Hplc12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法

专利名称：Hplc12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体涉及HPLC12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法。
背景技术：
冰结构蛋白(icestructuring proteins , ISPs),又叫抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)，是指一类由某些脊椎动物、植物、真菌和细菌产生的多肽。这些多肽能保证这些物种在零下温度环境下生存。ISPs最初是从地球两极地区的海洋鱼类血清中发现的，它能与冰晶相结合，从而阻止鱼体液内冰核的形成与生长，从而起到抗冻的作用。ISPs 的抗冻性能与汽车抗冻剂不同，对冰点的降低不和浓度成正比。它们不是按照依数性规律起作用。这样，就能使它们在相当于其他溶解的溶质的1/300到1/500的浓度，而起到防冻剂的作用。这将使它们对渗透压的影响降至最小。鱼类抗冻蛋白是迄今为止研究最为广泛和深入的一类蛋白，分为AFGPs、AFPs I ,AFPs I1、AFPs II1、AFPs IV等五种。其中AFPs III分子量接近7kD，其二级结构主要由9个β链组成，其中8条β链形成2个三重反向折叠和I 个二重反向折叠,另一个β链呈游离态,2个三重折叠相互垂直排列构成β夹心结构。其中的HPLC12型冰结构蛋白，其抗冻活性及安全性均得到了社会的认可，已被FDA，WHO，EFSA 等组织批准为食品添加剂。
目前，HPLC12型冰结构蛋白的生产方式有三类，一种是通过化学萃取和生物表达得到，但化学法存在高能量投入，产生大量的化学废弃物(甲苯、苯氯仿和乙酸乙酯等)，且需十多个步骤，产物分离纯化困难，成本高等缺点，尽管人们在化学合成法方面做了大量研究，仍不能有效解决以上问题，严重阻碍了抗冻蛋白的工业化生产进程；第二种是从生物体体内直接萃取，这样成本极其昂贵，且产量不高；第三种是用酿酒酵母和大肠杆菌做表达， 近几年，随着生物工程技术的迅速发展，人们试图通过基因工程改变菌种生产能力，使发酵单位大大提高，酵母发酵系统属于真核表达系统，可以分泌表达外源性蛋白，但酵母表达蛋白会出现蛋白切割问题，表达量比较低(30-80 mg/L);同时，酵母对该蛋白的重组表达可以对其进行糖基化修饰 ，糖基化修饰后的蛋白活性较低；大肠杆菌表达系统相对比较成熟，但由于大肠杆菌自身的蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，因此不能对重组蛋白进行修饰加工，表达的目的基因往往形成不溶性、无活性的包涵体，加上大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，给目标蛋白的回收带来不便，分泌能力也相对较低(50-100mg/L);且大肠杆菌有内毒素潜在危险。因此，不适宜用于HPLC12型冰结构蛋白的表达。而枯草芽孢杆菌无致病性，美国食品和药物管理局(FDA)已经将一些种类的芽孢杆菌列为原则上认为安全的微生物(GRAS)。发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可安全生产HPLC12型冰结构蛋白的枯草芽孢杆菌重组菌。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为一种枯草芽孢杆菌重组菌，是将 HPLC12型冰结构蛋白基因导入枯草芽孢杆菌得到的；HPLC12型冰结构蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
上述的枯草芽孢杆菌重组菌，所述HPLC12型冰结构蛋白基因的核苷酸序列如序列I所示。
上述的枯草芽孢杆菌重组菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。
上述的枯草芽孢杆菌重组菌，所述HPLC12型冰结构蛋白基因通过重组表达载体 pAL12-AFPs III导入到所述的枯草芽孢杆菌中；所述重组表达载体pAL12_AFPs III是将所述的HPLC12型冰结构蛋白基因插入枯草芽孢杆菌质粒pAL12得到的。
本发明的第二个目的是提供了 HPLC12型冰结构蛋白的制备方法，是发酵上述任一所述枯草芽孢杆菌重组菌得到HPLC12型冰结构蛋白。
本发明的有益效果为枯草芽孢杆菌具有生物安全性，并具有很好的遗传稳定性，可持续分泌表达外源基因。所以，本发明以枯草芽孢杆菌质粒PAL12出发，在多克隆位点后插入密码子优化过的 HPLC12型冰结构蛋白序列。将阳性克隆质粒转化入表达菌株WB800N，利用诱变技术获得可以高量、稳定、分泌表达HPLC12型冰结构蛋白的枯草芽孢杆菌重组工程菌株。由于该方案中对HPLC12型冰结构蛋白诱导表达的启动子为冷诱导启动子，因此利用该系统可以在高效表达冰结构蛋白的同时有效地保存冰结构蛋白的生物学活性，本发明将在冰结构蛋白表达的生物制备中发挥重要作用。
本发明提供的技术方案中，由于只含有肽聚糖和磷壁质，当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培养基中，这使得回收和纯化分泌蛋白较为简单，并且其分泌量可以达到5g/L。
枯草芽孢杆菌分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖等物质，从而使得目的蛋白的纯化相对比较简单。而大肠杆菌由于自身的蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，因此不能对重组蛋白进行修饰加工，表达的目的基因往往形成不溶性、无活性的包涵体，加上大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，给目标蛋白的回收带来不便，分泌能力也相对较低。枯草芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，赋予其高效分泌目的蛋白的能力，而且在多数情况下，枯草芽孢杆菌分泌的真核来源的重组蛋白质可以具有其天然构象和生物活性。
