专利名称：一种体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物力学工程研究领域，即涉及一种能够对两种细胞进行共培养且同时对两种细胞加载剪切应力的流动腔装置。
背景技术：
生物力学作为一门新兴的交叉领域学科，越来越受到国内外科学界的重视，流动腔也作为一种力学加载装置被广泛应用于体外流动环境中的细胞力学研究中。最初的稳定流流动腔是由 Frangos、Eskin 等人设计(Eskin SG, Ives C L, Mcintire LV, et al. Response of cultured endothelial cells to steady flow[J]. Microvasc Res,1984, 28 :87-94 ；Frangos JA, Eskin SG, Mcintire LV, et al. Flow effect on prostacyclin production by cultured human endothelial cues[J]. Science, 1985, 227 1477-1479.), 在早期研究当中，科学家所使用的流动腔均为这种单流道平行平板流动腔。近十几年来，普通的单流道平行平板流动腔已不能完全满足实验的需要，各种用于不同实验需求的流动腔开始出现。如美国乔治亚工学院生物力学实验室Helmlinger G 等人设计的脉动流输入式流动腔(Helmlinger G，Geiger RV, Schreck S，et al. Efects of pulsatile flow on cultured vascular endothelial cell morphology[J]. ASME J Biomech Engr，1991，113 :123-131.)、中国科学院力学研究所钱民全等人改进的体外细胞培养平行圆板流动腔(申请号01231650. 4)及体外细胞培养装置中的非平行平板流动腔 (申请号01231652. 0)。但这类流动腔仍然为单流道流动腔，仅能满足体外培养一种细胞的要求。随着应用基础科学的不断深入发展，为更好的研究细胞的代谢途径，科学家们越来越重视不同种细胞系在同一环境下共培养时之间的相互影响，例如内皮细胞与肌细胞的共培养(Agelikie G, Vouyouka,Lifeng Lin,et al. Pressure and endothelial coculture upregulate myocytic Fas-FasL pathway and induce apoptosis by way of direct and paracrine mechanisms[J]. The American Journal of Surgery，2005，190 :780-786.)，因此共培养流动腔装置也逐渐被科学家们所重视，并出现多种形式。目前可用于细胞共培养的流动腔例如G.Ed Rainger等人设计的共培养流动腔(G.Ed Rainger, Philip Stone, Clare MM, et al. A novel system for investigating the ability of smooth muscle cells and fibroblasts to regulate adhesion of flowing leukocytes to endothelial cells [J],Journal of Immunological Methods,2001, 255 :73-82. ), VX R Gianni Ciofani ,Antonio Migliore 等人设计的动态培养双腔室(Gianni C, Antonio Μ, Vittoria R, et al.Bicompartmental device for dynamic cell coculture :design, realisation and preliminary results[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2008, 105(5) :536-544.)等。但是上述两种流动腔多少存在缺陷。G. Ed Rainger等人的共培养流动腔仅能针对内皮细胞一种细胞施加剪应力，适用范围窄，具有科研局限性，且不能实现两种细胞的同时受载；Gianni Ciofani等人的动态培养双腔室可以满足两种细胞的动态共培养，但其双腔室主要是为研究药物代谢动力学、分子生物学及药物传递实验等生化医学领域所设计，仅能实现低液流共培养，宽高比小，液流剪切力小、腔室内细胞培养底层流速缓慢，不能实现对生物力学中对细胞施加机械载荷的要求。另外所有的装置均不能进行功能扩展。
