Probes, Eugene,Oregon)或者 GELRED(Biotium, Hayward,California)染色，使染色质染色，其围绕具有DNA断裂或没有DNA断裂的被溶解的精子分散开。然后具有断裂的DNA片段的细胞和具有完整的DNA的细胞被在每个载玻片上可视化地识别。关于

图1，可见在流式细胞仪中分拣的精子的前向荧光对于侧向荧光(图1A)的图。该图上一个亚种群包含大比率的死亡或染色的精子(图IA中的R2)，其余组包含活精子(在图IA中的Rl)。在商购的流式细胞仪(例如MoFlo SX或者MoFlo SX XDP (BeckmanCoulter, Miami, Florida))上显示的分拣參数的区域，其示出了基于前向突光和侧向荧光的近门精子细胞。图IB示出了在原位荧光显微镜中来自Rl的精子细胞(使用精子-Halomax试剂盒)，其中细胞具有小的紧紧的环表明精子没有经历DNA断裂。在该载玻片上，可见到环绕膜的松散的染色质的单一的精子，表明该精子曾经或正在经历DNA断裂。关于图1C，示出了来自R2的精子，其中几个可见到表明DNA断裂的分散的染色质的宽宽的环。关于图2A和2B，一个亚种群包括主要是死亡的精子(在图2A中的R2)，其余两个组主要由活精子(在图2A中的Rl)亚种群组成，所述活精子亚种群含有X-染色体携帯(在图2B中的R3)和Y-染色体携带(在图2B中的R4)精子，纯度约95%。所述MoFIoSXXDP可以设定R3、R4、和R2中的每个进入分离的容器中，而所述MoFlo SX可以用于从R2精子中分离出Rl精子。样品的性比率纯度使用STS Sexed Semen Purity Analyzer (SexingTechnologies, Navasota, TX)测定,其提供高分辨率峰的X和Y染色体携带的精子种群和和基线，每种分析对于2，000精子。分析和比较所有这些亚种群，分析和比较其DNA断裂水平相对于在分别分拣前的样品(采自在染色和孵育之后但是分拣之前)中获得的水平。在图2A中基于区域2分拣死亡的精子，所有其它的细胞落入这个区域之外。在分拣前精液样品中所述死亡的细胞的比率平均为13%，因此提供了毎秒800至900死亡的精子的平均分拣速度。因此，约85%的精子(含有断裂DNA)通过此过程从初始样品中除去。实验I-进行所述第一实验，以分析DNA断裂的量的差异(在性分拣之前和之后)。精子样品取自5只Jersey公牛，每个样品被平均分成两份试样。试样的第一组被性分拣和冷冻保存。所述试样的第二组被直接冷冻保存。表I示出了 DNA断裂的相对水平(从每只分拣前和分拣后的公牛中获得)。表I (% DNA断裂、性分拣的)
权利要求
1.一种分拣细胞的方法，包括以下的步骤 a.建立精子样品； b.将分子标记运用于所述精子样品； c.单独刺激所述精子样品中的精子； d.监测所述受刺激的精子； e.评估所述精子的DNA断裂特征；和 f.选择富含非-断裂精子的群体。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述分离所述精子的步骤进一步包括下列步骤将所述精子样品分拣成至少第一群体、第二群体和第三群体，其中所述第一群体含有相对于所述初始精子样品的更大的具有DNA断裂的细胞比率，同时相对于所述第二群体和所述第三群体含有更大的具有DNA断裂的细胞比率。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述分离所述精子的步骤进一步包括下列步骤将所述精子样品分拣成第一群体和第二群体，所述第一群体含有的精子具有更高的DNA断裂发生率，所述第二群体含有的精子具有较低的DNA断裂发生率。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一群体包含带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子的约50/50的混合物。
5.如权利要求I所述的方法，其中所述标记包括将所述精子样品染色的荧光染料。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述染色的精子用激光刺激。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述监视DNA断裂的精子的步骤进一步包括检测由受刺激的细胞发射的荧光。
