专利名称：一种爪哇根结线虫效应基因Mj-nulg，相关蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物基因工程技术领域，具体涉及一种爪哇根结线虫效应基因相关蛋白及应用。
背景技术：
根结线虫是一类非常重要的植物寄生线虫，广泛分布于世界各地，能侵染超过3000种不同植物。根结线虫每年造成大概770亿美元的经济损失，随着作物复种指数的提高和设施农业的发展，根结线虫的发生和危害将会不断的加剧。由于根结线虫的根内寄生、寄主范围广泛的特性以及抗根结线虫种质资源的缺乏限制了化学防治、轮作和抗病育种等
防治方法在控制根结线虫危害中的应用。因此，寻找其他有效的防治根结线虫的方法是植物生产所长期面临的艰巨任务。RNA干扰技术(RNAi)的出现使得开发更为有效的防治根结线虫的方法成为可能。RNAi能通过靶向抑制根结线虫特定基因功能而限制根结线虫侵染、寄生和繁殖因而能高效地减少根结线虫的危害而且对其他非靶标生物较为安全。RNAi现象最早在秀丽小杆线虫中发现，随后在植物、无脊椎动物和脊椎动物中都相继发现了这种现象。RNAi技术通过dsRNA特异性的降解靶mRNA，影响或抑制该目的基因功能，从而影响该种生物的生长、发育、繁殖甚至能杀死该种生物。该技术相比其他防治方法的最大优点是能定向作用于特定的某种(某类)害虫而不会影响在该生境中的其他生物。应用农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术相对于传统的使用组织培养方法获得RNAi转基因植株更加简单快速，使得我们并不需要通过复杂的组培方法就可快速获得抗线虫植株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的爪哇根结线虫效应基因Mj-nulg。本发明的另一目的是提供上述爪哇根结线虫效应基因 的相关蛋白MJ-NULG。本发明的又一目的是提供上述爪哇根结线虫效应基因的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种爪睡根结线虫javanica)效应基因其核苷酸序列如SEQID NO: 1 3任意一条所示。其中SEQ ID NO: I为全基因序列(包括5’端非编码区、3’端非编码区、内含子和外显子)，SEQ ID NO: 2为编码区序列(包括内含子和外显子)，SEQ ID NO: 3为编码序列(即cDNA序列，仅为外显子)。在严格条件下与上述爪哇根结线虫效应基因 杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，或者与上述爪哇根结线虫效应基因貧有90%以上同源性且编码根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，也在本发明的保护范围之内。所述严格条件为可在0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
一种爪哇根结线虫效应蛋白MJ-NULG，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或该氨基酸序列经过一个或一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与爪哇根结线虫寄生相关的衍生蛋白。为了使爪哇根结线虫效应蛋白MJ-NULG便于纯化，可以在该序列(SEQ ID N0:4)的氨基末端或羧基末端连接上特定的标签，所述特定标签为5飞个精氨酸，或2 12个组氨酸，或如SEQ ID NO: 5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO: 7所示序列。如表I，但不限于表I :
权利要求
1.一种爪哇根结线虫效应基因 ，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:f3任意一条所示。
2.一种爪哇根结线虫效应蛋白MJ-NULG，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
3.在严格条件下与权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因 杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子。
4.与权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因 具有90%以上同源性且编码爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子。
5.一种爪哇根结线虫效应蛋白MJ-NULG，其特征在于在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列 的氨基末端或羧基末端连接有特定标签，所述特定标签为5飞个精氨酸，或2 12个组氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所示序列。
6.—种重组表达载体,其特征在于由出发载体的多克隆位点插入权利要求I所述爪睡根结线虫效应基因 ，或该基因的部分外显子片段如SEQ ID NO:8 10任一所示序列构建而成。
7.—种重组基因表达盒，其特征在于含有权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因Mj~nulg0
8.转基因细胞系，其特征在于含有权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因
9.一种重组菌，其特征在于含有权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因
10.权利要求I所述爪哇根结线虫效应基因 在制备转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-nulg，相关蛋白及应用，属于生物基因工程技术领域。本发明的效应基因Mj-nulg核苷酸序列如SEQIDNO:1-3所示，其相关蛋白MJ-NULG的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本发明用qPCR研究基因在线虫不同阶段表达情况；用免疫定位方法证明MJ-NULG蛋白在线虫背食道腺并被分泌到植物细胞中，定位在细胞核上；设计该基因过表达载体，转化到拟南芥中，发现转基因拟南芥更易感染根结线虫；设计病毒诱导重组RNAi载体，将该载体导入植物，在植物中产生Mj-nulg的dsRNA，该植株能显著抑制根结线虫的寄生。通过本发明可获得强抗根结线虫的植物。
文档编号C12N15/63GK102653763SQ20121012581
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者卓侃, 廖金铃, 林柏荣 申请人:华南农业大学