专利名称：基于细胞打印和多参数传感阵列集成技术的三维细胞芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物信息技术领域，具体的说，涉及一种新的用多细胞打印技术和多参数传感阵列集成芯片技术构建三维细胞芯片，构建方法及其在高内涵药物筛选中应用。
背景技术：
生命科学、信息科学与制造科学相结合，是二十一世纪科技发展的重要趋势。基于先进制造理论和组织工程理论的细胞三维打印技术，以及基于微加工技术和传感器技术的细胞芯片技术，为组织工程、药物筛选、环境监测等研究领域拓展了新的理论和技术空间。建立在计算机3D建模和先进制造离散堆积理论基础上的细胞三维组装技术， 是在组织器官的解剖学数字模型直接驱动下，定位装配活细胞/材料单元，制造组织或器官的多细胞前体的技术。如哈佛大学Lee W等人开发的3D bio-printer技术， 可喷射细胞和材料，逐层打印纤维原细胞和角质细胞形成多层皮肤结构(Lee W，et al. Biomaterials. 2009 ；30 :1587-95)。南卡罗来纳大学Mironovf F和Clemson大学Boland R等人开发的3D-cell printer技术，通过改装打印机喷头喷射细胞和特殊的基质材料，打印出有活性的三维细胞系统(Zhang C，et al. Biomaterials, 2008 ；29 (28) :3781-91)。亚利桑那大学Smith CM开发的3D bioassembly，基于直写技术组装细胞，并系统研究了各种环境因素对组装细胞的活性影响(Smith CM，et al. Tissue Eng. 2007 ； 13 (2) :373-83)。MIT 的 Vacanti JP和德雷珀实验室Borenstein J等，也以细胞为装配材料，结合芯片制造工艺，制造出微血管系统(Fidkowski C，et al. Tissue Eng. 2005 ； 11 (1-2) :302-9)。国内清华大学颜永年等开发了基于快速成型(RP)原理的细胞三维受控组装技术，组装了能保持3个月活性的人工肝、人工脂肪等组织(Yan YN, et al. Biomaterials. 2005 ；26 (29) :5864-71)。然而，由于器官结构的精细和复杂性，细胞组装技术面对制造肝、肾、心脏等复杂器官还有很多问题亟待解决。与此同时，细胞组装技术由于可以构建复杂的3D细胞培养模型，在生命科学其它领域显示了重要的理论和应用价值。研究者近年来利用组织工程技术制造的三维多细胞体开展研究，取得显著成果。比如普林斯顿大学的Basu S等人，利用人造三维多细胞体，研究了发育生物学的模式建成问题(Basu S，et al. Nature. 2005,28 ； 434(7037) :1130-4)。Hotary KB等利用三维多细胞体，发现MTl-MMP通过改变细胞空间几何形状，影响肿瘤细胞在3D基质中的增殖(Hotary KB,et al. Cell. 2003 ；114(1) :33-45)。 Basu S指出，构造和研究三维多细胞体，可以提高对生物发育和功能的了解，并可应用于生物材料，生物感测研究中。这些研究利用简单的技术构建三维多系统，在生物学和药物筛选等领域取得了有效的成果，证明细胞组装技术在药物研发、细胞芯片领域有重要的研究和应用价值。在药物研发领域，90年代以来全球药物研发机构广泛应用的高通量筛选技术(High-Throughput Screening, HTQ，面临成功率低的困境——筛选出的先导药物多数在整体实验中无药理活性[Bleicher KH, et al. Nat Rev Drug Discov. 2003 ；2 (5) 369-78.]。这是由于整体是多种细胞在三维空间有序排列，细胞间进行信号传导、调控的复杂系统；而HTS技术的基础是研究单个药物靶标分子、单一环境、细胞二维培养。这种差异对细胞结构和功能造成显著影响，Kang X证明相比二维培养，细胞在三维环境中的形态、增殖、分化，基因表达等生理特性存在显著差异[Kang X，et al. Tissue Eng. 2005 ； 11 (3-4) 458-68.]。HTS发展为高成功率的高内涵筛选(High Content Screening, HCS)已成为药物研究领域的共识。HCS的前提是保持细胞结构、功能完整性和同步检测样品对细胞多个生理生化参数的影响。为模拟细胞在体内真实环境，研究者尝试构建三维细胞系统进行药物研究。W. Sun和NASA合作，用Multi-nozzle depositio技术组装细胞，构建了三维的微肝组织，用于药物代谢研究[9]。Horning几等将细胞培养于支架上，建立三维肿瘤模型用于药物筛选，并证明筛选的有效性[Horning 几，et al. Mol Pharm. 2008 ；5 (5) =849-862.]