专利名称：制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种制种玉米病害诊断技术和病原鉴定，尤其涉及制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法。
背景技术：
甘肃省以独特的自然条件已成为全国玉米制种大省，随玉米种质资源的广泛引进，新的自交系和杂交种不断问世，危害玉米生产的新病害不断涌现。病害的发生已成为制约着玉米的生产、造成产量降低、品质下降的关键。为此，根据地域特点，加强玉米新病害的研究尤为重要。近几年来，发生在河西走廊制种玉米新病害——玉米裂轴病已成为玉米制种业的严重制约因素，而且还会严重威胁全国玉米的安全生产。玉米裂轴病[Nigrospora oryzae(Berk. et Br.)Petch.]是甘肃省自交系、杂交种玉米发现的新病害，目前对该玉米裂轴病的防治尚无良策，而对症状表现、病原菌鉴定等研究国内尚处空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快捷、方便的制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法。为解决上述问题，本发明所述的制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法，包括以下步骤(1)制种玉米裂轴病的症状诊断分别在制种玉米田苗期——拔节期、抽雄期、穗期、收获期、贮藏期观察叶片、果穗、种子的部位症状表现和病征表现，判定——当玉米苞叶叶尖枯死，苞叶发黄枯死，在果穗和贴近果穗的苞叶内侧有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行间有白色丝状物——即病菌的菌丝体时，即判定为果穗发霉；当脱去玉米籽粒的穗轴发软，剖开所述穗轴后其内侧表面出现黑色霉状物，显微镜检测为病菌菌丝体和分生孢子时，即判定为穗轴发霉；当玉米果穗上形成籽料为20 80粒，且种子表皮皱缩，籽粒无光泽；或籽粒为糠粒，果穗开裂时，即判定为籽料秕瘦；当玉米果穗开裂的籽粒及其籽粒行间有粉末状物质，显微镜检测为黑色分生孢子时，即判定为籽料粉化；当玉米叶片正反面可见黑色煤污状的斑点，随斑点扩大，病斑边缘出现黄色晕圈时，即判定为叶片污斑；(2)制种玉米裂轴病的病原鉴定保湿诱发分离将所述步骤(1)诊断后的新鲜病叶、病粒，剪成30 50mm的小段， 用清水冲冼干净，置于铺有2 3层吸水滤纸或脱脂棉的120mm的培养皿内，盖上皿盖，在 20 25°C保温保湿培养Mh，观察有无菌体生长若有菌丝出现，继续培养2 3天，显微镜检判断是否气生菌丝分枝且有隔当分生孢子梗与菌丝分化不明显，孢梗短，无分枝，单生，具隔，顶端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，顶生分生孢子，圆形或近圆形，初黄褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小为 13. 4 17. 8 μ m 时，即判定为稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch.；若无菌体生长，则采用下述方法进行判定a、组织分离将新发病株或新收玉米种子在无菌条件下，先用体积浓度为75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在质量浓度为0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用无菌水冲洗3遍，最后均勻摆放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培养箱中培养5 7d后观察——呈絮状，初期灰绿色，后期暗绿色至黑色，即得到菌落；其中所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基是指每IOOOml培养基含200g马铃薯、20g琼脂、20g 葡萄糖的培养基；b、病原菌的纯化挑取所述步骤a所得的单个菌落，转接于琼脂平板上培养，待长出分生孢子后，在显微镜下挑取单个分生孢子于斜面所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA 培养基)上，获得单孢培养物；C、致病性测定将所述步骤b所得的单孢培养物用无菌水清洗后，用无菌水配制成浓度为1. 5 X IO6 2. OX IO6个分生孢子/ml的孢子悬浮液；然后将冼净麦粒放入三角瓶中，在压力为1.5磅士0.01磅、温度为120 121°C条件下灭菌30min士aiiin，制成无菌麦粒；在无菌条件下，将孢子悬浮液接种于无菌麦粒上，放入25°C 士2°C恒温培养箱中培养 7 IOd后得到麦粒接菌体；在田间每穴播不同玉米种子2粒，20穴，每项穴接所述麦粒接菌体4g ；同时，用同样方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麦粒接菌体，以不接菌的土壤处理为对照，分不同生育期测定发病症状，若发病特征与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征一致，判定为该菌是引起病害的病原菌；若引起症状与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征不一致，判定为该菌不是引起病害的病原菌；d、病原菌种类的鉴定依据培养性状和显微镜检测、致病性测定结果，即判定为稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。