双向、可移植的核糖开关介导的基因表达控制装置制造方法
【专利摘要】一种包含核酸分子的可调节的基因表达构建体，所述核酸分子包含操作性连接到靶序列的双向核糖开关。还提供用于有效创建靶-特异性核糖开关的文库筛选策略。茶碱-阻遏型和IPTG-诱导型的核糖开关装置以“双向”方式实现对基因表达控制的可移植控制。靶基因的缺省状态是开启(ON)；所述靶通过加入茶碱而被关闭，并且通过加入IPTG而不改变生长培养基又回到开启状态。所述核糖开关装置以可移植的、可调整的和双向方式调节基因表达，具有多种科学和生物技术的应用。
【专利说明】双向、可移植的核糖开关介导的基因表达控制装置
[0001]相关专利申请的交叉引用
本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请序列号61/503，453的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。
[0002]1.【技术领域】
本发明总体上涉及基因表达的调节。更具体地讲，本发明涉及在转录和翻译两者的水平上调苄基因表达的RNA调节装置。
[0003]2.背景
通过调节DNA向信使RNA (mRNA)转录的速率或mRNA向相应蛋白质翻译的速率，能够有效调苄基因表达。许多基因包含诱导型启动子区，其特异性控制与该启动子区操作性连接的一个或多个基因的表达。这些基因的转录在响应诱导物分子(包括代谢中间体)、物理条件的改变(包括温度变化)和外源分子(例如醇或抗生素)时可以被开启或关闭。然而，诱导型启动子并不适用于所有物理上相关的基因。因此，被称为核糖开关(riboswitch)的基于RNA的基因控制元件已经吸引了越来越多的注意力并且已经开发出人工核糖开关用于各种目的。
[0004]核糖开关是基于mRNA的调节装置，其介导配体-依赖性的基因表达控制。核糖开关包含适体区，所述适体区结合诱导物分子(配体)，并引起mRNA核糖开关的表达平台部分的结构变化，该变化反过来增加或者降低相应基因的表达。因此，核糖开关在翻译水平上调苄基因表达。一个实例是大肠杆菌iBscherichia coif)中的csrJ (碳忙存调节剂)基因的茶碱-应答性ON核糖开关，其提供对所得大肠杆菌开关-csrA突变体生物体的细胞自动聚集和运动力的灵活控·制。核糖开关还已经用于通过在诱导物分子例如茶碱存在时介导前-mRNA (pre-mRNA)剪接来调苄基因表达。
[0005]配体-依赖性核糖开关是单向开关，并且，一旦活化，只能通过去除核糖开关配体才可被关闭，这使它们在体内应用中不实用。对于体外应用，生长培养基必须被稀释或改变以去除核糖开关配体。另外，迄今为止所开发的核糖开关对给定靶基因具有特异性，而不适用于其它基因。这种可移植性的缺乏严重限制了适合这些核糖开关的应用。
[0006]获得在响应2个不同配体时提供双向调节的可移植核糖开关是合乎需要的。可将这样的核糖开关插入到任何靶基因的起始密码子的上游并对该基因的表达进行双向控制。这样的装置将会具有广泛应用，包括对基因功能的科研、包括基因治疗在内的医学应用和生物技术上的应用。
[0007]3.概述
已经发现某些天然的mRNA起到代谢物-敏感性基因开关的作用，其中所述RNA直接结合有机小分子。这样的结合过程改变了 mRNA的构象，这通过各种不同机制导致基因表达上的变化。这些天然的“核糖开关”的修饰形式(通过使用各种核酸工程策略而产生)可用作设计者基因开关，其由特定的效应子化合物控制。这样的活化核糖开关的效应子化合物在本文中被称为触发分子。天然的开关是抗生素和其它小分子治疗的靶标。另外，核糖开关的结构允许天然开关的实际片段用于构建新的非免疫原性的遗传控制元件。例如，适体(分子识别)结构域可被调换为其它非天然的适体(或经其它方式修饰的适体)，使得新的识别结构域引起采用用户限定的效应子化合物的遗传调节。这类改变的开关成为治疗方案的一部分-开启、或关闭、或调解蛋白质合成。新构建的遗传调节网络可应用于诸如活的生物传感器、生物体的代谢工程和高级形式的基因治疗等领域。
[0008]公开了分离的和重组的核糖开关，含有所述核糖开关的重组构建体，与所述核糖开关操作性连接的异源序列，以及携带所述核糖开关、核糖开关重组构建体和与异源序列操作性连接的核糖开关的细胞和转基因生物体。异源序列可以是例如编码目标蛋白或肽(包括报道蛋白或肽)的序列。优选的核糖开关是天然存在的核糖开关或衍生自天然存在的核糖开关。
[0009]还公开了含有异源的适体结构域和表达平台结构域的嵌合核糖开关。也就是说，嵌合核糖开关是由来自一个来源的适体结构域和来自另一来源的表达平台结构域组成。异源来源可来自例如不同的特异性核糖开关或不同类别的核糖开关。异源适体还可来自非核糖开关适体。异源表达平台结构域也可来自非核糖开关来源。
[0010]还公开了用于选择和鉴定能够活化、去活化(deactivate)或封闭核糖开关的化合物的组合物和方法。核糖开关的活化是指在结合触发分子后核糖开关的状态上的变化。核糖开关可通过非触发分子的化合物并且以非与触发分子结合的方式活化。术语触发分子在本文中用于指能够活化核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然的或正常的触发分子以及能够活化核糖开关的其它化合物。天然的或正常的触发分子是给定的自然界中的核糖开关的触发分子，或者在某些非天然的核糖开关的情况下，天然的或正常的触发分子是这样的触发分子:针对该触发分子设计核糖开关或者用该触发分子选择核糖开关(正如在例如体外选择或体外进化技术中的那样)。非天然的触发分子可称为非天然的触发分子。
