针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的课题为提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。本发明提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
【专利说明】针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。另外，本发明还涉及针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的单克隆抗体以及生产所述抗体的杂交瘤。
【背景技术】
[0002]通常广泛已知在生物体内肽自身具有激素、神经传导物质等各种各样的机能。近年公开了这样的肽中担负多个生理作用的肽。以往，一直认为被称作信号肽的短肽领域只担负使新合成蛋白质向内质网转移的作用，但是，近年，其他的生理作用相继被公开(非专利文献I)。
[0003]例如，已知钙网织蛋白(calreticulin)的信号肽的一部分通过主要组织相容性复合体(MHC)被提呈至细胞表面(非专利文献2)。对于该现象的生理学意义，考虑可能是为了监控细胞内蛋白质表达量或者正常的信号肽的生产比例的机制的一部分，但是没有得出结论。
[0004]另外提示，降钙素(calcitonin)的信号肽的一部分通过MHC被提呈至非小细胞性肺癌细胞的表面，细胞毒性T细胞将该信号肽作为表位识别，被期待涉及肿瘤疫苗的开发(非专利文献3)。
[0005]如上所述，逐步知晓信号肽不仅作为将蛋白质导入内质网的简单信号，而且具有新的生理?病理意义，不能否认尚未进行研究的信号肽与何种重要的生理现象例如作为原因不明的疑难病的重要因素相关的可能性。
[0006]作为所述疑难病的一例，可以举出阿尔茨海默病。阿尔茨海默病为以脑中的神经细胞脱落、淀粉状蛋白3蓄积、神经原纤维变化为病理特征的进行性认知症。基于该病理的特征，淀粉状蛋白0为根本原因的假说普及，虽对阿尔茨海默病的诊断?治疗方法进行了长年研究，但是，治疗方法根本不明确，甚至发病机理也尚未明确。鉴于这样的现状，最近，逐渐提出了淀粉状蛋白P原因说是否错误这样的意见(非专利文献4)。进而，存在提示淀粉状蛋白P以外的因子与阿尔茨海默病发病相关的报道。
[0007]非专利文献5中公开了，由淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到286残基的区域促进神经细胞的变性，笔者提到作为除淀粉状蛋白P以外的阿尔茨海默病的原因物质的可能性。
[0008]以往技术文献
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1:Trends in Cell Biology, 1998, vol.8, pp.410-415
[0011]非专利文献2:Science, 1992，vol.255，pp.1264-1266
[0012]非专利文献3 !Proceedings of the National Academy of Science s of theUnited States of America,2008, vol.29, n0.105,pp.10119-10124
[0013]非专利文献4:Nature,2008, vol.456, pp.161-164
[0014]非专利文献5 =Nature, 2009，vol.457，pp.981-989
【发明内容】
[0015]发明要解决的技术问题
[0016]非专利文献5公开了，由淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到第286残基的蛋白质促进神经变性，但是，没有公开到该领域内的哪个部分为神经变性的本质原因部分的程度。
[0017]解决技术问题的技术手段
[0018]由该淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到17残基中含有序列编号I表示的信号肽(Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg Ala:APP_SP)。因此，APP-SP具有有助于阿尔茨海默病的发病的可能性，今后，在用于阿尔茨海默病的诊断、治疗等方面，也可期待针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体是有用的。
[0019]本发明的一个目的在于，提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。