发明内容本发明的目的在于提供一种体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置。用于两种细胞在同一环境中的共同受剪切培养，其特征在于包括螺旋盖板盖于玻璃盖板之上，用于压紧玻璃盖板；玻璃盖板与流动腔体基座上的0型圈紧密贴合，用于保证流动腔内部的无菌状态，并便于观察；流动腔体基座用于安装密封圈，放置培养细胞的下层载玻片、放置共培养嵌套块，安装左右接头并与灌流系统相连；左右接头使用生胶带密封管螺纹，用于连接流动腔装置与灌流系统；流动腔共培养嵌套块可拆卸，上部用于放置培养细胞的上层载玻片并形成上部流动槽，底部的流动槽用于形成下层细胞的流动槽，前后两侧打有螺纹通孔，用于安装定位长螺钉；固定块用于固定载玻片。本实验装置操作便捷，简化了在细胞实验过程中的流动腔安装步骤，可提高工作效率；本装置可高压灭菌，保证在体外细胞培养的同时完全无污染；流动腔装置几何参数精度高、准确度好；体外细胞在加载力之前可单独培养，不受实验装置的限制，且加载于装置上时细胞受力均勻，边界效应小；在本装置中能够实现在体外同一环境下共培养两种不同细胞，研究细胞之间的相互作用；能够利用双流道实现对共培养细胞同时施加剪切力。为达到以上目的及功能，本发明采用的技术方案是这样实现的本发明提供的流动腔装置主要包括五大部分，即螺旋盖板、玻璃盖板、流动腔体基座、左右接头及流动腔共培养嵌套块。螺旋盖板1盖于玻璃盖板之上，用于压紧玻璃盖板，螺纹设计使得安装便捷， 提高工作效率。玻璃盖板2位于流动腔体基座5上方，与流动腔体基座上的0型圈3紧密贴合，保证内部流动腔共培养嵌套块部分的无菌状态，并有利于观察内部流动腔工作状况。流动腔体基座上部为内螺纹，螺旋盖板拧于其上；基座上表面开有环形槽，用于安装0型圈， 与玻璃盖板相接触，密封内部腔体；内部下表面开有载玻片嵌入槽，用于放置接种细胞后的下层载玻片；流动腔体基座内部前后两侧还打有两个圆柱形定位孔，用于定位共培养嵌套块；基座两侧开有流体输入输出通道，与左右接头7管螺纹连接，利用生胶带密封连接处的管螺纹，保证接头在与基座螺纹连接后的系统密封，防止液流系统循环时漏液或细菌污染。 流动腔体基座通过接头与灌流系统相连。流动腔共培养嵌套块6上部开有载玻片嵌入槽及流动腔体槽，用于放置接种细胞后的上层载玻片，利用流动腔体槽对细胞施加剪切应力；底部开有下层流动腔槽，用于对下层载玻片上的细胞施加剪切应力；流动腔共培养嵌套块前后两侧打有螺纹通孔，用于安装定位长螺钉8，使流动腔共培养嵌套块定位到流动腔体基座的确定位置；流动腔共培养嵌套块可拆卸，以供以后功能扩展时按不同使用要求进行局部改装；流动腔共培养嵌套块在液流方向分别削平，以使得液体流入后可有一个分流前的缓
4冲腔；流动腔共培养嵌套块上宽下窄，便于安装，且在侧缘贴有硅胶膜9，防止液体从两侧流出，用于密封。流动腔共培养嵌套块与流动腔体基座组装后共同构成两个流动腔腔室，通过缓冲腔的液体流过两腔时分流，形成两条相同的流道。根据流动腔特征，需要保证流动腔内宽高比远大于1，我们设计上下两流动腔宽均为30mm，高均为0. 5mm，满足流动腔力学实验要求。在流动腔共培养嵌套块和基座的载玻片槽长轴方向两侧，分别各开有两个固定块槽，并打有螺纹孔，用于安放带有螺钉的固定块4，固定载玻片使其在受剪切应力时不会因流体作用发生位移。本发明提供的流动腔装置通过与灌流系统相连，当细胞处于充满培养液的流动腔内，在不受到剪切应力作用的静置培养环境中时，装置上下两层流动腔两侧的缓冲腔及两流动腔内均充满培养液，可使细胞释放的分子在腔体内的培养液中垂直弥散，扩散距离小， 以达到共培养的目的。当两种细胞在受剪切力作用时，其释放的分子及代谢产物随灌流液一同进入灌流系统，并通过灌流系统的循环作用再次回流至流动腔内。