。 这些研究证明，简单的三维细胞培养系统有比二维系统更好的药物评价筛选效果，将进一步推动药物筛选技术的发展。在生物芯片研究领域，将细胞与芯片结合构建细胞芯片用于疾病研究和药物筛选，是当前研究开发的热点。其中以替代实验动物进行药物研发为目标的细胞芯片研究，是高内涵药物筛选技术的重要发展方向，将细胞三维培养系统和芯片技术相结合是该领域研究热点。Kloss D等最近建立了一个底部有电极的微孔阵列芯片，和三维肿瘤细胞微球结合后，成为可以进行肿瘤药物筛选的细胞芯片，这种细胞芯片具备高内涵的药物筛选能力 [Kloss D，et al. Lab Chip. 2008 ；8 (6) :879-84. ]。Minseok S. Kim 开发了整合微流控技术和三维细胞培养的芯片平台，可用于基于细胞效应的化学药物检测[Kim MS,et al. Biomed Microdevices. 2007 ;9 :25-34. ]。Khetani SR等利用半导体微加工技术和细胞三维培养技术，构建符合实现肝组织功能要求的单元阵列，成功用于药物筛选[Khetani SR, et al. NatBiotechnol. 2008 ；26 (1) :120-1 . ]。Khetani SR 指出芯片技术和细胞三维培养技术的结合将能够开发出完整的组织模型，可能最终实现“human on a chip”。这些研究，将简单的三维细胞系统培养到芯片上，已经显示了巨大的研究价值和良好的应用前景。在细胞芯片研究中，基于微电极阵列传感器的细胞电生理检测芯片，已成为后基因时代生物科学研究的重要工具。经典的神经电生理检测方法，采用的微电极信号采集或共聚焦荧光成像方式等进行细胞内记录，存在的问题主要在于用微电极刺入、钳制细胞， 或采用荧光染料成像等方式，都会对细胞造成一定的损害，并导致细胞在较短时间内死亡， 限制了对动作电位及离子通道电流记录的实时检测；同时，可供选择采集信号的细胞数较少。而集成多种传感器的集成型细胞芯片，通过传感器件的网络化和集成化，将细胞的电学信息、化学信息、动力学信息等生理活动信息转换为可检测的信号，并细化为微观信息量进行实时分析，实现快速微量的细胞功能信息和待测物质性质的检测，在细胞生物学、环境监测和药物开发等领域有广泛应用前景。通过以上分析可见，组织工程学的先进技术可应用于其它研究领域取得成果，特别是在细胞芯片和药物筛选研究领域，如果在细胞芯片研究中能准确控制细胞在细胞芯片上的生长位置，并实时检测不同细胞的生理过程和它们间的相互影响；对三维细胞芯片的发展应用，“human on a chip”这样的目标的实现，将产生巨大的推动作用，该技术具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基于细胞打印技术和微电极阵列传感器技术的细
4胞芯片及其在高内涵药物筛选中的应用。本发明所述的细胞芯片，包括细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)和电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System，ECIS)，以及固定在传感器上的具有三维空间结构的细胞组合物，所述的细胞组合物为包括细胞和基质材料的共混物。本发明的细胞芯片中，微电极阵列传感器(Microelectrode Array,MEA)是指在玻璃或硅基底上，用微电子加工技术将Au、Ir或Pt等金属沉积其上形成电极和引线，采用钝化层保护引线，在电极上暴露与细胞接触位点，传输并记录细胞动作电位频率、幅度、波形以及细胞网络间信号传播速度等参数的细胞传感器。具有制作简单、生物相容性佳、可与传统显微镜观察并行使用等优点，目前在细胞传感器研究领域得到了广泛应用。集成芯片上的MEA部分可根据需要设计成任意的m*n阵列(n，m分别为整数)，每排电极直径和电极间距可设计为10-50 μ m，优选为20-30 μ m，基本与细胞大小接近。出于简化设计，本发明设计成3*3阵列，每排电极直径均为30 μ m，尺度基本与细胞大小接近，电极间距也为30 μ m (除左下脚电极因布线原因间距6 μ m)，便于形成一个均一、微型的测试网络单元。由于金属传感点位需暴露出，并和细胞接触用于传感，而金属引线则和外界隔离，所以因在制作工艺允许的条件下，设计出与细胞直径相当的微电极阵列孔，尽量避免几何尺寸对于细胞动作电位和电生理的影响，但引线及焊盘因考虑阻抗因素尽量增大。在本制作过程中，本方法采用标准半导体制作工艺，步骤简述为四英寸硅片(厚度450μπι)经标准清洗后进行初次氧化，厚度1 μ m，以形成一层薄绝缘层；然后在硅片表面溅射一层Cr 薄膜，厚度lOOnm，作为粘附Au的中间层，再磁控溅射Au薄膜，厚度500nm，作为电极层。