新型的红参发酵用微生物，及其利用该微生物的红参发酵液和红参发酵饮料的制作方法

专利名称：新型的红参发酵用微生物，及其利用该微生物的红参发酵液和红参发酵饮料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的红参发酵用微生物，及其利用该微生物的红参发酵液制造方法和红参发酵饮料。
背景技术：
红参皂甙的抗疲劳、增强免疫力、改善血行等效果已经得到证实，而且持续的研究结果表明，还具有防老抗老、保护肝功能、改善血液循环、改善痴呆和肝功能等功效。尤其是，红参的皂甙中难以吸收的主要皂甙(saponin) (Rgl, Re, Rbl, Re, Rb2以及Rd)经过加水分解生成的次要阜式(saponin) (Rg3, Rh2, Compound-K等)被报告,在实验鼠中具有阻碍肿瘤细胞的转移、在试管内阻碍肿瘤细胞的入侵、诱发癌细胞的自杀、抑制癌细胞的转移、降低血压、抑制儿茶酚胺激素(catecholamine)的分泌、激活镇痛剂以及增强免疫力等卓越的药理活性。这样随着次要皂甙(saponin)的卓越的药理活性得到验证，生成次要皂甙(saponin)的研究开展的非常活跃。主要尝试的方法有酸加水分解、热处理、酶加水分解以及有机合成等方法。其中，酶加水分解方法可以在低温中实施，操作简便，且由于酶的基质特性副产品非常少，所以说是生产次要皂甙(saponin)最合适的方法。目前为止，通过酶转换皂甙的研究主要集中在肠内细菌、土壤微生物以及植物组织中分离的微生物。但是，这些方法不适用于食用，所以在实用化方面还是有不少难度。另外，乳酸菌(lactic acid bacteria)是指大量生成乳酸(lactic acid)的细菌,利用食品内的糖(glucose)生成乳酸，不仅改善食品的口味，还进行食品的酸化，阻碍其他有害的微生物成长。并 且，乳酸菌栖息在各种动物的肠管内，保护消化管内的粘膜、改善肠内异常发酵、促进消化和吸收、促进维生素的合成以及钙的吸收等，所以在从红参的主要皂式(saponin)中生成次要阜式(saponin)时可以使用。
这些乳酸菌的培养通常都会使用比较典型的乳酸菌商用培基-MRS培基，但是这些商用培基在其成分或化学加工处理方法上，无法得知都使用了哪些材料、经过了哪些化学处理，所以不适合于食用。作为一个例子，韩国注册专利第0680318号记载了包括胰蛋白胨、大豆胨、蛋白胨等的微生物培养用营养培基的内容。但是，上述的制造胰蛋白胨、大豆胨、蛋白胨等的过程非常复杂，而且在制造过程中还包括了处理氢氧化钠等强碱基的人体有害的化学处理过程，在这样的培基中培养的微生物无法直接用于食用。因此,为了从红参的主要阜式(saponin)生成次要阜式(saponin),需要开发新型的乳酸菌菌株以及利用该菌株的红参发酵液的制造方法以及可直接用于食用的，采用对人体无害的材料的乳酸菌培养用培基。

发明内容
本发明的目的在于提供一种提升红参萃取液中所含的功能性次要皂甙(saponin)的转换效率的新型的红参发酵用微生物。本发明的目的在于提供一种利用上述微生物的红参发酵液制造方法。并且，本发明的目的在于提供一种使红参萃取液的功能性次要皂甙(saponin)的含量最大化，具有免疫活性和抗癌活性，可安全摄入的红参发酵饮料。技术方案
为了实现上述的目的，本发明提供具有序列编号8序列的红参发酵用微生物。根据本发明的一个实施方式，上述微生物呈现出，将红参所含的Rgl，Re, Rbl,Re, Rb2以及Rd中一个以上的主要阜式(saponin)转换成F2, Rg3, Rh2以及Compound-K中的一个以上次要皂甙(saponin)的特性。根据本发明的一个实施方式，上述微生物呈现出与副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)喊基序列 99% 以上的相同性。根据本发明的一个实施方式，上述微生物具有KCTC12108BP的寄托编号。本发明提供，将上述微生物添加到红参萃取液进行发酵的红参发酵液制造方法。根据本发明的一个实施方式，还包括，上述发酵阶段后还添加酶进行处理的阶段。根据本发明的一个实施方式，上述发酵时可以添加蔗糖(sucrose)或盐(NaCl)。根据本发明的一个实施方式，上述发酵时使用的微生物培养液是从白菜、萝卜、圆生菜、圆白菜、胡萝卜、香蕉、土豆和生菜组成的群组中选择的一个以上的蔬菜制造的。本发明提供，含有上述制造的红参发酵液的免疫增强用红参发酵饮料。并且，本发明提供，含有上述制造的红参发酵液的缓解癌症以及预防癌症的红参发酵饮料。有益效果
本发明的新型的红参发酵用微生物具有，以非常高的效率将红参所含的主要皂甙(saponin)转换成次要阜式(saponin)的特性，由此提高体内的阜式吸收效率。并且，本发明的红参发酵液制造方法优化本发明的新型的红参发酵用微生物的发酵环境，将次要皂甙(saponin)的转换效率提升2 3倍，而且使用可食用的微生物培养培基，保证食品安全性，节省成本。并且，本发明的红参发酵饮料具有非常优异的免疫活性以及抗癌活性(缓解癌症以及抗癌的效果)。