通过灌流液垂直扩散及液流循环作用，可研究两种细胞在加载机械力后的培养过程中释放的分子及代谢产物对细胞产生的相互影响。本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是1.本发明操作便捷，简化了在细胞实验过程中的流动腔安装步骤，提高工作效率， 保持细胞活性，装置可控性强，实验稳定性好；2.本装置采用铝合金或不锈钢及玻璃为材料，可高压蒸汽锅及紫外线灭菌，保证在体外细胞培养的同时完全无污染，流动腔尺寸精度高、准确度好；3.能够实现在体外同一环境下共培养两种不同细胞，研究细胞之间的相互作用， 且加载于装置上时细胞受力均勻，边界效应小；4.通过双流道能够实现对共培养细胞同时施加剪切力，剪切力大小通过相连的灌流系统进行控制；5.上下两层的双腔设计可使共培养细胞释放的分子及代谢产物垂直弥散，在受到剪切应力作用时通过液流循环传递，可使得细胞间的相互影响迅速且直接。6.流动腔主要操作部分可拆卸，在以后做功能扩展或腔体改造时可单独加工。本发明提供了一种可在同一环境下体外共培养两种不同细胞，同时对两种细胞施加大小相同的双剪切应力的流动腔装置。可用于研究探索不同细胞之间的相互作用，更好的模拟人体生理环境内细胞受力关系，探究细胞间相互联系，具有创新性及较大的科研推广和应用前景。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是体外细胞共培养双流道流动腔装置结构立体示意图；图2是体外细胞共培养双流道流动腔装置结构主剖视图；图3是体外细胞共培养双流道流动腔装置结构侧剖视图；图4是本发明装置具体实施方式
示意图。
具体实施方式
[0029]按照附
图1、附图2所示加装流动腔装置。附图中流动腔装置包括1螺旋盖板，2 玻璃盖板，30型圈，4固定块、5流动腔体基座、6流动腔共培养嵌套块、7左右接头、8定位长螺钉、9密封用硅胶模。工作前加装时，先放入需受剪切应力的接种有细胞系A的下层载玻片，利用固定块固定后将流动腔共培养嵌套块嵌入至流动腔体基座上，利用定位长螺钉在基座上固定，将定位长螺钉拧紧后再放入需受剪切应力的接中有细胞系B的上层载玻片， 利用固定块固定，再按照图示分别将0型圈、玻璃盖板、螺旋盖板安装于流动腔体基座上， 完成流动腔的加装。接头在装载装置前可事先安装于基座之上，与基座做为一个整体高压灭菌，减少安装步骤。实施例1平行平板流动腔中，剪切力、循环液流量、循环液粘度和流室尺寸大小的关系为 τ = 6μ QF/WH2。F取决于流室宽高比(W/H)，当W/H >> 1时，F 1。其中，τ为流室底面剪应力 (dyn/Cm2)，Q为流量(cm3/s) ； μ为灌流液粘度(dyn -s/cm2) ；H为流室高度(cm) ；W为流动腔宽度(cm) ；L为流室长度(cm)。本系统中，培养基含有10% FBS，灌流液粘度μ为动力粘度，取值0. 013dyn*s/cm2。实验中流室的尺寸W = 3cm，H = 0. 05cm，流室长度L = 8.8cm。 当剪应力 τ = 15dyn/cm2 时，Q = τ ffH2/6 μ F ^ 1. 44cm3/s = 86. 53ml/min。雷诺数Re是反映流体流动特征的无量纲数.表示惯性力与黏性力之比Re = VHP/μ。其中V为腔内流体平均流速(cm2/S)，P为循环液密度(g/cm3)，取为lg/cm3。在腔体入口处的平均流速V = Q/(WH) = 9. 6cm/s，在本发明实验条件下，Re = 37.满足层流流动“低雷诺数”的要求，即Re <临界雷诺数2000。在系统工作时，流动腔内不会出现湍流等复杂液流环境，符合培养细胞所需的剪切应力条件。如附图3所示，将本系统的流动腔装置I和灌流瓶装置II置于(X)2恒温培养箱 V中，由恒流蠕动泵III将细胞培养液从灌流瓶II中泵出，经过控制培养液流量的节流阀 IV后，通过流动腔内的入口处缓冲腔分流，流入双流道流动腔内，对上下两层细胞系A、B实施剪切应力，流过的培养液再通过出口处的缓冲腔液流汇合，流出后回流至灌流瓶装置II 中，如此循环。灌流瓶装置II开有连通(X)2恒温培养箱的气口，以便保持整个系统处于5% CO2细胞培养环境内。节流阀IV可以调节系统液流流量，进而控制流动腔内的剪切应力大小。当细胞处于充满培养液的流动腔内，在不受到剪切应力作用的静置培养环境中时，装置上下两层流动腔两侧的缓冲腔及两流动腔内均充满培养液，可使细胞释放的分子在缓冲腔内的培养液中垂直弥散，并进入与缓冲腔相同的两流动腔室内。分子及代谢产物的扩散距离小，从而达到共培养目的。当两种细胞在受剪切力作用时，其释放的分子及代谢产物随灌流液一同进入灌流系统，并通过灌流系统的循环作用再次回流至流动腔内，以达到共培养和双剪切两种效果。通过灌流液垂直扩散及液流循环作用，即可研究两种细胞在加载机械力后的培养过程中释放的分子及代谢产物对细胞产生的相互影响。