用 AZ光刻胶S1912光刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将暴露出的金属层刻蚀，电极最小线宽为20 μ m ；刻蚀完成后，采用PECVD在硅片上淀积Si02/Si3N4/Si02绝缘层各500nm，用光刻胶保护后，再用反应离子刻蚀技术(Reactive IonEtching, RIE)刻蚀出电极孔(最小直径 30 μ m)和芯片上的焊点(500 μ m)。ECIS系统是检测细胞在电极表面的贴附、迁移等时的细胞-电极贴附阻抗的变化，一般用交流阻抗谱来表征。本发明芯片中的ECIS系统可设计为叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array, IDA)，也可以设计为圆盘形ECIS，或同时包括IDA和圆盘形 ECIS。优选的ECIS系统为同时包括IDA和圆盘形ECIS。叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array, IDA)可对细胞迁移、繁殖等引起阻抗变化进行测试并分析，属于ECIS中的一种，在细胞阻抗测试时灵敏度较高，可对不同条件中细胞状态进行实时监测。细胞-阻抗电特性分析传感器是主要用于分析不同细胞的电阻变化、膜电容变化、和细胞层-基底膜空间变化的电生理研究仪器。其研究对象主要是肾细胞、上皮细胞、大部分肿瘤细胞等贴壁型细胞，也可用于一些具有电生理活性、能产生动作电位的贴壁型细胞，如心肌细胞等。在本设计中，单个叉指电极的宽度和间距可设计为10_50μπι，优选设计为 20-30 μ m。叉指长度根据器件单元排布设计为2. 4mm,由30对微带电极组成，单个叉指电极有效电极测试区面积约为3mm2，为提高对比度和重复性，同一芯片上设计两对叉指单元。为了减小相邻两电极间的耦合电容等对测量所造成干扰，可选择玻璃或硅基底材料，若同时为了考虑多个传感单元的集成芯片并行设计，可采用硅基底；而为便于细胞观察及提高生物耦合等因素，可采用玻璃基底。本设计中分别采用了两种基底进行了加工制作。使用多层光刻工艺加工电极时，电极表面的叉指对为暴露出的金电极，引线部分除了焊盘外均覆盖了由PECVD技术形成的Si02/Si3N4/Si02的绝缘层，同时需暴露出2对面积分别为8mm2 的有效细胞贴附区。在ECIS系统中，另一种有效的结构是圆盘形结构。圆盘形ECIS是一种能够同时测量多种不同细胞的电阻变化、膜电容变化和细胞层基底膜空间变化的电生理阻抗测试器件。其测试原理主要采用2电极电路，即工作电极和对电极，电极的大小可从微米级到毫米级，用于在电极上贴附多个细胞。当输入某个频率的交流电压，测量输出的交流电流(大小为u A级)，可得到一个交流阻抗值，经过几个小时的阻抗动态变化过程分析，对细胞的生理状态进行定量评估。ECIS圆形电极阵列芯片可根据需要设计成η组(η为整数)，各模块共享参考电极。电极的大小可从微米级到毫米级，例如10 μ m-lmmym,更优选为20 μ m-250 μ m。出于优化设计，本发明将四部分大圆盘电极在空间上进行接地隔离。表1为圆盘电极各部分参数，共为4个具有微阵列点的金圆盘电极。其中圆盘电极1为单个直径1. 5mm的金电极，用于细胞与电极贴附后的初步电生理阻抗测试；圆盘电极2直径1mm，阵列的单个电极点直径为25 μ m，和普通细胞大小10-30 μ m大小相匹配，主要用于测试贴壁性细胞的迁移及电生理活性等动态参数，圆盘电极3和4直径均为1mm，阵列点直径和间距分别为lOOum，250um, 等间隔排布，工作电极表面加工出暴露出与细胞的接触位点，传输并记录细胞的交流阻抗变化，主要用于分析细胞形态、细胞贴附等相对静态参数，并尽量减小相邻电极之间的电场干扰问题。表1. ECIS圆盘电极阵列芯片各模块参数
功能模块组数及功能具体参数1组圆盘电极1用于电极性能、细胞与电极贴有效半径1.5mm(左下1电极)附的初步测试1组圆盘电极2每组4X4阵列微电极阵列直径和间距均为25(左下2电极)用于测试细胞的迁移及活性lam，单圆盘共60个有效阵列点；等动态参数各1组微电极阵列直径和间距分别为圆盘电极3、4用于分析细胞形态、细胞贴附100 μΓΠ禾口 250 μΓΠ;单圆盘电极(左上1、2电等相对静态参数，并尽量减小共16和5个有效阵列点；极)相邻电极之间的电场干扰问题
表2集成芯片各模块参数
权利要求
1.一种细胞芯片，包括细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)和电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System, ECIS)，以及固定在传感器上的具有三维空间结构的细胞组合物，所述的细胞组合物为包括细胞和基质材料的共混物。
