专利名称：TCR Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重组质粒及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于血液肿瘤中抗肿瘤免疫技术领域，特别涉及一种慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)相关抗原特异性 TCR ζ 嵌合型 TCR (Τ 细胞受体,T cellreceptor)基因相关的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒及其构建方法与应用。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(CML)是源自造血干细胞的恶性克隆性疾病，是发病率较高血液恶性肿瘤之一，严重威胁了人类的健康。目前，虽然CML分子靶向治疗的缓解率很高，但发生耐药且不能治愈CML是其主要缺陷；异基因造血干细胞移植是迄今治愈CML的最有效 的方法，但是受干细胞来源及患者年龄等因素限制仅有少部分患者能进行此治疗；过继性免疫治疗如DLI在治疗CML移植复发方面疗效显著，使得人们对CML相关抗原特异性免疫治疗寄予厚望，然而目前还没有有效的手段分离获得足够数量CML相关抗原特异性CTL。基于TCR基因的免疫治疗是近些年发展起来的一种肿瘤过继性免疫治疗的新技术，它是将肿瘤抗原特异性的TCR基因转染至正常的T细胞，赋予正常的T细胞特异性识别肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的功能，然后输注给患者达到治疗肿瘤的效果，该技术已经广泛地用于抗肿瘤的研究，它可能是最有希望治愈肿瘤的方法之一。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种TCRV a 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重组质粒。该重组质粒转染入细胞内，能有效改善CML患者T细胞的免疫功能，同时外源性二聚体错配发生很少。本发明的另一目的在于提供所述的TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重组质粒的构
建方法。本发明的再一目的在于提供所述的TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重组质粒的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种TCR Va 13: C-IRES-VP 21: ζ重组质粒，为将TCR Va 13: ζ基因和TCR νβ21: ζ基因分别构建于pIRES质粒中IRES序列两侧的多克隆位点中得到；所述的多克隆位点由多克隆位点A和多克隆位点B组成；所述的TCRVa 13: ζ基因的序列如SEQ ID NO. I所示，其含有起始密码子和终止密码子，可通过任意的酶切位点克隆入多克隆位点A或多克隆位点B中；优选通过Nhe I和EcoR I酶切位点克隆入多克隆位点A中；所述的TCRV β 21: ζ基因的序列如SEQ ID NO. 2所示，其含有起始密码子和终止密码子，可通过任意的酶切位点克隆入多克隆位点B或多克隆位点A中；优选通过Xba I和Sal I酶切位点克隆入多克隆位点B中；
所述的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒的构建方法，包括如下步骤(I)TCRC基因的获得根据TCRC基因序列设计引物，利用带有Xho I酶切位点的上游引物 ζ F :5’-GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3'和带有 EcoR I 和 Sal I 酶切位点的下游引物CR为5’-ATGTCGACGAATTCT TAGCGAGGGGGCAGGG-3';以健康人基因组为模板，PCR扩增得到TCR ζ基因；(2)TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒的构建将Xho I和EcoR I双酶切后的TCR ζ基因和Xho I和EcoR I双酶切后的真核表达载体PIRES2-EGFP连接，得到TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒；(3) Va 13: ζ-IRES-EGFP 和 Vβ 21: ζ-IRES-EGFP 基因真核载体构建①扩增TCR Va 13基因的引物为带有Nhe I酶切位点序列的上游引物aF :5’_TCGGCTAGCGGAGCAAGAAGGCAAAGCATC-3’ 和带有 Xho I 酶切位点的下游引物 a R :5’ -CGGCTCGAGATCACAGGAACT-TTCTGGGC-3';扩增TCR νβ 21基因引物为带有Nhe I酶切位点的上游引 物 @F:5’ -TAAGCTAGCCTCCCATCCTTCCCTGACCCT-3’ 和带有 Xho I 酶切位点下游引物 3R:5’ -AATCTCGAGGCCACAGTCTGCTCTACCC CA-3/ ;以 CML 患者外周血单个细胞的 cDNA 为模板，PCR扩增得到TCR Va 13和TCR V β 21亚家族基因PCR产物，其中，TCRV a 13基因的序列如上所示，TCRV β 21基因的序列如上所示；②利用Nhe I和Xho I限制性内切酶双酶切步骤①得到的TCR Va 13基因、TCRνβ 21基因以及步骤(2)得到的TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒；将双酶切后的TCR Va 13基因与双酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP连接，将双酶切后的TCR νβ 21基因与双酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP 连接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 TCR V β 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核载体；(4) TCR Va 13: ζ-IRES真核载体构建利用Nhe I和EcoR I内切酶双酶切TCRVa 13: ζ-IRES-EGFP和pIRES质粒，取双酶切后的TCRV a 13: ζ基因片段与双酶切后的PlRES 连接，得至Ij TCR Va 13: ζ-IRES 质粒；(5) TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 真核载体构建①以步骤(3)制备的TCRVP 21: ζ -IRES-EGFP基因真核载体为模板，利用含Xba I酶切位点的上游引物 Fl :5’-TTGTCTAGACTCCCATCCTTC CCTGACCCT-3’ 和含 Sal I 和 EcoR I酶切位点的下游引物Rl :5’-ATGTC GACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’进行PCR扩增，得到νβ21: ζ基因PCR产物；②利用Xba I和Sal I限制性内切酶双酶切V β 21: ζ基因PCR产物和步骤(4)制备的TCRVa 13: ζ-IRES质粒，将双酶切后的V β 21: ζ基因PCR产物与TCRV a 13: ζ -IRES连接，得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒。所述的连接的条件优选如下37°C、16h ；所述的PCR 的条件为98°C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin,30 个循环；72 °C 5min ；所述的TCRV a 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重组质粒在制备特异性抗CML细胞的细胞毒T细胞中的应用。一种抗CML的细胞毒T细胞，为将所述的TCR Va 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重组质粒转染到T细胞制备得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果将本发明CML相关抗原特异性细胞毒T细胞克隆相关的TCR Va 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ重组质粒转导至外周血T细胞，可获得特异性识别CML相关抗原的大量高效细胞毒T细胞，能够特异性地杀伤CML细胞，同时还能够降低TCR错配和改善T细胞免疫功能，安全性高，对CML的治疗有着较好的应用前景。
图I是pIRES质粒示意图。图2是TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ真核双表达载体示意图。图3是TCRVa 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ真核双表达载体酶切鉴定图，其中M 为 Ikb DNA ladder。图4是TCR基因重组质粒转染正常人T细胞24h流式检测结果，其中
A为同型对照；B为PIRES质粒(阴性对照组);C为TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ质粒(实验组)；D为TCRVa 13-IRES-V0 21质粒(阳性对照组)。图5是ELISP0T检测各组细胞INF- Y分泌水平，其中A为pIRES质粒(阴性对照组)；B为TCR Va 13-IRES-V β 21质粒(阳性对照组)；C 为 TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 质粒(实验组)；1 为 pEGFP_N3+K562 细胞；2 为HLA-A*1101+K562 细胞；3 为 HLA_A*1101+K293 细胞；4 为培养基(NC)。图6为TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ -myc质粒转染Jurkat细胞后免疫共沉淀结果，其中A 为 TCR Va 13: ζ-IRES-V β 21: ζ-myc 质粒组共沉淀；B 为 TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ -myc质粒组共沉淀后上清；C为pIRES质粒组共沉淀；D为pIRES质粒组共沉淀后上清。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(一)TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重组质粒构建(I)TCRC基因的获得根据TCRC基因序列设计引物，利用带有Xho I酶切位点的上游引物 ζ F :5’ -GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3’ 和带有 EcoR I 和 Sal I 酶切位点的下游引物ζ R为5’ -ATGTCGACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’。以来自健康人外周血T细胞RNA反转录的cDNA为模板，按PrimeSTARt5HS DNA Polymerase试剂盒(宝生物工程，大连)进行PCR反应=PCR总反应体系50 μ L，其中含SxPrimeSTAR Buffer 10 μ I、上下游引物各 O. 2 μ mol/L、dNTP MixtureO. 2mmol/L> PrimeSTAR HS DNA Polymerase25U/mL、I μ L cDNA模板，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件980C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin，30 个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行纯化，得到TCR ζ基因。