专利名称：一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及金线莲的指纹图谱，尤其是涉及金线莲种质鉴定指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术：
我国兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)有23种左右，为多年生草本植物，通称金线莲或金线兰，素有“药王”、“金草”、“神药”、“鸟人参”等美称。在我国主要分布于亚热带地区即福建、广东、广西、浙江、江西、海南、云南、四川、贵州以及西藏南部等省区，其中以闽、浙、赣和台湾为主产地。金线莲是我国传统的珍贵药材，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效，对无名肿痛、发烧、止泻、蛇伤均有显著疗效，且使用安全、无毒副作用[3]。经有关部门测定发现，金丝莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参。几百年来作为民间常用草药。经闽台各大医院临床应用，金线莲具有肝保护、抗HBV、抗氧化、抗肿瘤活性、降高血糖、降高血脂、降高血压、降高尿酸、小儿哮喘、小儿抽动-秽语、抗炎、利尿、镇静、止痛等多种治疗功效。同时，金线莲株型小巧、叶型优美、叶脉金黄色呈网状排列是观赏价值极高的室内观叶珍品。由于金线莲的优良品质，其日益受到世人青睐，但金线莲的分类和不同种间的药效差别一直没有定论，在民间，药商将花叶开唇兰属中带黄色或白色叶脉的种类以及斑叶兰属(Goodyera)中外形近似种均当作金线莲收购。在 人工栽培中也是将花叶开唇兰属与斑叶兰属中很多种都当作金线莲，还有血叶兰也叫金线莲，造成金线莲种源混杂。这与中药材规范化标准化要求相去甚远，也会给规模化生产带来风险，所以急需开展金线莲优良种源筛选和鉴定研究，以期筛选和保护农艺性状优良、药用成分含量高的优良品种资源，为其进一步大规模开发利用和科学研究提供参考和借鉴。安徽霍山是已知兰科植物一金线莲地理分布的最北端，其特殊的地理环境和生态环境使霍山产金线莲的品质与众不同，为保护和开发利用这一优异品种，大别山濒危兰科植物保育科学研究中心联合安徽六市同济生生物科技有限责任公司开展了种质资源鉴定研究。1994年，加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等首次发明了串联重复序列区间片段多态性标记(ISSR, Inter simple sequence repeat, ISSR)技术,之后ISSR分子标记技术在全世界不断得到推广和应用。由于SSR序列在基因组中广泛分布(Roderetal.，1998)，且等位变异特别丰富，因此ISSR与其它多态性分子标记技术RFLP、AFLP和RAPD相比，可以检测到更高的多态性，同时锚定碱基使基因组上只有那些与锚定碱基匹配的位点才能被靶定，避免了 SSR在基因组上的滑动，大大提高了 PCR扩增的稳定性和可重复性，因而ISSR分子标记技术非常适合于种间和种下关系的分析。本文利用ISSR-PCR技术对安徽、湖北、广东、福建和台湾等5省10地用于药用的优质金线莲品种进行了居群间的种下鉴别，旨在建立一个较为完整可靠的金线莲ISSR — PCR反应系统，为今后研究金线莲地理种源的群体遗传多态性和广泛的良种选育与杂交提供分子水平上的参考和借鉴。虽然通过保守序列设计引物进行PCR产物测序，依据核苷酸序列来鉴定药用植物的方法具有科学性和可靠性，但存在成本高、程序复杂和耗时长等缺点。本发明研究利用ISSR分子标记方法来鉴定金线莲及其相似种，通过对金线莲及其相似种植物的ISSR分子标记指纹图谱研究，具有多态性丰富，差异稳定，且操作相对简便、成本经济等优点。
发明内容
为了解决现有技术鉴定药用植物的方法成本高、程序复杂和耗时长的问题，本发明提供一种鉴定操作简便快捷、重复性好、分辨率高的金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱的构建方法和应用。本发明的技术方案是利用ISSR分子标记技术来构建金线莲的分子标记指纹图谱，并利用所构建的指纹图谱实现安徽霍山红叶金线莲及其相似种的鉴定。本发明的具体操作，包括以下步骤( I)新鲜金线莲样品预处理将新鲜金线莲样品避光6个小时以上消耗淀粉，取新鲜的金线莲叶片10克，用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，擦干；(2)样品基因组DNA的提取采用改进的CTAB法提取金线莲叶片基因组DNA，操作如下I)将预处理后的叶片放入冰冻过的陶瓷研钵中，并加入适量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末状，用药匙将叶片粉末迅速转移到IOml预冷Eppendorf离心管中，粉末的高度达到离心管 的1/3处，停止加入粉末；2)在离心管中加入4ml 65°C预热的CTAB提取缓冲液[2%(v/w)CTAB，1. 