所述步骤中的无菌水是指蒸馏水在压力为1. 5磅、温度为120°C条件下灭菌 30分钟的水。本发明与现有技术相比具有以下优点1、由于本发明采用田间症状观察，观察时期和方式系统，识别关键性特征明显，克服了以往采用一个生育期表现的特征诊断病害而造成误诊的现象，因此，田间症状诊断方法准确、系统。2、由于本发明采用诱发保温培养和组织分离技术，需要时间短，方法简单，易于操作，且能准确的分离得到引起病害的病原菌，分离率较高，因此，病原菌诊断方法简单易操作、快速且准确。3、由于本发明采用麦粒接种体接种，接种材料易获得、易于消毒灭菌、消毒灭菌彻底，接种效率较高，因此为种子带菌检验、土壤带检验、病株残体组织检验提供了较好检验方法。
具体实施方式
制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法，包括以下步骤(1)制种玉米裂轴病的症状诊断分别在制种玉米田苗期——拔节期、抽雄期、穗期、收获期、贮藏期观察叶片、果穗、种子的部位症状表现和病征表现，判定——当玉米苞叶叶尖枯死，苞叶发黄枯死，在果穗和贴近果穗的苞叶内侧有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行间有白色丝状物——即病菌的菌丝体时，即判定为果穗发霉。当脱去玉米籽粒的穗轴发软，剖开所述穗轴后其内侧表面出现黑色霉状物，显微镜检测为病菌菌丝体和分生孢子时，即判定为穗轴发霉。当玉米果穗上形成籽料为20 80粒，且种子表皮皱缩，籽粒无光泽；或籽粒为糠粒，果穗开裂时，即判定为籽料秕瘦。当玉米果穗开裂的籽粒及其籽粒行间有粉末状物质，显微镜检测为黑色分生孢子时，即判定为籽料粉化。当玉米叶片正反面可见黑色煤污状的斑点，随斑点扩大，病斑边缘出现黄色晕圈时，即判定为叶片污斑。(2)制种玉米裂轴病的病原鉴定保湿诱发分离将步骤(1)诊断后的新鲜病叶、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水冲冼干净，置于铺有2 3层吸水滤纸或脱脂棉的120mm的培养皿内，盖上皿盖，在20 25°C保温保湿培养Mh，观察有无菌体生长若有菌丝出现，继续培养2 3天，显微镜检判断是否气生菌丝分枝且有隔当分生孢子梗与菌丝分化不明显，孢梗短，无分枝，单生，具隔，顶端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，顶生分生孢子，圆形或近圆形，初黄褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小为 13. 4 17. 8μπι 时，即判定为稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br.)Petch·。若无菌体生长，则采用下述方法进行判定a、组织分离将新发病株或新收玉米种子在无菌条件下，先用体积浓度为75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在质量浓度为0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用无菌水冲洗3遍，最后均勻摆放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培养箱中培养5 7d后观察——呈絮状，初期灰绿色，后期暗绿色至黑色，即得到菌落。其中无菌水是指蒸馏水在压力为1. 5磅、温度为120°C条件下的高压灭菌锅中灭菌30分钟的水。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)是指每IOOOml培养基含200g马铃薯、20g 琼脂、20g葡萄糖的培养基。b、病原菌的纯化挑取步骤a所得的单个菌落，转接于琼脂平板上培养，待长出分生孢子后，在显微镜下挑取单个分生孢子于斜面马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基) 上，获得单孢培养物。C、致病性测定将所述步骤b所得的单孢培养物用无菌水清洗后，用无菌水配制成浓度为1. 5 X IO6 2. OX IO6个分生孢子/ml的孢子悬浮液；然后将冼净麦粒放入三角瓶中，在压力为1.5磅士0.01磅、温度为120 121°C条件下灭菌30min士aiiin，制成无菌麦粒；在无菌条件下，将孢子悬浮液接种于无菌麦粒上，放入25°C 士2°C恒温培养箱中培养 7 IOd后得到麦粒接菌体；在田间每穴播不同玉米种子2粒，20穴，每项穴接所述麦粒接菌体4g;同时，用同样方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麦粒接菌体，以不接菌的土壤处理为对照，分不同生育期测定发病症状，若发病特征与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征一致，判定为该菌是引起病害的病原菌；若引起症状与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征不一致，判定为该菌不是引起病害的病原菌。 d、病原菌种类的鉴定依据培养性状和显微镜检测、致病性测定结果，即判定为稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。
