专利名称：使用稀脉萍的koda 的制造方法
技术领域：
本发明涉及具有以下的式⑴所示的结构的植物激素(通用名9_羟基-10-氧代-顺式-12 (Z)，15 (Z)-十八碳二烯酸，以下称为K0DA)的制造方法。
/WWY1AZWcooh
O OH
背景技术：
KODA作为具有植物花芽形成促进作用、植物激活作用及包含这些作用的植物生长 调节作用的植物激素(日本特开平9-295908号公报、日本特开平11-29410号公报、日本特开2001-131006号公报、日本特开2009-17829号公报)已知。KODA已知存在于各种植物种中，且已知受到胁迫的稀脉萍(Lemna paucicostata)与其他植物相比释放出极高的水平(数百倍)的K0DA。利用该性质，可使用由作为浮萍科植物的一种的稀脉萍提取得到的提取法来制造K0DA。作为其他的制造方法，可使用以下方法制造KODA :通过使9位生成物特异性脂加氧酶(LOX)、丙二烯氧化物合酶(AOS)这样的酶，按照植物体内的脂肪酸代谢途径作用于作为不饱和脂肪酸的α -亚麻酸(通用名顺式-9，12，15-十八碳三烯酸)而获得的酶法；以及通过运用通常公知的化学合成法来获得的化学合成法。这些制造方法在日本特开平11-29410号公报中公开。KODA是具有植物生长调节作用的植物激素，因此期待在农业领域的使用。在农业领域使用时，与药品等领域不同，如果不能够以低成本进行大量生产，则不耐实用。在使用α -亚麻酸作为起始物质的酶法中，如以下记载的那样，以α -亚麻酸作为底物，使9位生成物特异性脂加氧酶(LOX)作用，在9位导入氢过氧基(-00Η)，接着通过使丙二烯氧化物合酶(AOS)作用，从而制造K0DA。/\=/w/\=yvwAcooH
LOX
I
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OOH
AOS
Λ=Λ^\..7ΛΛΑ/λοοοη
of 非酶的转换
~^VWa COOH O OH但是，9位生成物特异性脂加氧酶不能商业获得，由植物提取则材料的获得和/或处理非常费工夫，另外目前为止已知的9位生成物特异性脂加氧酶活性低。进而，目前为止得到的9位生成物特异性脂加氧酶的cDNA以大肠杆菌表达时，多为不溶性，难以大量获得显示活性的蛋白质。丙二烯氧化物合酶是具有将氢过氧化的脂肪酸转换为丙二烯氧化物的活性的酶，丙二烯氧化物不稳定，因而非酶地转换为酮醇体。AOS是存在于植物、动物及酵母中，在植物中则存在于全部被子植物中的酶。但是，丙二烯氧化物合酶通常具有自杀底物的性质，提高底物的浓度时，反而导致生成量的减少。由于这些脂加氧酶、丙二烯氧化物合酶的缺点，酶法对于大量生产不合适。另一方面，通过化学合成法难以实现农业领域所需的低成本。另一方面，在现有的提取法中，通过培养已知以高效率生产花芽诱导物质的稀脉萍441株来进行提取法，但即使在使用该株的情况下，所生产的KODA的量也不能说充分。因此，期望提供低成本且大量地制造KODA的方法。
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的在于提供在收量的方面被改良了的KODA的制造方法。用于解决课题的方法本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，筛选了各种稀脉萍株，结果发现，与其他的稀脉萍株相比，稀脉萍SH株生产极高的水平的K0DA。发明的效果根据上述的发现，本发明者们提供以下方法在基于提取法的KODA的制造方法中通过将稀脉萍SH株作为起始物质，从而以高收量制造KODA的方法。进而本发明者们着眼于作为KODA高生产株的稀脉萍SH株的代谢途径，在稀脉萍中以9位生成物特异性脂加氧酶的基因序列(序列号I)、以及丙二烯氧化物合酶的基因序列(序列号2)为首进行了鉴定。该序列号I及序列号2的碱基序列都是来自于稀脉萍SH株的序列。因此本发明者们提供以下方法在基于提取法的KODA的制造方法中，通过使用含有由包含序列号I和/或序列号2所示的序列的DNA、或与该DNA实际上相同的DNA组成的基因的稀脉萍株，从而以高的收量制造KODA的方法。本发明进一步提供通过使用了以上记载的KODA高生产稀脉萍株的制造方法生产的 KODA。
图I是显示62种稀脉萍株的KODA生产量的图。
图2A是显示稀脉萍SH株的LOX基因的基因序列的图。图2B是显不图2A的基因序列的继续的图。图2C是显示图2B的基因序列的继续的图。图3A是显示稀脉萍SH株的AOS基因的基因序列的图。图3B是显示图3A的基因序列的继续的图。图3C是显示图3B的基因序列的继续的图。图4是显示大肠杆菌中表达的稻L0X(r9_L0X)与稀脉萍SH株的LOX的活性的比较图。图5是显示大肠杆菌中表达的拟南芥AOS与稀脉萍SH株的AOS的活性的比较图。
