专利名称：一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星dna方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星 DNA方法。
背景技术：
微卫星DNA又称简单序列重复(simple sequence r印eat，SSR)，其具有高水平的杂合性和突变率、双亲遗传模式等优势，已经被广泛用于基因定位、种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传图谱构建、品种鉴定以及进化分析等研究(见“ChromOSOma”，2000，109 365-371)。白蚁是最古老的社会性昆虫，严重危害房屋建筑、水库提坝和农林植物。由于白蚁生活隐蔽，巢体结构复杂，生殖模式多样，人们很难直接观察到白蚁习性，因此白蚁防治工作带有很大的盲目性。我国学者在上世纪50年代开始采用传统方法研究白蚁巢群的建立和发展、补充型生殖蚁的产生及其群体发展等，取得了一些重要进展(见《中华卫生杀虫药械》，2003，9 :8-12)。但是，由于白蚁的筑巢和觅食具有隐蔽性，其在自然环境中的许多重要生物学特性仍然没有掌握如白蚁巢群中生殖蚁类型、数量和亲缘关系如何？ 一定区域内原始蚁王蚁后控制的巢群和补充型生殖蚁控制的巢群的比例是多少？
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种操作简便，结果可靠，可准确判断白蚁巢群生殖模式的鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法。本发明目的的实现方式为，一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，具体步骤如下1)在野外采集同一巢群，20头以上的白蚁样品，将样品放入装有95%酒精的样品管中，置于-20°C冰箱中备用，采样过程中，测定每个采样点的经度、纬度和海拔高度；2)提取白蚁样品的基因组DNA，再用ND-2000微量紫外/可见分光光度计测定样品DNA浓度，并统一稀释成10-20ng/ μ 1待用；3)在GenBank上查找与白蚁生殖模式相关的微卫星位点；4)利用软件I^rimer Premier 5. 0在微卫星重复序列的侧翼设计引物，选用微卫星位点RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的微卫星引物对白蚁样品DNA进行PCR扩增， PCR扩增反应在PTC-200PCR仪上进行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离， 选用分子标准为50-350bp IRDye800 standard，电泳在LI-C0R4300DNA自动分析仪上进行，再使用SAGAct软件测定电泳图中每个条带对应样品的基因型；5)基于“孟德尔定律”对白蚁样品的观测基因型频率与期望基因型频率进行卡方检验，再判定该白蚁巢群的生殖模式①简单巢群的基因型频率观测值与“孟德尔”简单巢群的基因型频率预期值没有显著差异时为“简单巢群”，
②扩大巢群的观测基因型种类数与“孟德尔”简单巢群的预期基因型种类数不一致，或者经X2检验后エ蚁的基因型频率观测值与“孟德尔，，简单巢群的基因型频率预期值有显著差异，且每一位点的等位基因数都小于5时为“扩大巢群”，③混合巢群的白蚁样品在某些微卫星位点上有5个以上的等位基因时为“混合巢群”。本发明利用微卫星DNA技术可以深入研究自然环境中白蚁巢群的生殖模式，从而了解相关的白蚁生殖生物学特征，不仅能有效地解决上述背景技术中所提到的问题，而且可以提高白蚁防治工作的针对性。采用本发明对长沙10个黑胸散白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA鉴定表明简单巢群7个、扩大巢群2个和混合巢群1个。
具体实施例方式本发明由由样品采集、基因组DNA提取、微卫星位点查找、引物设计及优化、基因型測定、卡方检验和生殖模式判定等7个关键步骤组成。下面通过具体实施例详述本发明。样品采集在长沙采集10个黑胸散白蚁巢群的白蚁样品，每个巢群采集エ蚁25 头，两个采样点间的距离应在20m以上。采样后，将エ蚁放入样品管中，用95%酒精浸泡，贴上标签，在-20°C冰箱中保存备用。在采样过程中，用手持GPS定位仪测定每个采样点的经度、纬度和海拔高度。基因组DNA提取按照已有的动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取所有样品的基因组DNA。采用ND-2000微量紫外/可见分光光度计测定DNA浓度，并将提取的样品 DNA稀释为10-20ng/ μ 1待用。微卫星位点查找在已有的GenBank上查找与白蚁生殖模式相关的微卫星位点。引物设计及优化利用软件I^rimer Premier5. 0在微卫星重复序列的侧翼设计引物，设计引物的原则为引物长度为19-2^p，GC含量40% -60%，退火温度为45_65°C，预期PCR产物长度为100-300bp。根据不同引物的不同Tm值在PCR仪上进行温度梯度优化，选择20个样品等量混合，得到样品DNA。本实施例的样品DNA是10个黑胸散白蚁巢群中20个样品的DNA等量混合得到。基因型测定选定微卫星位点RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的引物对白蚁样品DNA进行PCR扩增。PCR扩增反应在PTC-200PCR仪(Bio-Rad)上进行。PCR扩增反应体系10レ1，包括模板0嫩(10叫/^1)2.(^1，(1(1!120 4. 8 μ 1，1 XReaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12^nmol/L)0· 4μ 1，dNTPs (0. 2mmol/L) 0· 8 μ 1，5，端加有 M13 正向测序引物的正向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1。带有荧光标记的Μ13 引物(M13F-29/ IRD 800) (0. 32pmol/ μ 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08 μ 1。