权利要求
1.制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法，包括以下步骤(1)制种玉米裂轴病的症状诊断分别在制种玉米田苗期——拔节期、抽雄期、穗期、收获期、贮藏期观察叶片、果穗、种子的部位症状表现和病征表现，判定——当玉米苞叶叶尖枯死，苞叶发黄枯死，在果穗和贴近果穗的苞叶内侧有黑色粉末，且果穗籽粒上或者籽粒行间有白色丝状物——即病菌的菌丝体时，即判定为果穗发霉；当脱去玉米籽粒的穗轴发软，剖开所述穗轴后其内侧表面出现黑色霉状物，显微镜检测为病菌菌丝体和分生孢子时，即判定为穗轴发霉；当玉米果穗上形成籽料为20 80粒，且种子表皮皱缩，籽粒无光泽；或籽粒为糠粒，果穗开裂时，即判定为籽料秕瘦；当玉米果穗开裂的籽粒及其籽粒行间有粉末状物质，显微镜检测为黑色分生孢子时， 即判定为籽料粉化；当玉米叶片正反面可见黑色煤污状的斑点，随斑点扩大，病斑边缘出现黄色晕圈时，即判定为叶片污斑；(2)制种玉米裂轴病的病原鉴定保湿诱发分离将所述步骤(1)诊断后的新鲜病叶、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水冲冼干净，置于铺有2 3层吸水滤纸或脱脂棉的120mm的培养皿内，盖上皿盖，在20 25°C保温保湿培养Mh，观察有无菌体生长若有菌丝出现，继续培养2 3天，显微镜检判断是否气生菌丝分枝且有隔当分生孢子梗与菌丝分化不明显，孢梗短，无分枝，单生，具隔，顶端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m， 顶生分生孢子，圆形或近圆形，初黄褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小为13. 4 17. 8μπι时，即判定为稻黑孢菌；若无菌体生长，则采用下述方法进行判定a、组织分离将新发病株或新收玉米种子在无菌条件下，先用体积浓度为75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在质量浓度为0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用无菌水冲洗3遍，最后均勻摆放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C光照培养箱中培养5 7d后观察——呈絮状，初期灰绿色，后期暗绿色至黑色，即得到菌落；其中所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基是指每IOOOml培养基含200g马铃薯、20g琼脂、20g葡萄糖的培养基；b、病原菌的纯化挑取所述步骤a所得的单个菌落，转接于琼脂平板上培养，待长出分生孢子后，在显微镜下挑取单个分生孢子于斜面所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，获得单孢培养物；c、致病性测定将所述步骤b所得的单孢培养物用无菌水清洗后，用无菌水配制成浓度为1. 5 X IO6 2. OX IO6个分生孢子/ml的孢子悬浮液；然后将冼净麦粒放入三角瓶中， 在压力为1. 5磅士0. 01磅、温度为120 121°C条件下灭菌30min士aiiin，制成无菌麦粒；在无菌条件下，将孢子悬浮液接种于无菌麦粒上，放入25°C 士2°C恒温培养箱中培养7 IOd 后得到麦粒接菌体；在田间每穴播不同玉米种子2粒，20穴，每项穴接所述麦粒接菌体4g ； 同时，用同样方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麦粒接菌体，以不接菌的土壤处理为对照，分不同生育期测定发病症状，若发病特征与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征一致，判定为该菌是引起病害的病原菌；若引起症状与制种玉米裂轴病的症状诊断步骤中描述的各生育期表现特征不一致，判定为该菌不是引起病害的病原菌； d、病原菌种类的鉴定依据培养性状和显微镜检测、致病性测定结果，即判定为稻黑孢菌。
2.如权利要求1所述的制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法，其特征在于所述步骤 (2) c中的无菌水是指蒸馏水在压力为1. 5磅、温度为120°C条件下灭菌30分钟的水。
全文摘要
本发明涉及一种制种玉米裂轴病诊断与病原鉴定方法，该方法包括以下步骤(1)制种玉米裂轴病的症状诊断分别在制种玉米田苗期——拔节期、抽雄期、穗期、收获期、贮藏期观察叶片、果穗、种子的部位症状表现和病征表现来进行判定；(2)制种玉米裂轴病的病原鉴定将所述步骤(1)诊断后的新鲜病叶、病粒采用保湿诱发分离的方式来进行判定。本发明简单易操作、快速且准确，克服了以往采用一个生育期表现的特征诊断病害而造成误诊的现象。
文档编号C12Q1/04GK102321727SQ20111028941
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月24日 优先权日2011年9月24日
发明者闫治斌, 雷玉明 申请人:甘肃省敦煌种业股份有限公司玉门市种子公司