8.如权利要求7所述的方法，其中评估所述精子DNA断裂的步骤进一步包括基于每个细胞发射的荧光来区分DNA断裂特征。
9.如权利要求I所述的方法，进一步包括用第二标记对所述精子样品染色的步骤。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第二标记包括红色食品染料或者碘化丙啶。
11.如权利要求I所述的方法，其中所述分离所述细胞或细胞群体的步骤导致产生至少精子的第一群体和精子的第二群体，其中所述第一群体细胞与所述初始样品和所述第二群体细胞相比有更大的具有DNA断裂的细胞比率。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述精子的第一群体包含被认为是死亡的细胞的细胞，并且其中所述精子的第二群体被认为是有生活力的精子。
13.如权利要求I所述的方法，其中评估细胞或者细胞群体的DNA断裂的步骤包括下列步骤对所述液体样本进行流式细胞分析、光谱测定或者微流体分析。
14.如权利要求I所述的方法，其中所述精子样品包括哺乳动物精子。
15.如权利要求I所述的方法，其中选择的具有较少DNA断裂的精子样品提供改善的生殖力。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述改善的生殖力选自卵裂率、囊胚率、妊娠率和出生率。
17.一种分拣细胞的流式细胞仪系统，包括 a.用于接受精子样品的入口； b.分子标记的一种或组合，其能够识别精子中DNA断裂的水平；C.出口，其用于产生夹带来自所述精子样品的精子的液滴； d.激发装置，其定位以产生经过检查区处流体的照射光； e.检测器，其定位以检测所述标记的辐射能量关联所述检查区的精子DNA的相互影响，产生表征所述检测的相互影响的信号； f.分析仪，其与所述检测器连接以分析所产生的信号； g.与所述分析仪连接的分离器，其用于根据所述产生的信号将所述样品分离成明显分拣的精子群体。
18.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，进一步包括第二标记。
19.如权利要求18所述的流式细胞仪，其中所述第二标记包括红色食品染料或者碘化丙啶。
20.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，进一步包括 a.用于收集分拣的精子的第一群体的第一收集元件；和 b.用于收集分拣的精子的第二群体的第二收集元件。
21.如权利要求20所述的流式细胞仪系统，进一步包括用于收集分拣的精子的第三群体的第三收集元件。
22.如权利要求20所述的流式细胞仪系统，其中所述精子的第一群体比所述样品中的精子具有较少的DNA断裂。
23.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，其中所述标记包括选自下列的一种或多种成分抗体、荧光染料和非-荧光染料。
24.如权利要求23所述的流式细胞仪系统，其中所述荧光染料包括荧色物或者荧光团。
25.—种改善精子样品的生殖力的方法，包括 a.建立精子样品； b.将分子标记运用于所述精子样品； c.单独刺激所述精子样品中的精子； d.监测所述受刺激的精子； e.评估所述精子DNA断裂特征；和 f.选择富含非-断裂和具有改善的生殖力精子的群体。
26.一种辅助生殖过程的改善生殖力的方法，包括 根据权利要求25获得具有改善的生殖力的精子样品；和 使卵子受精。
27.根据权利要求26所述的辅助生殖过程的改善生殖力的方法，其中所述辅助生殖过程选自人工授精、体外受精和胞质内注射。
全文摘要
本发明涉及根据DNA断裂的不同水平对精子样品进行分拣的方法和系统、以及采用具有低水平的DNA断裂的群体来提高辅助生殖过程的生殖力和成功率的方法，所述辅助生殖过程包括人工授精、体外受精、胞质内注射、以及其它相关的技术。
文档编号C12M1/34GK102666841SQ201080048497
公开日2012年9月12日 申请日期2010年10月28日 优先权日2009年10月30日
发明者C·洛佩兹·费尔南德斯, J·格萨维茨, J·莫雷诺, M·埃文斯, M·杰兰德 申请人:英格朗公司