具体实施例方式本发明的生产KODA的方法包括以下工序对KODA高生产性的特定的稀脉萍株施加胁迫，从该受到胁迫的稀脉萍株中溶剂提取K0DA，然后纯化。在本发明的一种方式中，本发明中所使用的KODA高生产性的特定的稀脉萍株是表达以下蛋白质的株，所述蛋白质由与包含序列号I所不的喊基序列的DNA相同或实际上相同的DNAJP /或与包含序列号2所示的碱基序列的DNA相同或实际上相同的DNA编码。进而，本发明中使用的KODA高生产性的特定的稀脉萍株是表达与包含序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质相同或实际上相同的蛋白质、和/或与包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质相同或实际上相同的蛋白质的株。序列号3是来自于稀脉萍SH株的9位生成物特异性脂加氧酶的氨基酸序列，序列号4是来自于稀脉萍SH株的丙二烯氧化物合酶的氨基酸序列。KODA在植物中由亚麻酸受到LOX及AOS的作用而生成，因此，认为表达与KODA高生产性的稀脉萍SH株所具有的LOX和/或AOS相同或实际上相同的LOX和/或AOS的株，KODA的生产性与稀脉萍SH株同样地高。在这里，“实际上相同的DNA”，是指对于参考基准的DNA，具有至少70%的同一性，而且在被转录·翻译的情况下，编码具有与参考基准的DNA被转录·翻译而生成的蛋白质的酶活性(包含序列号I的碱基序列的DNA的情况下为LOX活性，包含序列号2的碱基序列的DNA的情况下为AOS活性)相同的酶活性的蛋白质的DNA。同一性优选为至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、至少99. 5%或至少 99. 9%0另外，“实际上相同的DNA”，是指可在高严格的条件下与包含参考基准的DNA的互补碱基序列的DNA杂交，且编码具有与由参考基准的DNA编码的蛋白质的酶活性(包含序列号I的碱基序列的DNA的情况下为LOX活性、包含序列号2的碱基序列的DNA的情况下为AOS活性)相同的酶活性的蛋白质的DNA。杂交可按照公知的方法或根据该公知的方法的方法，例如 J. Sambrook等，Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989记载的方法来进行，另外作为高严格的杂交条件，是指包含例如NaCl浓度为约10 40mM、优选为约20mM，温度为约50 70°C、优选为约60 65°C的条件。进而，本发明还涉及作为上述DNA序列的片段、并编码具有由原DNA编码的蛋白质的酶活性的蛋白质的DNA片段。所谓“实际上相同的蛋白质”，是指包含在参考基准的蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I或数个氨基酸的氨基酸序列，并且具有参考基准的蛋白质的活性的蛋白质。进而，所谓“实际上相同的蛋白质”，是指包含与参考基准的氨基酸序列具有至少98%的同一性的序列，并且具有参考基准的蛋白质的活性的蛋白质。同一性优选为至少99%、至 少99. 5%、或至少99. 9%。本发明的KODA的制造方法利用提取法。具体地说，将稀脉萍的破碎物进行离心分离(8000Xg，10分钟左右)，在得到的上清和沉淀物中，将除去上清后的级分作为含有KODA的级分用于下面的工序。可将该级分作为起始物来分离 纯化K0DA。为了促进利用稀脉萍的KODA的生产，优选在进行离心分离前对稀脉萍施与以下说明的特定的胁迫。另外，进而作为在制备效率上优选的起始物，可举出使稀脉萍漂浮或浸溃后的水溶液。该水溶液只要在稀脉萍可生长的范围内则没有特别限定。该水溶液的具体例在后述的实施例中记载。浸溃时间可以在室温下为2 3小时左右，但没有特别限定。另外，通过该方法制备KODA时，在制造效率上优选预先对于稀脉萍施与可诱导KODA的特定的胁迫。具体地说，作为特定的胁迫可举出干燥胁迫、热胁迫、渗透压胁迫等。干燥胁迫可以如下施与例如在低湿度(优选相对湿度为50%以下)、室温下，优选24 25°C左右，将稀脉萍以在干燥的滤纸上展开的状态放置。该情况下的干燥时间大概20秒以上，优选为5分钟以上，更优选为15分钟以上。热胁迫可以通过例如在温水中浸溃稀脉萍来施与。该情况下的温水的温度为40V 65°C，优选为45 V 60°C，更优选为50°C 55°C。