2.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于所述细胞芯片上的MEA部分可根据需要设计成任意的m*n阵列(n，m分别为整数)，每排电极直径和电极间距设计为 10-50 μm0
3.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于所述细胞芯片上ECIS系统可设计为叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array, IDA)或圆盘形ECIS，或同时包括IDA 和圆盘形ECIS。
4.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于所述细胞芯片包括1组3X3阵列的 MEA，分布于分布于芯片中心；4组ECIS圆形电极阵列，分布于芯片左边区域；2组ECIS IDA 阵列区域，分布于芯片右边区域，上下对称。
5.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于所述的细胞组合物中细胞为心肌细胞或肾上腺素嗜铬细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于所述的细胞组合物中基质材料为包含明胶和海藻酸钠的共混物，明胶海藻酸钠的配比为1 0.2-1。
7.权利要求1-6任一项所述的细胞芯片，其特征在于所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列(Microelectrode array, MEA)禾口电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System, ECIS)，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列 (Microelectrode array,MEA)表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System, ECIS)表面。
8.根据权利要求7所述的细胞芯片，其特征在于所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)、叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array, IDA)和圆盘形ECIS，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列 (Microelectrode array, MEA)和叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array, IDA)表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在另一区域的叉指型细胞电阻抗分析器件和圆盘形ECIS表面。
9.制备权利要求1-8任一项所述三维细胞芯片的方法，包括如下步骤(1)、将细胞和基质材料混合得到细胞组合物；O)、将细胞组合物经三维受控组装的专用实验系统固定在芯片传感器表面形成具有三维结构的细胞组合物。
10.权利要求1-8任一项所述的细胞芯片在药物筛选中的应用，固定有心肌细胞和肾上腺素嗜铬细胞的细胞芯片可以作为心血管疾病的病理模型，在体外模拟心血管疾病的病理特征，加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的监测数据，通过分析待测药物的药理活性可进行药物筛选。
全文摘要
本发明涉及一种基于细胞打印技术和多传感器集成型芯片技术的细胞芯片技术及其在高内涵药物筛选中的应用。通过在玻璃或硅基底上，用微电子加工技术，构建集成细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)、电阻抗传感器(Eletric Cell-substrate Impedance System，ECIS)包括圆盘型ECIS和叉指型电阻抗分析器(Interdigitated Array，IDA)。通过三个传感单元的阵列化芯片。将不同细胞和特殊的仿细胞外基质材料混合，通过多喷头细胞打印设备定位打印在微电极阵列传感器阵列中的指定位置，构建细胞芯片。通过芯片上的细胞传感器传输并记录细胞动作电位频率、幅度、波形、网络间信号传播速度以及细胞贴附、迁移状态等静态及动态参数。并提供一种应用上述的三维细胞芯片用于药物筛选的方法。
文档编号C12Q1/02GK102382758SQ20111031220
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者徐莹, 徐铭恩, 胡金夫, 葛亚坤, 郭淼 申请人:杭州电子科技大学