图1为按照本发明方法筛选的WJ-1，2，4，6，23，33发酵菌株的16S DNA碱基序列，图1a为WJ-1菌株、图1b为WJ-2菌株、图1c为WJ-4菌株、图1d为WJ-6菌株、图1e为WJ-23菌株、图1f为WJ-33菌株的16S rDNA碱基序列。图2为按照本发明方法筛选的发酵菌株的次要皂甙(saponin)转换能力的TLC层析观察结果图。图2a为WJ-1，2，4以及6菌株的红参萃取液中，将主要皂甙(saponin)转换为次要皂甙(saponin)的效果图(I号泳道:WJ-1，2号泳道:WJ-2，3号泳道:WJ-3，4号泳道:WJ-4，5号泳道:标准，6号泳道:WJ-5，7号泳道:WJ-6，8号泳道:WJ-8，9号泳道:WJ-9)。图2b为WJ-23，WJ-33菌株的红参萃取液中，将主要皂甙(saponin)转换为次要皂甙(saponin)的效果图(I号泳道:WJ-32，2号泳道:WJ-33，3号泳道:WJ-34，4号泳道:WJ-35，5号泳道:标准，6号泳道:WJ-36)。图3为利用WJ-33菌株的发酵过程中，分别添加蔗糖或盐时转换为次要皂甙(saponin)的结果图(I号泳道:WJ-32，2号泳道:WJ-33，3号泳道:WJ-34，4号泳道:WJ-35, 5号泳道:标准，6号泳道:WJ-36)。图4为同时使用按照本发明方法筛选的发酵菌株和作为诱导因子的蔗糖(sucrose)或盐(NaCl)时,转换为次要阜式(saponin)的转换效率观察结果。图4a为将WJ-2或WJ-4菌株和蔗糖(sucrose) —同添加到红参萃取液处理时，生成次要皂甙(saponin)的观察图(I号泳道:WJ-1，2号泳道:WJ-2，3号泳道:WJ-3，4号泳道:WJ-4，5号泳道:标准，6号泳道:WJ-5，7号泳道:WJ-6，8号泳道:WJ-8，9号泳道:WJ-9)。4b为将WJ-2或WJ-4菌株和盐(NaCl) —同添加到红参萃取液处理时，生成次要皂甙(saponin)的观察图(I号泳道:WJ-1，2号泳道:WJ-2 3号泳道:WJ-3，4号泳道:WJ-4, 5号泳道:标准，6号泳道:WJ-5，7号泳道:WJ-6，8号泳道:WJ-8，9号泳道:WJ-9)。图5为利用按照本发明方法筛选的发酵菌株进行发酵后，一同使用筛滤的酶时，转换为次要皂甙(saponin)的效率观察图(不同泳道采用不同％进行接种和反应)。图6为本发明红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的NO生成量确认结果。图7为 本发明红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的细胞生存率确认结果图。图8为本发明红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的TNF-α发现量确认结果图。图9为本发明红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的羊栖菜萃取物吞噬作用确认结果。(野生型；DMEM培养基(10% FBS), P-CON;
1-CON; DMEM 培养基(10% FBS) + 抑制剂(2 μ M /
红参；未发酵红参萃取液+酵母聚糖(zymosan),
发酵红参；本发明的红参发酵液+酵母聚糖(zymosan))
图10为口服本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的实验鼠的脾脏细胞增殖能力确认结果图。图11为口服本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的实验鼠腹腔巨噬细胞中的TNF-α发现确认结果图。图12为口服本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的实验鼠腹腔巨噬细胞中的IL-1 β发现确认结果图。图13为口服本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的实验鼠腹腔巨噬细胞中IL-6发现确认结果图。图14为口服本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的实验鼠血浆内的Compound K含量确认结果图。
酵母聚糖(Zymosan),
24hr) + 酵母聚糖(zymosan):
图15为本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)的抑制肺癌细胞增殖的活性确认结果图。图16为本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)抑制胃癌细胞增殖的活性确认结果。图17为本发明的红参发酵液(“发酵红参”)以及未发酵红参萃取液(“红参”)抑制大肠癌细胞的活性确认结果图。图18为按种类分别添加植物性素材的培基中，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lactobacillusparacasei subsp./paracasei)后，OD 值的测定结果图。

