专利名称：前列腺癌变前期MSMB的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与前列腺癌前变的mRNA表达改变 (病理演变过程)的相关检测技术。
背景技术：
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近 210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400 多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患者，每年的花费是1. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对 1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以 2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、正常对照)，对MSMB基因与前列腺癌的早期预警进行检测分析。前列腺癌症是性生殖系最常见的恶性肿瘤，据报道仅次于肺癌，在男性是癌症死亡的第二位。随年龄而增长，其发病率有明显的地区差异，欧美地区较高。根据世界卫生组织的数据，每年有近百万人被诊断为前列腺癌患者，是男性中第二常见的癌症。虽然前列腺癌的高发区主要在西方发达国家，但是近些年来，在包括中国在内的发展中国家和地区前列腺癌的发病率也有逐年上升之势。如何更早期筛查前列腺癌变前期的一些有临床意义的 mRNA靶标，明确mRNA与前列腺癌发病机制，是目前临床迫切需要的。PSA血清值目前在美国和全球被视为前列腺癌筛检的标准，不过，虽然PSA筛检已经显着增加了前列腺癌的侦测，但仍有诸多缺点，比如PSA值在良性的男性也会升高，前列腺恶性病灶的专一性较差， 血清PSA会在许多非癌症的情况下增高，从而导致误诊及不必要的活检。据称美国每年有超过一百万男子会做前列腺活检，其中大多数是因为其血清PSA浓度有所增加。研究人员发现，在那些已知血清PSA浓度增加的男性中，在活检之前进行MSMB基因与前列腺癌尿液中降低；尿液中一种蛋白可作为前列腺癌评估的可靠标记物，它优于标准的前列腺特异抗原(PSA)测试。这种名为β-微精液蛋白(MSMB)的蛋白质由正常的前列腺细胞产生，并从精液分泌入尿液，其功能是调节细胞凋亡(程序性细胞死亡)，它和前列腺癌患病风险增加有关。英国癌症研究所科学家牵头的一项多方机构合作研究分析了一群前列腺癌患者的组织、尿液和血液样本。尿液中PSA和MSMB水平由酶联免疫法(ELISA)测定并以肌酐水平为参照进行归一化。其中133名患者的样本被制成组织芯片(ΤΜΑ)，并包含多个核心，分别来自正常/良性区域(>3)、前列腺上皮内瘤(PIN)和每名患者至少两块不同肿瘤区域。用血液样本中提取出的DNA做了基因分型。研究人员测定了 215例无前列腺疾病史男性和89 例前列腺癌男性尿液中的MSMB水平。和前列腺组织中的情形一样，前列腺癌男性尿液中的 MSMB水平明显低于无前列腺疾病史的男性。正常组织或者肿瘤组织并没有显示任何MSMB 着色就意味着组织中MSMB蛋白质水平有高度的前列腺特异性。特别是前列腺周边组织，如尿路上皮组织、精囊和膀胱固有肌层并未显示染色，而相邻的良性前列腺腺体有明显染色。 与尿液中PSA相比，MSMB展示了特异性高和灵敏度高的特点。高风险等位基因携带者的尿液MSMB水平明显低于低风险等位基因携带者。本发明的实施标志了前列腺癌检测技术的一个改进，因为目前的做法仅仅是检测血清中的PSA是否增高。因此需要其它专一性和敏感性较佳的检测方法。MSMB基因是近年来发现的一种前列腺癌发生密切相关的基因，该基因的性活降低和表达量低与前列腺癌的发生、发展有关。将MSMB的mRNA作为早期筛查前列腺癌变前期有非常重要的临床诊断意义。MSMB 的mRNA在前列腺癌变前期及癌变过程中低表达或零表达。他作于前列癌变前期筛查、及前列腺癌术的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特別是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、癌症好发人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的ー贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。目前对MSMB基因的研究都采用高通量基因芯片技术、蛋白检测技木，前者多用于科研方面。而且，蛋白的表达有时与mRNA不同歩，有假阴性现象。根据现有的文献资料MSMB 基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。本发明人在针对创新性发明的要求，设计了不同数据例组(前列腺癌患者、高危人群、正常对照人)例組，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上前列腺癌症病人MSMB基因低表达，高危人群有不同程度表达15-25%，正常人都是高表达。表明MSMB基因前列腺癌变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与細胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技木。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织細胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫細胞化学方法对标记探针进行探測，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有$、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA杂交。 但不论哪ー种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织細胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针(mRNA)和检测的靶mRNA是采用碱基互补(杂交互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响(因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上)。鉴于目前临床上癌症的诊断(影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断)是晚期诊断，治疗也是晩期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技木，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技木。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技木，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。
其次，本发明还要提供上述试剂盒用干与前列腺癌变前期筛查及术复发、转移早期预警相关的原位杂交检测方法。为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下
本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针序列与MSMB基因相同既SEQ ID NO. 1所示序列，基因的核苷酸序列长度是34^p， CDS 1......345bp。本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。本发明的癌变前期MSMB基因筛查试剂盒应用价值在干，能在mRNA水平，对前列腺癌变前期筛查，及癌变后或术后复发、转移、扩散发生预警，进ー步配合临床治疗。本发明还提供ー种MSMB基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤
(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和
(2)检测所述杂交复合体。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16 — 24小吋。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自前列腺癌患者、前列腺癌高危人群、前列腺癌症好发家族、健康人。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的癌症高危人群、癌症好发家族、前列腺癌患者。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以MSMB基因的一级转录功能产物mRNA为检测对象，合成探针是MSMB基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白細胞或组织細胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供MSMB基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人MSMB基因低表达，即小量显色，MSMB基因在癌症病人和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。本发明的一个优选实施例的方案是以MSMB基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点， 还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白細胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的細胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物細胞中的MSMB 基因表达量，用来确定癌变前期的mRNA变化量，预警前列腺癌变是否发生及前列腺癌患者术后是否复发、转移的预测。因为MSMB基因在正常人中低表达，如果MSMB基因表达量高， 说明有患癌的风险，说明癌变已发生，或癌症病人术后已经复发、转移，从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，当检测到MSMB基因的表达量高于正常对照吋，则可预测受试者为前列腺癌变病理过程已发生。本发明具有如下有益效果