[0020]也就是说，本发明如下所述。
[0021](I)
[0022]针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
[0023](2)
[0024]如(I)所述的抗体，上述信号肽为含有序列编号I的氨基酸序列的肽。
[0025](3)
[0026]如⑴或者⑵所述的抗体，其是采用含有序列编号I的氨基酸序列的肽而得到的。
[0027](4)
[0028]如⑴~(3)中任一项所述的抗体，为单克隆抗体。
[0029](5)
[0030]生产(4)所述单克隆抗体的杂交瘤。
[0031](6)
[0032]为受理编号(NITE ABP-1198)表示的杂交瘤。
[0033]发明效果`
[0034]通过本发明，可以提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。本发明的孔APP-SP抗体有可能能够用于阿尔茨海默病的诊断、治疗等。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1表示实施例1中抗体效价的测定结果。
[0036]图2表示竞争ELISA的测定结果。
[0037]图3表示抗APP-SP单克隆抗体的ELISA测定结果。
[0038]图4表示对于随机APP-SP (序列编号2)的ELISA测定结果。
[0039]图5表示圆点印迹法中的测定结果。
[0040]图6表示参考例中的抗体效价测定结果。
【具体实施方式】[0041]以下，针对本发明，具体说明其优选的方式。需要说明的是，本发明并不限于为了实施以下发明的方式，可以在本发明主旨的范围内进行各种变形来实施。
[0042]本发明的抗体为针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体，该抗体优选为特异地识别淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
[0043]本发明中，所谓“淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽”(或者，有时表示为“APP-SP”)的含义为，由(a)序列编号I记载的氨基酸序列表示的肽。该序列中，在描述为Met (M)时表示游离(free)的蛋氨酸或者S-甲基蛋氨酸，氨基酸按照IUPAC的命名法由I个文字或者3个文字的表述来表不。
[0044]淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽可以为天然由来的游离的肽，也可以为按照以往公知的方法制备的肽。在肽合成的领域中，具有含有序列编号I的氨基酸序列的肽是既可以采用以往公知的方法化学合成，也可以采用微生物等利用重组技术合成的肽。
[0045]由本发明得到的识别APP-SP的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。根据近年的研究结果(例如，参照非专利文献5)，淀粉状蛋白前体蛋白质的含有信号肽部分的N末端区域显示促进神经细胞变性的作用，以作为阿尔茨海默病的原因物质被关注的APP-SP为抗原的抗体，将来可期待于能够应用于阿尔茨海默病的解析、诊断、治疗等。
[0046]本发明的针对APP-SP的抗体为使用含有APP-SP的抗原作为抗原而得到的抗体，可以使用例如，
[0047](a)含有序列编号I的氨 基酸序列的肽，或者
[0048](b)含有序列编号I的氨基酸序列中，I个或者多个氨基酸被替换、缺失、添加以及/或者插入后的氨基酸序列的肽，作为抗原。
[0049]优选，通过使用含有序列编号I的氨基酸序列的肽作为抗原而得到的抗体识别APP-SP。
[0050]抗原抗体反应可以通过使用上述抗原，像以往公知的那样，向被免疫动物给予作为抗原的物质来进行。
[0051 ] 通过给予作为抗原的物质，弓丨起被免疫动物中的免疫反应，从而可以生产本发明的针对APP-SP的抗体。
[0052]作为被免疫动物，没有特殊限定，但是，可以举出作为实验动物使用的豚鼠、大鼠、小鼠、兔以及棉羊等。
[0053]作为抗原的给予方案，没有特殊限定，但是，可以举出例如，皮下、腹腔内、静脉内、肌肉以及皮内等给予途径。作为抗原的给予方案，没有特殊限定，但是，可以通过例如，以2周的给予间隔，给予抗原约2~10次，从而生产针对APP-SP的抗体。
[0054]也可以根据给予方案适当地、由被免疫动物采集血清样本确认抗体的生产量,确认是否充分引起免疫反应。
[0055]最终免疫后，可以由被免疫动物采集血清，通过以往公知的方法精制得到抗APP-SP 抗体。