图19为分别添加糖的培基中，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei)后，0.D 值的测量结果图。图20为分别添加不同浓度的盐分以及营养成分的培基中，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种{LactobaciIlusparacasei subsp.paracasei)后，OD 值的测量结果图。图21为再添加植物性素材的培基中，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei)后，OD 值的测量结果图。图22为混合添加植物性素材的培基中，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lac tobaci llusparacasei subsp.paracasei) 24 小时后，OD 值的测量结果图。
具体实施例方式下面详细介绍本发明的具体实施方式
。本发明涉及一种新型的微生物以及利用该微生物的红参发酵液的制造方法以及红参发酵饮料。本发明的新型的微生物具有，将红参所含的主要皂甙(saponin)高效转化为次要皂甙(saponin)的特性，可以是从红参米酒中分离的。使用本发明的新型的微生物发酵红参制作饮料时，富含次要皂甙(saponin)，具有优异的免疫增强以及抗癌功效。本发明的主要阜式(saponin)可以是Rgl、Re、Rbl> Re、Rb2以及Rd中的一个以上，但不限于此。本发明的次要阜式(saponin)可以是F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一个以上，但不限于此。本发明的新型的微生物可以是新型的乳酸菌，具体而言，与布氏乳杆菌{Lactobacillus buchneri),类布氏乳杆菌{Lactobacillus parabuchneri),副干酪
杆菌苜1J 干酿亚 f中{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei), Lactobacillusharbinensis 或酵母菌酶母{Saccharomyces cerevisiae CBS405)的喊基序列呈现99%以上的相同性。并且，与布氏乳杆菌{Lac tobaciIlus buchneri),类布氏乳杆菌{Lactobacillus parabuchneri),副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei), Lactobacillus harbinensis 或酵母菌酶母{Saccharomycescerevisiae CBS405)相比,呈现出显著的次要阜式(saponin)转换效率的新的菌株。换句话说，本发明的新型的微生物可以是呈现出将红参所含的Rgl、Re、RbU Rc、Rb2以及Rd中的一个以上主要阜式(saponin)转换为F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一个以上次要皂甙(saponin)的特性的。尤其，本发明的新型的微生物是与副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)呈现出 99% 以上相同性的新菌株。
具体而言，上述的微生物可以是具有序列编号3至8中的某一个序列的，最好是具有序列编号8序列的。并且，本发明的微生物最好具有KCTC12108BP的寄托编号。并且，本发明涉及一种红参发酵液的制造方法，具体而言，包括将上述新型的微生物添加到红参萃取液进行发酵的阶段。根据本发明的一个实施方式，上述的微生物是以红参萃取液的总重量为准以0.001 3 %(v/w)的比例接种的。并且，本发明的红参发酵液制造方法是以红参发酵液的体积为准，以0.001 3% (v/v)的比例添加鹿糖(sucrose)或盐(NaCl)的。并且，利用本发明的新型的微生物发酵红参后，为了使皂甙(saponin)的转换能力加倍，可以在上述的红参发酵液中再添加食用酶。上述的酶只要是可食用的即可，没有其他限制。—方面，上述发酵时使用的微生物培养液可以是从可食用的物质中制作的培养液。上述可食用的物质可以是包括植物性素材、糖源以及营养成分的。本发明的植物性素材可以是白菜、萝卜、圆生菜、圆白菜、胡萝卜、香蕉、土豆以及生菜中的一个以上，其中萝卜的效果最佳。并且，作为植物性素材还可以包括萝卜、胡萝卜以及香蕉中的一个以上。上述植物性素材的添加量而言，微生物培养用培基成分的总重量为准，添加3 25%的重量比较好。这是因为各种植物性素材混合在一起，作为能量源使用。上述的植物性素材可以是以浓缩液的形态(type)或粉末形态(type)添加。