4M NaCl,20mM EDTA，IOOmM Tris-HCl (ΡΗ=8· O)，2%巯基乙醇]；3)65°C温浴2h，中间每IOmin反转I 2次；4) 15000rpm离心8min，将上清液转入另一离心管中；5)冷却至室温后，轻柔加入等体积的氯仿和异戊醇溶液，其中氯仿和异戊醇的体积比为24 1，轻缓颠倒40min;6) 15000rpm室温离心IOmin,去沉淀,将上清液转入另一离心管中；7)在上清液加入2/3体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20°C放置1. 5h以上；8) 15000rpm 离心 IOmin,去上清液；9)用2ml 75%乙醇洗两次以去除盐，再用无水乙醇洗一次；10)倒去乙醇，37°〇干燥201^11，溶于60(^1^缓冲液，转移到1. 5ml离心管中；11)加入 5 μ L 终浓度为 50 μ L/mL RnaseA, 37°C温浴 Ih ；12)用等体积的酚、氯仿和异戊醇溶液对上述步骤(11)产生的溶液抽提2次，按体积比，酚氯仿异戊醇=25 :24:1;13) 15000rpm 离心 IOmin,取上清液；14)加入2倍体积的无水乙醇，_20°C保温lh，每20min翻转一次；15) 15000rpm离心，先用_20°C预冷的75%乙醇溶液洗涤沉淀2_3次，再用无水乙
醇洗涤一次。
16) 37°C温浴干燥DNA，加入100 μ LTE缓冲液溶解备用，4°C保存备用；(3) ISSR-PCR 扩增利用所提取的样品基因组DNA作为模板，在德国Eppendorf 5331梯度PCR仪上进行ISSR-PCR扩增，PCR反应体系特征为模板浓度25 ng/L，引物浓度O. 5 μ mol · L-1，Mg2+浓度 2. Ommol · L_S dNTP 浓度 200 μ mol · L—1，Taq 聚合酶浓度 1U/20 μ I ；PCR扩增程序条件为94°C预变性8分钟，94°C变性45秒，58_62°C退火45秒，72°C延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72°C终延伸10分钟；ISSR-PCR扩增反应得到不同金线莲样品的扩增产物贮存在一20°C冰箱中；(4 )琼脂糖凝胶电泳以4省10地金线莲的基因组DNA为模板，以其中两种引物进行ISSR-PCR扩增反应，取扩增产物5 μ L-15 μ L在1. 5 %的琼脂糖凝胶上于3V/cm的电压下电泳2. 5h，经EB显色，并用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果；(5)各供试样品的ISSR-PCR分子标记指纹图谱的构建把ISSR-PCR扩增反应得到不同新鲜金线莲样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱以金线莲品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据，采用Bandscan软件，选取亮度值在> O. 2为有扩增带，< O. 2的为没有扩增带；(6)将构建的ISSR-PCR分子标记指纹图谱保存，用于鉴定金线莲把未知样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的金线莲指纹图谱相比较，图谱相同即为安徽霍山产金线莲，否则不是安徽霍山产金线莲。所述的SSR-PCR扩增引物为下表中所列单引物中的I条引物或I条以上的引物的组合，经过一百条多条引物的试验比较，所选引物如下
权利要求
1.一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱，其特征存在于包括以下步骤 (1)新鲜金线莲样品预处理 将新鲜金线莲样品避光6个小时以上消耗淀粉，取新鲜的金线莲叶片10克，用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，擦干； (2)样品基因组DNA的提取 采用改进的CTAB法提取金线莲叶片基因组DNA，操作如下 1)将预处理后的叶片放入冰冻过的陶瓷研钵中，并加入适量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末状，用药匙将叶片粉末迅速转移到IOml预冷Eppendorf离心管中，粉末的高度达到离心管的1/3处，停止加入粉末； 2)在离心管中加入4ml65°C预热的CTAB提取缓冲液[2%(v/w) CTAB，1. 