(2)TCR ζ -IRES2-EGFP 重组质粒的构建将真核表达载体 pIRES2_EGFP (Clontech公司，USA)与步骤(I)制备的TCRC基因分别用Xho I和EcoR I酶切，37°C水浴3h ;酶切产物使用酶切产物纯化试剂盒纯化。双酶切后PIRES2-EGFP与TCR(基因PCR产物进行连接反应体系为10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pIRES2_EGFP载体2 μ L、双酶切后的TCR ζ基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化①将连接产物(5 μ L)加入100 μ L感受态大肠杆菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min 42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入SOC培养基800 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180 200rpm振摇90min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Xho I和EcoR I双酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒，_20°C冻存备用。(3) Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 νβ 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核载体构建首先收集CML患者外周血单个核细胞，常规进行RNA提取、cDNA合成(按Invitrogen SuperScdptS III试剂盒说明书进行操作)(Invitrogen, USA),接着进行利用TCRVa和TCRVP亚家族引物进行PCR扩增，分析CML患者T细胞TCRV a和TCRVP亚家族克隆性优势表达情况，分别以如表I所示的29个TCRV a亚家族和24个TCRV β亚家族相应的特异性上游引物，并结合相应Ca和Ci3下游引物，分别进行Va I 29与Ca以及V β I 24与C β共53个PCR反应。PCR总反应体系20 μ L，其中含O. 5 μ mol/L任一对Va 和 νβ 引物、O. Immol/LdNTPU. 25U 丁&9聚合酶、10父？0 缓冲液、1.5臟01/1 MgC12、超纯水和IyL cDNA模板，同时设置阳性和阴性对照。反应在PCR扩增仪中进行，反应条件94°C lmin(首次为 3min)、60°C lmin、72°C lmin(末次为 lOmin)，共 40 个循环，PCR 产物保存于4°C中。取8 μ L PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳后用Gene genius凝胶成像分析系统分析结果，出现阳性条带者进一步以荧光素标记的Ca -Fam引物或⑶-Fam引物进行不对称扩增(10μ L的反应体系含2· 5μ L TCR亚家族基因的PCR产物、O. 15ymol/L Ca-Fam引物或 CP-Fam 引物、I. 5mmol/LMgC12、0. lmmol/L dNTP、0. 75U Taq 聚合酶、10XPCR 缓冲液和超纯水。PCR 反应条件-MV 3min，94°C Imin、66O Imin、72。。Imin、35 个循环，72°C 6min ；得到荧光标记的单链PCR产物，再进行基因扫描分析，将去离子甲酰胺与GeneSCan-500LIZ分子量标准品按体积比20 : I比例配好IOyL的混合液，加入2 μ L荧光素Fam标记的PCR产物，经94°C变性4min，立即放置冰上冷却2min，然后加入96孔板，直接装载到3100DNA序 列分析仪(ABI PRISM3100-Avant GeneticAnalyzer)上进行毛细管电泳，进行基因扫描分析)，确定其T细胞克隆性(涉及相关的引物序列如表I所示)。表I相关的引物序列
权利要求
1.一种TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒，其特征在于将如SEQ ID No. I所示的TCRV a 13: ζ基因和如SEQ ID No. 2所示的TCRV β 21: ζ基因分别构建于pIRES质粒中IRES序列两侧的多克隆位点中得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒。
2.根据权利要求I所述的TCRVa 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重组质粒，其特征在于所述的多克隆位点由多克隆位点A和多克隆位点B组成。
3.根据权利要求I所述的TCRVa13: (-IRES-V0 21: ζ重组质粒，其特征在于将如SEQ ID No. I所示的TCR Va 13: ζ基因构建于pIRES质粒中的多克隆位点A和将如SEQ ID No. 2所示的TCRVP 21: ζ基因构建于pIRES质粒中的多克隆位点B得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重组质粒。