[0056]用于初次免疫、追加免疫的抗原给予量，没有特殊限定，但是，作为与APP-SP相当的抗原的给予量，可以为例如，每只小鼠给予10~200 ii g。
[0057]给予抗原时，也可以同时给予佐剂。作为所述佐剂，可以使用能够以高效价引起免疫反应的以往公知的佐剂。可以举出例如，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝等。[0058]通过本发明的抗体的制备方法，可以得到多克隆抗体，接着，通过以往公知的方法精制抗体，能够得到纯度高的抗体。
[0059]另外，通过由生产抗体的被免疫动物的脾脏或者淋巴结等采集生产抗体的细胞，可以制备杂交瘤，另外，也能够得到单克隆抗体。
[0060]为了得到本发明的针对APP-SP的抗体，可以使用如下抗原溶液。
[0061]作为抗原溶液是含有为了得到针对APP-SP的抗体的抗原的溶液，作为抗原而使用:
[0062](a)含有序列编号I的氨基酸序列的肽，或者
[0063](b)含有序列编号I的氨基酸序列中，I个或者多个氨基酸被替换、缺失、添加以及/或者插入后的氨基酸序列的肽时，
[0064]可以使用含有该肽与PEG类表面活性剂的肽胶束凝集体溶液作为抗原溶液。
[0065]本发明中，作为“PEG类表面活性剂”，只要是分子内具有聚乙二醇(P EG)结构的表面活性剂即没有特殊限定。
[0066]作为PEG类表面活性剂，可以举出，作为亲水性部分结构的PEG与，作为疏水性部分结构的胆固醇骨架、碳原子数8~20的饱和或者不饱和的脂肪族烃骨架等之间，通过与PEG末端的醇性羟基的醚键、酯键等而共价键合的化合物。
[0067]作为PEG部分的重复结构(乙二醇结构)的聚合度，为例如70以下，也可以为60以下。
[0068]作为PEG类表面活性剂，可以举出，例如，选自以下述式表示的组的至少I种化合物等。
[0069]化I
[0070]
H。卜。
mX
[0071](式中，m为O~10的整数，η为10~70的整数。χ为30~60的整数。)
[0072]式中，η或者χ表示重复结构的聚合度。
[0073]作为选自以上述式表示的组的至少I种化合物所示的PEG类表面活性剂，可以举出，上述式中，χ为50的CS-050，m为1、η为60的PEG60，η为36的PEG36，η为24的PEG24，η为12的PEG12等。
[0074]上述肽与含有PEG类表面活性剂的溶液之间的混合没有特殊限定，只要将上述肽混合入含有PEG类表面活性剂的溶液中即可。
[0075]接着，混合佐剂作为肽胶束凝集体溶液，通过将上述肽作为抗原给予至被免疫动物，可以得到抗APP-SP抗体。
[0076]作为佐剂，可以举出，例如，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝等。
[0077]混合佐剂时，优选使用超声波处理装置形成乳液。[0078]对于肽胶束凝集体溶液，为了统一肽胶束凝集体的粒度分布也可以进行整粒，也可通过例如由凝胶过滤色谱、利用滤膜的过滤等方法统一粒度。
[0079]肽胶束凝集体的粒度可以为5 μ m~200 μ m，也可以为5 μ m~100 μ m。
[0080]肽胶束凝集体的粒度可以使用日机装社制的动态光散射粒度测量装置进行测定。
[0081]作为以往公知的方法，在希望制作针对肽的抗体时，使用载体蛋白质共价结合有多个肽的抗原。
[0082]该肽与载体蛋白质的结合可以通过以往公知的方法形成。
[0083]作为载体蛋白质，可以举出，例如，匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、兔血清白蛋白(RSA)等。
[0084]使载体蛋白质结合上述肽时，可以在上述肽的N末端添加半胱氨酸等，使用与载体蛋白质结合的连接物(linker)。
[0085]作为所述连接物，只要是能够与载体蛋白质以及添加了半胱氨酸的肽相共价结合的连接物即没有特殊限定，但是，可以举出，例如具有N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(NHS酯)、马来酰亚胺、碳二亚胺等官能基团的连接物。
[0086]本发明中，使载体蛋白质上载有抗原部位而得到针对APP-SP的抗体的情况下，如实施例公开的那样，作为抗原，使用(a)含有序列编号I的氨基酸序列的肽那样的具有APP-SP全长肽的肽时，不能得到针对APP-SP的抗体。
`[0087]为了得到本发明的抗体，作为抗原的给予方法，没有特殊限定，但是，也可以测定抗体效价，给予抗原直到能够获得所希望的抗体效价。
[0088]抗体效价可以通过吸光度测定。抗体效价可以通过使用由被免疫动物适当采集的血液样本测定，优选使用通过离心分离等除去夹杂物的血清样本。