另外，温水中处理的时间大概5分钟左右就足够，在比较低温的情况下，例如在40°C左右的温水中处理稀脉萍的情况下，优选处理2小时以上。另外，上述热胁迫处理后，优选迅速将稀脉萍放回冷水中。渗透压胁迫可以通过例如使稀脉萍接触高浓度的糖溶液等高渗透压溶液来施与。该情况下的糖浓度，例如在甘露醇溶液的情况下，为O. 3M以上，优选为O. 5M以上。处理时间例如在使用O. 5M甘露醇溶液的情况下，为I分钟以上，优选为3分钟以上。这样可以制备所需的本发明的含KODA的起始物。接着，可以对如上述制备的起始物进行如以下那样的分离 纯化方法，从而制造所需的K0DA。另外，这里所示的分离方法为例示，用于由上述起始物制造KODA的分离方法并不限于这些分离方法。首先，对于上述起始物进行溶剂提取，优选提取含有本发明KODA的成分。对该溶剂提取中使用的溶剂没有特别限定，可使用例如氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丁醇等。这些溶剂中，在能够比较容易地除去杂质这样的方面，优选氯仿。将该溶剂提取所得的油相部分，使用通常公知的方法进行洗涤、浓缩，通过使用ODS (十八烷基硅烷)柱等反相分配柱色谱用柱的高速液相色谱(HPLC)，鉴定、分离花芽诱导活性级分，由此分离本发明K0DA。另外，还可根据起始物的性质等组合使用通常公知的其他分离方法，例如超滤、凝胶过滤色谱等。实施例实施例I :K0DA高牛产稀脉萍株的筛诜准备从各种场所采集的62种稀脉萍，在稀释为1/2倍的Hunter培养基中，在来自于24 25°C的日光色荧光灯的连续光照射下进行传代培养。稀释为1/2倍的Hunter培养基包含以下的成分
权利要求
1.一种以下式所示的化合物的生产方法，,K^xWYYVVVncoohO OH 所述方法包括以下工序对稀脉萍株施加胁迫，由施加了该胁迫的稀脉萍株溶剂提取上述化合物，然后纯化， 其中，所述稀脉萍株的特征在于，表达由选自下述(a) (e)中的DNA编码的蛋白质和/或由选自下述(i ) (V )中的DNA编码的蛋白质， (a)包含序列号I所不的喊基序列的DNA； (b)与含有包含序列号I所示的碱基序列的DNA的互补碱基序列的DNA在高严格的条件下杂交，且编码9位生成物特异性脂加氧酶活性体的DNA ； (c)编码包含序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA； (d)编码包含与序列号3所示的氨基酸序列具有至少99%的同一性的序列，且具有9位生成物特异性脂加氧酶活性的蛋白质的DNA ； (e)编码包含在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了I或数个的氨基酸的氨基酸序列，且具有9位生成物特异性脂加氧酶活性的蛋白质的DNA ； (i )包含序列号2所不的喊基序列的DNA ； (ii )与包含序列号2所示的碱基序列的DNA具有至少90%的同一性，且编码丙二烯氧化物合酶活性体的DNA ； (iii )与含有包含序列号2所不的喊基序列的DNA的互补喊基序列的DNA在闻严格的条件下杂交，且编码丙二烯氧化物合酶活性体的DNA ； (iv )编码包含序列号4所不的氣基酸序列的蛋白质的DNA ； (V )编码包含在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I或数个的氨基酸的氨基酸序列，且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质的DNA。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述稀脉萍株表达由包含序列号I所示的碱基序列的DNA编码的脂加氧酶和由包含序列号2所示的碱基序列的DNA编码的丙二烯氧化物合酶。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，所述胁迫选自干燥胁迫、热胁迫和渗透压胁迫。
4.根据权利要求I 3的任一项所述的方法，其中，所述溶剂选自氯仿、乙酸乙酯、乙醚和丁醇。
全文摘要
鉴别来自于稀脉萍SH株的新的脂加氧酶及新的丙二烯氧化物合酶的基因，使用表达该脂加氧酶及丙二烯氧化物合酶的稀脉萍株，以高的收量制造植物生长调整剂(KODA)。
文档编号C12P7/40GK102834522SQ20118001336
公开日2012年12月19日 申请日期2011年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者横山峰幸, 别府敏夫 申请人:株式会社资生堂