本发明的临床意义是更早期跟踪检测前列腺癌变发生和病理演变过程中MSMB基因 mRNA表达量的变化，预警前列腺癌发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与癌症标志物，以及影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因转录的ー级功能产物 mRNA水平检测MSMB基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患ー个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治前列腺癌恶疾。此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同吋，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
图1是本发明MSMB基因原位杂交技术流程图。图2是本发明实施例中前列腺癌症病人MSMB表达降低图片。图3是高危人群和家属史人员图片。图4是本发明实施例中正常人MSMB表达图片。
具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。实施例1
按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以MSMB基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中本实施例的探针标记物选用地高辛。
试剂盒杂交液組成
消化液100 μ L/管1管/盒无色透明液体保护液100 μ L/管1管/盒无色透明液体预杂交液1300 μ L/ 管2管/盒无色透明液体正义杂交液IOuL/t1管/盒无色透明液体反义杂交液IOuL/t1管/盒无色透明液体封闭液1000 μ L/ 管1管/盒无色透明液体碱性磷酸酶抗体1μ!7 管1管/盒无色透明液体显色剂A175 μ L/ 管1管/盒黄色液体显色剂B320 μ L/ 管1管/盒无色透明液体缓冲液I90mL/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液II80mL/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液III2OmL/ 瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液IV90mL/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体固定液90mL/ 瓶1瓶/盒无色透明液体阳性对照标本6片/盒
配制试剂使用浓度
1).将IOX缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成IX缓冲液I；
2).将20X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2 X缓冲液II ；
按1:100稀释成0.2X缓冲液II ；按1:200稀释成0. IX缓冲液II ；
3).将10X缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1X缓冲液III ；
4).IOX缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10!11レ加水至IOOmL既可)。 实施例2
应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本MSMB基因表达量的实施过程
1).取待测标本两张；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μ L加IX缓冲液I 99. 9ml，即为使用浓度)50 ml，37°C水浴预热lOmin，放进16张玻片，37°C处理12 min,再用IX缓冲液I洗5min ；
3).用0.2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I，99ml即为使用浓度)洗
IOmin,三蒸水洗5min (以上过程都在玻璃缸进行)，取出玻片，让其自然干燥；
4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中汕以上；
5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%、90%、95%的乙醇各洗aiiin， 取出，自然干燥；
6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μ L/片，另一张加反义杂交液25 μ L/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内
在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，毎次15min ； 在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，毎次15min ； 在42°C恒温水浴箱中用0. IX缓冲液II洗两次，毎次15min ；
8).用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·将玻片放入保湿盒内，加0. 5%封闭液(Iml封闭液加5ml 1 X缓冲液III) 100 μ L/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。(此步骤不需加盖玻片)；
10).取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；
11).将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1 χ缓冲液III) 100 μ L/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性(此步骤不需加盖玻片)；
12).取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，毎次15min;
13).用IX缓冲液IV洗anin，加显色剂(显色剂A73.3yL，显色剂B157. 5yL加到 30mL IX缓冲液IV中，混勻)，室温避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白細胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的細胞数，判断目的基因的表达量。前列腺癌病人20名，高危人群(前列腺增生)20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白細胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者MSMB基因表达降低，細胞染色浅或无染色；高危人群和家属史人员表达降低，小数染色；正常对照组MSMB 基因表达高，細胞多数染色具体结果见图2、图3、图4。
权利要求
1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO. 1所示的序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6.一种MSMB基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16 - 24小时。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本和尿液细胞标本。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液白细胞标本选自前列腺癌患者、高危人群、正常人标本。
10.MSMB基因在制备检测前列腺癌病变原位杂交试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与前列腺癌早期病理演变有密切相关的β-微精液蛋白(MSMB)基因与的mRNA方法，包括以下步骤(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测MSMB基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102559885SQ20111044299
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者张云福, 张玉丽, 裘建英, 裘霖 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司