4.权利要求I所述的TCRVa 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ重组质粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (1)TCRC基因的获得根据TCRC基因序列设计引物，利用带有XhoI酶切位点的上游引物 ζ F :5’ -GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3’ 和带有 EcoR I 和 Sal I 酶切位点的下游引物 ζ R 为5’-ATGTCGACGAATTCT TAGCGAGGGGGCAGGG-3’ ；以健康人基因组为模板，PCR扩增得到TCR ζ基因； (2)TCRζ -IRES2-EGFP重组质粒的构建将Xho I和EcoR I双酶切后的TCR ζ基因和Xho I和EcoR I双酶切后的真核表达载体PIRES2-EGFP连接，得到TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒; (3)Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 νβ21: ζ-IRES-EGFP 基因真核载体构建 ①扩增TCRVa 13基因的引物为带有Nhe I酶切位点序列的上游引物aF:5’_TCGGCTAGCGGAGCAAGAAGGCAAAGCATC-3’ 和带有 Xho I 酶切位点的下游引物 a R :5’ -CGGCTCGAGATCACAGGAACT-TTCTGGGC-3’ ；扩增TCRV β 21基因引物为带有Nhe I酶切位点的上游引物 :5’-TAAGCTAGCCTCCCATCCTTCCCTGACCCT-3’ 和带有 Xho I 酶切位点下游引物 3R:5’ -AATCTCGAGGCCACAGTCTGCTCTACCC CA-3’ ；以 CML 患者外周血单个细胞的 cDNA 为模板，PCR扩增得到TCR Va 13和TCR V β 21亚家族基因PCR产物，其中，TCRV a 13基因的序列如上所示，TCRV β 21基因的序列如上所示； ②利用NheI和Xho I限制性内切酶双酶切步骤①得到的TCR Val3基因、TCRνβ 21基因以及步骤(2)得到的TCR ζ -IRES2-EGFP重组质粒；将双酶切后的TCR Va 13基因与双酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP连接，将双酶切后的TCR νβ 21基因与双酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP 连接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 TCR V β 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核载体； (4)TCR Va 13: ζ -IRES真核载体构建利用Nhe I和EcoR I内切酶双酶切TCRVa 13: ζ-IRES-EGFP和pIRES质粒，取双酶切后的TCRV a 13: ζ基因片段与双酶切后的PIRES 连接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES 质粒； (5)TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 真核载体构建 ①以步骤(3)制备的TCRVii 21: ζ-IRES-EGFP基因真核载体为模板，利用含Xba I酶切位点的上游引物 Fl :5’ -TTGTCTAGACTCCCATCCTTC CCTGACCCT-3’ 和含 Sal I 和 EcoR I酶切位点的下游引物Rl :5’-ATGTC GACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’进行PCR扩增，得到Υβ21: ζ基因PCR产物；②利用Xba I和Sal I限制性内切酶双酶切V β 21: ζ基因PCR产物和步骤(4)制备的TCRVa 13: ζ-IRES质粒，将双酶切后的V β 21: ζ基因PCR产物与TCRV a 13: ζ-IRES连接，得至IJ TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重组质粒。
5.根据权利要求4所述的TCRVa 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重组质粒的构建方法，其特征在于所述的连接的条件为37°C、16h。
6.根据权利要求4所述的TCRVa13: (-IRES-Vi3 21: ζ重组质粒的构建方法，其特征在于所述的 PCR 的条件为98°C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin,30 个循环；72 °C 5min。
7.权利要求I 3任一项所述的TCRVa 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重组质粒在制备特异性抗CML细胞的细胞毒T细胞中的应用。
8.一种抗CML的细胞毒T细胞，为将权利要求I 3任一项所述的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重组质粒转染到T细胞制备得到。
全文摘要
本发明属于血液肿瘤中抗肿瘤免疫技术领域，特别涉及一种慢性粒细胞白血病相关抗原特异性TCRζ嵌合型TCR基因相关的TCR Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重组质粒及其构建方法与应用。该重组质粒是将如SEQ ID No.1所示的TCR Vα13:ζ基因和如SEQ ID No.2所示的TCRVβ21:ζ基因分别构建于pIRES质粒中IRES序列两侧的多克隆位点中得到。将该重组质粒转导至外周血T细胞，可获得特异性识别CML相关抗原的大量高效细胞毒T细胞，能够特异性地杀伤CML细胞，同时还能够降低TCR错配和改善T细胞免疫功能，安全性高，对CML的治疗有着较好的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102816782SQ201210214549
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者李扬秋, 查显丰, 陈少华, 杨力建, 吴秀丽, 李萡 申请人:暨南大学