本发明中的糖源可以是鹿糖(sugar)、聚葡萄糖(polydextrose)、果糖(fructose),低聚糖(maltooligo)、葡萄糖(glucose)、糊精(dextrin)、低聚果糖(fructooligo)以及乳糖(lactose)中的一个以上，尤其是乳糖以及葡萄糖中的一个以上比较好。上述糖源是以微生物培养用培基成分的总重量为准，添加I 2.5%的重量为好。这是因为有一定程度的糖源时，乳酸菌的发育更活跃。本发明中的营养成分 采用酶母提取物(yeast extract)为好。上述酶母提取物是具有氨基酸和维生素等成分的纯天然添加物，可以购买商用食用酶母提取物使用。上述营养成分是以微生物培养用培基成分总重量为准，添加7 11%的重量为好。上述微生物培养用培基的成分还可以包括盐分。上述盐分最好是磷酸二钾(Dipotassium phosphate;K2HPO4)。上述盐分是以微生物培养用培基成分的总重量为准,添加0.01 0.03%的重量为好。本发明的微生物培养用培基成分是采用植物性材料的，所以能直接食用是其特征。尤其，可以用于发酵食品的制造中使用的微生物的培养。本发明涉及一种含有上述制造的红参发酵液的红参发酵饮料。本发明的红参发酵饮料呈现出非常强的增强免疫以及缓解和预防癌症的功效。上述红参发酵饮料的制造方法相关的记载内容，均适用于本发明的红参发酵饮料。下面结合实施方式和实验例子详细介绍本发明。但是，下面的实施方式和实验例子只是例示性的，本发明不会局限于下面的实施方式和实验例子，可以有更多的修改和变更。<新型的红参发酵菌株的获得以及同定>
实施方式1-新型的发酵菌株的获得(I)米酒中分离和培养乳酸菌
为了分离出红参发酵所需的乳酸菌，从忠南锦山、忠南麻田、大田广域市收集了人参、红参米酒以及生米酒等试料(在锦山市场购买)。从中分离100多菌株的乳酸菌后，利用红参米酒的灭菌水连续稀释至ΚΓ^ΚΓ5,在MRS agar plate中分别展开(spreading) 100后，在37°C培养基培养了 48小时。按照β -葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌能力筛选发酵菌株
上述(I)中分离和培养的发酵菌株中，为了筛选出具有皂甙转换能力的菌株，利用可验证皂甙转换能力的七叶苷琼脂(Esculin agar)方法，如下筛选了 β _葡萄糖苷酶(β -glucosidase)分泌菌株。众所周之，β_葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌菌株是切割七叶苷的β_葡萄糖(β-glucose)生成的esculetin (七叶苷中脱落β-glucose的结构)与朽1檬酸铁铵(ferric ammonium citrate)产生反应,在培基上的聚集地(colony)周围形成黑色的复合体(complex)。即，形成这些黑色复合体的乳酸菌具有皂甙转换能力，所以优先筛选了β -葡萄糖苷酶(β-glucosidase)分泌菌株。就是说，筛选了肉眼观察时在乳酸菌周围产生黑圈的菌株，这样筛选的菌株命名如表I。表I
从红参米酒中筛选的β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)分泌菌株
权利要求
1.一种具有序列编号8序列的红参发酵用微生物。
2.根据权利要求1所述的红参发酵用微生物，其特征在于，上述微生物可以将红参所含的Rgl、Re、RbU Re、Rb2以及Rd中的一个以上主要皂甙转换成F2、Rg3、Rh2以及Compound-K中的一个以上次要皂甙。
3.根据权利要求1所述的红参发酵用微生物，其特征在于， 上述微生物呈现出副干酪乳杆菌副干酪亚种{Lac tobaciIlus paracasei subsp.paracasei)碱基序列99%以上的相同性。
4.根据权利要求1所述的红参发酵用微生物，其特征在于，上述微生物具有KCTC12108BP的寄托编号。
5.一种红参发酵液的制造方法，其特征在于，包括，将权利要求1至权利要求4中的某一项微生物添加到红参萃取液进行发酵的阶段。
6.根据权利要求5所述 的红参发酵液制造方法，其特征在于，还包括，上述发酵阶段后，添加酶进行处理的阶段。
7.根据权利要求5所述的红参发酵液制造方法，其特征在于，上述发酵时，添加蔗糖或盐。
8.根据权利要求5所述的红参发酵液的制造方法，其特征在于，上述发酵时使用的微生物培养液是从白菜、萝卜、圆生菜、圆白菜、胡萝卜、橡胶、土豆和生菜组成的群组中选择的一个以上制造。
9.一种增强免疫用的红参发酵饮料，其特征在于，包括按照权利要求5的制造方法制造的红参发酵液。
10.一种缓解癌症以及预防癌症的红参发酵饮料，其特征在于，包括按照权利要求5的制造方法制造的红参发酵液。
全文摘要
新型的红参发酵用微生物，及其利用该微生物的红参发酵液和红参发酵饮料。本发明涉及一种具有序列编号8序列的红参发酵用微生物。
文档编号C12N1/20GK103173379SQ20121056811
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月24日 优先权日2011年12月22日
发明者金正勋, 柳炚旴, 李珠美, 金濠彬, 郑宰旭, 金相来 申请人:熊津食品有限公司