[0089]抗体效价没有特殊限定，但是，可以通过ELISA(enzymelinked immu nosorbentassay:酶联免疫吸附测定)等以往公知的方法测定。
[0090]通过追加免疫得到显示所期望的抗体效价的血清时，通过以往公知的方法精制，可以得到抗APP-SP抗体。
[0091]抗体的精制中，可以使用例如，离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等色谱精制，盐析等方法，按照这样由血清样本得到的抗体为识别APP-SP的多克隆抗体。
[0092]对于多克隆抗体的抗原特异性可以通过ELISA等方法确认。
[0093]在已知得到识别APP-SP的抗体的情况下，可以通过以往公知的方法，由被免疫动物的脾脏或者淋巴结等采集生产抗体的细胞。通过使用所得到的生产抗体的细胞进行细胞融合，可以得到杂交瘤(融合细胞)。通过使生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞(myelomacells)融合，可以得到杂交瘤。
[0094]作为与生产抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的通常能够获得的细胞株。
[0095]作为骨髓瘤细胞，可以举出例如，P3-X63-Ag8_Ul、SP2/0_Agl4等。
[0096]使细胞融合后，通过筛选，可以选择性地仅增殖杂交瘤。作为筛选方法，优选用HAT培养基等培养。此时，为了有助于杂交瘤的增殖，也可以与胸腺细胞等饲养细胞一起培养。得到的杂交瘤生产的抗体的抗原特异性可以将培养上清通过ELISA等公知的方法测定而确认，从而可以仅选择能够确认所期望的抗体生产的杂交瘤。接着，通过克隆得到的杂交瘤，除去混合存在的目的以外的细胞，可以得到含有单克隆的杂交瘤。作为克隆的方法，可以举出例如，有限稀释法、软琼脂法、纤维蛋白凝胶法等。得到的杂交瘤可以通过以往公知的方法冷冻保存。由克隆后的杂交瘤，可以通过以往公知的方法制备单克隆抗体。例如，可以在小鼠的腹腔内使杂交瘤增殖，精制含有单克隆抗体的腹水而制备。另外，也可以用无血清培养基培养杂交瘤，通过精制该培养上清来制备。
[0097]本发明中得到的抗体，在使用小鼠作为被免疫动物时，作为小鼠抗体，可以通过以往公知的方法，成为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。特别是，识别APP-SP的嵌合抗体、人源化抗体，人抗体是对于阿尔茨海默病的治疗有效的抗体。
[0098]实施例
[0099]以下，通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
[0100]实施例1:抗APP-SP单克隆抗体的制作
[0101](I)肽(APP-SP)的合成
[0102]委托GL生物有限公司(上海)，通过Fmoc固相合成法进行人淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP，序列编号I)的化学合成。
[0103]化学合成的肽(APP-SP)，通过采用ODS柱，使用了含有0.1 %三氟乙酸(TFA)的水/乙腈(MeCN)作为流动相的浓度梯度法进行精制。
[0104](2)抗原溶液的制作和免疫操作
[0105]使用下述式(I)表示的PEG60(polypure社制)作为PEG类表面活性剂,调制由
(I)化学合成的APP-SP，达到0.8mg/mL APP-SP、I % PEG60，得到APP-SP可溶化的混合水溶液。
[0106]式⑴:
[0107]
【权利要求】
1.一种抗体，其是针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述信号肽是含有序列编号I的氨基酸序列的肽。
3.根据权利要求1或者2所述的抗体，其是使用含有序列编号I的氨基酸序列的肽而得到的。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
5.一种杂交瘤,其生产权利要求4所述的单克隆抗体。
6.一种杂交瘤，其 由受理编号(NITE ABP-1198)表示。
【文档编号】C12P21/08GK103492415SQ201280004580
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年1月6日 优先权日:2011年1月7日
【发明者】福岛均, 花村雅人, 丹羽干夫, 冈本雅次, 直江智子, 吉田彻彦 申请人:精工爱普生株式会社, 东亚合成株式会社