权利要求1.一种体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，用于两种细胞在同一环境中的共同受剪切培养，其特征在于包括螺旋盖板盖于玻璃盖板之上，用于压紧玻璃盖板；玻璃盖板与流动腔体基座上的0型圈紧密贴合，用于保证流动腔内部的无菌状态，并便于观察；流动腔体基座用于安装密封圈，放置培养细胞的下层载玻片、放置共培养嵌套块，安装左右接头并与灌流系统相连；左右接头使用生胶带密封管螺纹，用于连接流动腔装置与灌流系统；流动腔共培养嵌套块可拆卸，上部用于放置培养细胞的上层载玻片并形成上部流动槽，底部的流动槽用于形成下层细胞的流动槽，前后两侧开有螺纹通孔，用于安装定位长螺钉；固定块用于固定载玻片。
2.根据权利要求1所述的体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，其特征在于螺旋盖板采用螺纹结构。
3.根据权利要求1所述的体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，其特征在于玻璃盖板盖于流动腔体基座之上。
4.根据权利要求1所述的体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，其特征在于流动腔体基座上部为内螺纹，螺旋盖板拧于其上；基座上部表面开有环形槽，用于安装0型圈，与玻璃盖板相接触；下表面开有载玻片嵌入槽，用于放置接种细胞后的下层载玻片；流动腔体内部前后两侧打有两个圆柱形定位孔，用于定位共培养嵌套块；基座两侧开有流体输入输出通道，与左右接头螺纹连接，连通灌流系统，左右接头与流动腔体之间通过管螺纹连接。
5.根据权利要求1所述的体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，其特征在于，流动腔共培养嵌套块上部开有载玻片嵌入槽及流动腔体槽，用于放置上层接种细胞的载玻片，且利用流动腔体槽对细胞施加剪切应力；底部开有下层流动腔槽，用于对下层载玻片上的细胞施加剪切应力，根据流动腔特征，保证流动腔内宽高比大于1，上下两流动腔宽均为30mm，高均为0. 5mm ；流动腔共培养嵌套块前后两侧打有螺纹通孔，用于安装定位长螺钉，使流动腔共培养嵌套块定位到流动腔体基座的确定位置；流动腔共培养嵌套块可拆卸。
6.根据权利要求1所述的体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置，其特征在于流动腔共培养嵌套块上部的固定块槽中打有螺纹通孔，用于安放带有螺钉的固定块。
专利摘要本实用新型提供一种体外细胞共培养双流道机械力加载流动腔装置。该装置主要包括五大部分螺旋盖板、玻璃盖板、流动腔体基座、左右接头及流动腔共培养嵌套块。螺旋盖板于玻璃盖板之上，压紧玻璃盖板。玻璃盖板位于流动腔体基座上方，用O型圈密封，保证内部无菌。流动腔体基座上表面开有环形槽，用于安装O型圈；其内部前后打有定位孔，用于定位共培养嵌套块；基座两侧开有流体通道，连通灌流系统。左右接头与腔体通过管螺纹连接。共培养嵌套块上部开有载玻片嵌入槽及流动腔体槽，放置上层载玻片；底部开有下层流动腔槽，放置下层载玻片。流动腔装置与灌流系统相连，细胞处于流动腔内，释放的分子在培养液中垂直弥散，扩散距离小，达到共培养的目的。
文档编号C12M3/00GK202175680SQ201120153530
公开日2012年3月28日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年4月18日
发明者吴欣童, 孙联文, 杨肖, 梁萌 申请人:北京航空航天大学