枯草芽孢杆菌生长迅速、培养条件简单、遗传背景了解较清晰。在科研和工农业生产领域被广泛应用，在相对简单的培养基中就能生长到很高的密度。很多商业用酶都是枯草芽孢杆菌产生的胞外蛋白如蛋白酶、α -淀粉酶等，具有良好的发酵基础和先进的发酵技术。
大部分枯草芽孢杆菌菌株对培养基的要求较低(特别是对动物性蛋白)，适于工业化的生产。而大肠杆菌的培养离不开动物性蛋白原料,增加了工业生产成本,并且随着疯牛病等动物传染性疫病的传播，增加了大肠杆菌发酵生产的潜在危险性。


图1为HPLC12型冰结构蛋白基因的PCR扩增凝胶电泳图。
其中，泳道M为DL500 DNA Marker ;泳道1_2为阴性对照；泳道3为pUC57_ HPLC12 型冰结构蛋白基因。
图2为枯草芽孢杆菌重组菌的生长曲线图。
其中，是根据不同的培养时间，测定其0D600值，每次做三支，取平均值得到的。
图3为HPLC12型冰结构蛋白酶活性曲线图。
其中，是参照Siang DQ的方法，将大肠杆菌DH5 α接种于LB培养基中，按照不同是时间测定其在50μ g/mL的HPLC12的保护下，放置在_7°C，在不同的时间内的0D600值。
图4为枯草芽孢杆菌重组菌生长过程中HPLC12型冰结构蛋白III的表达量的电泳图。
图5为HPLC12型冰结构蛋白的最适合pH及pH稳定性的检测结果图。
其中，HPLC12在不同的pH条件下处理后，观察其对DH5a在_7°C的保护，测定其 0D600值，结果为最适pH为7-9，能够耐受的pH为2_12。
图6为HPLC12型冰结构蛋白的最适合温度及温度稳定性的测定结果图。
其中，HPLC12在不同的温度条件下处理后，观察其对DH5a在_7°C的保护，测定其 0D600 值，其最适温度为-5°C—20°C，能耐受:的温度为-1CTC一35°C。
具体实施方式
实施例1 : WB800N，购于德国MoBiTec GmbH公司，商品号为PBS022。
pAL12，购于德国 MoBiTec GmbH 公司，商品号为 PBS007。
HPLC12型冰结构蛋白基因，根据枯草芽孢杆菌密码子偏爱性，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行优化与合成，并亚克隆到PUC57，即得pUC57-HPLC12。
本发明提供的具有表达活性的HPLC12型冰结构蛋白的制备方法为将基因优化过的HPLC12型冰结构蛋白基因，与枯草芽孢杆菌的表达载体pAL21相连获重组表达载体， 再将重组表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，20°C低温诱导 72小时，即得具有AFPIII蛋白的发酵物。
一种枯草芽孢杆菌重组菌，是将HPLC12型冰结构蛋白基因导入枯草芽孢杆菌得到的；HPLC12型冰结构蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
HPLC12型冰结构蛋白基因的核苷酸序列如序列I所示。
枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。
HPLC12型冰结构蛋白基因通过重组表达载体pAL12_AFPs III导入到所述的枯草芽孢杆菌中；所述重组表达载体pAL12-AFPs III是将所述的HPLC12型冰结构蛋白基因插入枯草芽孢杆菌质粒PAL12得到的。
本发明提供的具有表达活性的HPLC12型冰结构蛋白的制备方法为将基因优化过的HPLC12型冰结构蛋白基因，与枯草芽孢杆菌的表达载体pAL21相连获重组表达载体， 再将重组表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，20°C低温诱导 72小时，即得具有冰结构蛋白的发酵物。
最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。·
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，是将HPLC12型冰结构蛋白基因导入枯草芽孢杆菌得到的；HPLC12型冰结构蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于所述HPLC12型冰结构蛋白基因的核苷酸序列如序列I所示。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。
4.根据权利要求1或2或3所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于所述HPLC12型冰结构蛋白基因通过重组表达载体pAL12-AFPs III导入到所述的枯草芽孢杆菌中；所述重组表达载体pAL12-AFPs III是将所述的HPLC12型冰结构蛋白基因插入枯草芽孢杆菌质粒PAL12得到的。
5.HPLC12型冰结构蛋白的制备方法，其特征在于是发酵权利要求1-4中任一所述枯草芽孢杆菌重组菌得到HPLC12型冰结构蛋白。
全文摘要
本发明公开了枯草芽孢杆菌重组菌，是将HPLC12型冰结构蛋白基因导入枯草芽孢杆菌得到的；HPLC12型冰结构蛋白的氨基酸序列如序列2所示。并提供了HPLC12型冰结构蛋白的制备方法，是发酵权利要求1-4中任一所述枯草芽孢杆菌重组菌得到HPLC12型冰结构蛋白。本发明的有益效果为枯草芽孢杆菌具有生物安全性，并具有很好的遗传稳定性，可持续分泌表达外源基因，以枯草芽孢杆菌质粒pAL12出发，在多克隆位点后插入密码子优化过的HPLC12型冰结构蛋白序列，可获得可以高量、稳定、分泌表达HPLC12型冰结构蛋白的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，将在抗冻蛋白表达的生物制备中发挥重要作用。
文档编号C12N15/75GK103013896SQ201210389359
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者陈熙明, 林志伟, 周建业 申请人:周建业