4M NaCl, 20mMEDTA，IOOmM Tris-HCl (ΡΗ=8· O)，2%巯基乙醇]； 3)65°C温浴2h，中间每IOmin反转I 2次； 4)15000rpm离心8min，将上清液转入另一离心管中； 5)冷却至室温后，轻柔加入等体积的氯仿和异戊醇溶液，其中氯仿和异戊醇的体积比为24 :1,轻缓颠倒40min; 6)15000rpm室温离心IOmin,去沉淀,将上清液转入另一离心管中； 7)在上清液加入2/3体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20°C放置1.5h以上； 8)15000rpm离心IOmin,去上清液； 9)用2ml75%乙醇洗两次以去除盐，再用无水乙醇洗一次； 10)倒去乙醇，37°C干燥20min，溶于600μ L缓冲液，转移到1. 5ml离心管中； 11)加入5 μ L 终浓度为 50 μ L/mL RnaseA，37°C温浴 Ih ； 12)用等体积的酚、氯仿和异戊醇溶液对上述步骤(11)产生的溶液抽提2次，按体积比，酌·:氯仿异戍醇=25 241； 13)15000rpm离心IOmin,取上清液； 14)加入2倍体积的无水乙醇，-20°C保温lh，每20min翻转一次； 15)15000rpm离心，先用-20°C预冷的75%乙醇溶液洗涤沉淀2-3次，再用无水乙醇洗漆一次。
16)37°C温浴干燥DNA，加入100 μ LTE缓冲液溶解备用，4°C保存备用；(3)ISSR-PCR 扩增 利用所提取的样品基因组DNA作为模板，在德国Eppendorf 5331梯度PCR仪上进行ISSR-PCR扩增，PCR反应体系特征为模板浓度25 ng/L，引物浓度O. 5 μ mo I · L-1，Mg2+浓度 2. Ommol · L—1，dNTP 浓度 200 μ mol · L—1，Taq 聚合酶浓度 I U/20 μ I ； PCR扩增程序条件为94°C预变性8分钟，94°C变性45秒，58-62 °C退火45秒，72 °C延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72°C终延伸10分钟； ISSR-PCR扩增反应得到不同金线莲样品的扩增产物贮存在一20°C冰箱中； (4)琼脂糖凝胶电泳 以4省10地金线莲的基因组DNA为模板，以其中两种引物进行ISSR-PCR扩增反应，取扩增产物5 μ L-15 μ L在1. 5%的琼脂糖凝胶上于3V/cm的电压下电泳2. 5h，经EB显色，并用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果； (5)各供试样品的ISSR-PCR分子标记指纹图谱的构建 把ISSR-PCR扩增反应得到不同新鲜金线莲样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱以金线莲品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用“一”表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据，采用Bandscan软件，选取亮度值在> O. 2为有扩增带，< O. 2的为没有扩增带； (6)将构建的ISSR-PCR分子标记指纹图谱保存，用于鉴定金线莲 把未知样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的金线莲指纹图谱相比较，图谱相同即为安徽霍山产金线莲，否则不是安徽霍山产金线莲。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱，其特征存在于，所述的SSR-PCR扩增引物为下表中所列单引物中的I条引物或I条以上的引物的组合，经过一百条多条引物的试验比较，所选引物如下
全文摘要
本发明公开了一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱。包金线莲样品的预处理、各样品基因组DNA的提取、ISSR-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、构建各供试样品的ISSR分子标记指纹图谱和将构建的ISSR分子标记指纹图谱用于金线莲种质的鉴定。本发明方法节约了时间和经济成本，通过对金线莲属植物的DNA的提取，ISSR-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，该方法对外形上容易混淆的品种从遗传本质上鉴定，具有简便快捷、重复性好、分辨率高等优点，而且在幼苗期即可进行鉴定，对于保证霍山产金线莲药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用。
文档编号C12Q1/68GK103060438SQ20121047248
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者邓辉, 余茂耘, 胡言龙 申请人:六安同济生生物科技有限公司