PCR扩增反应程序94°C预变性30s ；94°C变性30s，60°C退火30s，每循环一次降 1°C，72°C延伸30s，6个循环；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸:3min，4°C终止反应。用6. 5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，分子量标准为50-350bpIRDye800 standard (LI-COR，Inc.) 电泳在 LI-COR 4300DNA 自动分析仪上进行，再使用SAGAct软件(LI-COR，he.)测定电泳图中每个条带对应样品的基因型。卡方检验整理和统计每个微卫星位点对应的样品基因型，基干“孟德尔定律”由 エ蚁基因型逆推出生殖蚁的预期基因型，再根据生殖蚁基因型推算出后代基因型的频率预期值，再将エ蚁基因型频率观测值与エ蚁基因型频率预期值进行卡方检验。生殖模式判定基于卡方检验结果来判定黑胸散白蚁巢群的生殖模式，判定标准①当基因型频率观测值与“孟德尔”简单巢群的基因型频率预期值没有显著差异时为“简单巢群”，②当观测基因型种类数与“孟德尔”简单巢群的预期基因型种类数不一致，或者经 XX2检验后エ蚁基因型频率观测值与“孟德尔”简单巢群的エ蚁基因型频率预期值有显著差异，且每一位点的等位基因数都小于5时为“扩大巢群”，③当白蚁样品在某些微卫星位点上有5个以上的等位基因时为“混合巢群”。由此判断出，在长沙10个黑胸散白蚁巢群中，有7个简单巢群、2个扩大巢群和1 个混合巢群。
权利要求
1.一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，其特征在于具体步骤如下1)在野外采集同一巢群，20头以上的白蚁样品，将样品放入装有95%酒精的样品管中，置于-20°C冰箱中备用，采样过程中，测定每个采样点的经度、纬度和海拔高度；2)提取白蚁样品的基因组DNA，再用ND-2000微量紫外/可见分光光度计测定样品DNA 浓度，并统一稀释成10-20ng/y 1待用；3)在GenBank上查找与白蚁生殖模式相关的微卫星位点；4)利用软件I^rimerPremier 5. 0在微卫星重复序列的侧翼设计引物，选用微卫星位点Rf24-2、Rf21-1、Rf6_l、RslO和RS68的微卫星引物对白蚁样品DNA进行PCR扩增，PCR 扩增反应在PTC-200PCR仪上进行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，选用分子标准为50-350bp IRDye800 standard，电泳在LI-C0R4300DNA自动分析仪上进行， 再使用SAGAct软件测定电泳图中每个条带对应样品的基因型；5)基于“孟德尔定律”对白蚁样品的观测基因型频率与期望基因型频率进行卡方检验， 再判定该白蚁巢群的生殖模式①简单巢群的基因型频率观测值与“孟德尔”简单巢群的基因型频率预期值没有显著差异时为“简单巢群”，②扩大巢群的观测基因型种类数与“孟德尔”简单巢群的预期基因型种类数不一致，或者经X2检验后工蚁的基因型频率观测值与“孟德尔”简单巢群的基因型频率预期值有显著差异，且每一位点的等位基因数都小于5时为“扩大巢群”，③混合巢群的白蚁样品在某些微卫星位点上有5个以上的等位基因时为“混合巢群”。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，其特征在于设计引物的原则为引物长度为19-2^p，GC含量40% -60%，退火温度为45_65°C，预期 PCR产物长度为100-300bp。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，其特征在于根据不同引物的不同Tm值在PCR仪上进行温度梯度优化，选择20个样品等量混合，得到样品DNA。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，其特征在于 PCR 扩增反应体系 10 μ 1，包括模板 DNA(10ng/y 1)2.0 μ 1，ddH20 4. 8 μ 1，IX Reaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12 (2mmol/L) 0. 4 μ 1, dNTPs (0. 2mmol/L)0. 8μ 1,5'端力口有 M13 正向测序引物的正向引物(2ρπι01/μ 1)0·2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0.2μ 1 ；带有荧光标记的 Μ13 引物(M13F-29/IRD 800) (0. 32pmol/y 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08μ 1 ；PCR扩增反应程序94°C预变性30s ；94°C变性30s，60°C退火30s，每循环一次降1°C， 72°C延伸30s，6个循环；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸 ;3min，4°C终止反应。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，其特征在于基于“孟德尔定律”由工蚁基因型逆推出生殖蚁的预期基因型，再根据生殖蚁基因型推算出后代基因型的频率预期值，再将工蚁基因型频率观测值与工蚁基因型频率预期值进行卡方检验。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA方法，在野外采集同一巢群的20头以上白蚁样品，提取样品基因组DNA，稀释。在GenBank上查找与白蚁生殖模式相关的微卫星位点，利用软件Primer Premier 5.0在微卫星重复序列的侧翼设计引物，选用微卫星引物对白蚁样品DNA进行PCR扩增后在自动分析仪上进行电泳，用SAGAGT软件测定电泳图中每个条带对应样品的基因型。基于“孟德尔定律”对白蚁样品的观测基因型频率与期望基因型频率进行卡方检验，判定白蚁巢群的生殖模式。采用本发明对长沙10个黑胸散白蚁巢群生殖模式的微卫星DNA鉴定表明简单巢群7个、扩大巢群2个和混合巢群1个。本发明操作简便，结果可靠，可准确判断白蚁巢群的生殖模式，对制定防治白蚁策略有重要参考价值。
文档编号C12Q1/68GK102559896SQ20121000607
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者李刚华, 雷朝亮, 黄求应 申请人:华中农业大学