[0011]核糖开关的去活化是指当触发分子未结合时核糖开关的状态上的变化。核糖开关可通过结合非触发分子的化合物并且以非去除触发分子的方式去活化。核糖开关的封闭是指当触发分子的存在未活化核糖开关时核糖开关的情况或状态。在具体的实施方案中，第一配体与核糖开关的结合活化了阻遏蛋白的表`达。反过来，阻遏蛋白表达的活化降低了靶基因的表达。在具体的实施方案中，第二配体与核糖开关的结合降低了阻遏蛋白的表达。反过来，降低的阻遏蛋白表达增加了靶基因的表达。
[0012]还公开了能够活化、去活化或封闭核糖开关的化合物和包含所述化合物的组合物。还公开了用于活化、去活化或封闭核糖开关的组合物和方法。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。化合物可用于活化、去活化或封闭核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其它活化化合物)可用于活化核糖开关。非触发分子的化合物通常可用于去活化或封闭核糖开关。核糖开关还可通过例如从核糖开关的存在中去除触发分子去活化。核糖开关可通过例如结合不活化核糖开关的触发分子的类似物来封闭。在某些实施方案中，控制阻遏蛋白表达的核糖开关的活化降低了靶基因的表达。
[0013]还公开了用于通过使化合物与RNA分子接触而改变所述RNA分子或编码所述RNA分子的基因的表达的组合物和方法，其中所述RNA分子包含核糖开关。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。因此，使包含核糖开关的目标RNA分子经历活化、去活化或封闭所述核糖开关的条件，这可用于改变所述RNA的表达。表达可由于例如终止转录或封闭核糖体与RNA的结合而改变。根据核糖开关的性质，触发分子的结合可降低或阻止RNA分子的表达或者促进或提高RNA分子的表达。
[0014]还公开了用于通过将核糖开关与RNA分子操作性连接而调节所述RNA分子或编码所述RNA分子的基因的表达的组合物和方法。可以任何合适方式将核糖开关与RNA分子操作性连接，所述方式包括例如通过将核糖开关与RNA分子物理连接，或通过工程改造编码RNA分子的核酸以包含和编码核糖开关，使得自工程改造的核酸所产生的RNA具有与RNA分子操作性连接的核糖开关。使与目标RNA分子操作性连接的核糖开关经历活化、去活化或封闭所述核糖开关的条件，这可用于改变所述RNA的表达。
[0015]还公开了用于通过活化、去活化或封闭核糖开关来调节含有所述核糖开关的天然存在的基因或RNA的表达的组合物和方法。如果所述基因是携带该基因的细胞或生物体生存必不可少的，活化、去活化或封闭所述核糖开关可导致所述细胞或生物体死亡、停滞或虚弱。例如，在微生物生存必不可少的天然存在的基因中活化天然存在的核糖开关，可导致该微生物死亡(如果所述核糖开关的活化关闭或抑制了表达)。这是所公开的化合物和方法用于抗微生物和抗生作用的一个基础。
[0016]还公开了用于通过活化、去活化或封闭核糖开关，调节含有所述核糖开关的分离的、工程改造的或重组的基因或RNA的表达的组合物和方法。可以任何方式改造或重组所述基因或RNA。例如，RNA的核糖开关和编码区可以是异源的，核糖开关可以是重组或嵌合的，或者两者。如果所述基因编码所需的表达产物，活化或去活化所述核糖开关可用于诱导该基因的表达并因此导致产生表达产物。如果所述基因编码基因表达或另一细胞过程的诱导物或阻遏物，则所述核糖开关的活化、去活化或封闭可导致其它被调节的基因或细胞过程的诱导、阻遏或去-阻遏。许多这样的次级调节作用是已知的并且可适用于核糖开关。作为这类调节的初级控制的核糖开关的优势是核糖开关触发分子可以是小的非抗原性分子。
[0017]还公开了用于通过将适体结构域与核糖开关的表达平台结构域操作性连接(所述核糖开关是嵌合核糖开关)，改变核糖开关的调节的组合物和方法。然后，所述适体结构域可通过例如所述适体结构域的触发分子的作用而介导对所述核糖开关的调节。可以任何合适方式将适体结构域与核糖开关的表达平台结构域操作性连接，所述方式包括例如通过用新的适体结构域替代所述核糖开关的正常的或天然的适体结构域。通常，能够活化、去活化或封闭适体结构域衍生的所述核糖开关的任何化合物或条件都可用于活化、去活化或封闭所述嵌合核糖开关。
[0018]还公开了用于通过共价改变核糖开关(通过例如交联核糖开关的一部分或者将化合物与核糖开关偶联)钝化(inactivating)核糖开关的组合物和方法。以该方式的核糖开关的钝化可起因于以下改变:例如，阻止核糖开关的触发分子结合，阻止在与触发分子结合后的核糖开关状态上的变化，或者阻止在与触发分子结合后的核糖开关的表达平台结构域对表达的影响。
[0019]还公开了活化、去活化或封闭核糖开关的化合物的鉴定方法。例如，活化核糖开关的化合物可通过使试验化合物与核糖开关接触并评价核糖开关的活化来鉴定。如果核糖开关被活化，则所述试验化合物就被鉴定为活化所述核糖开关的化合物。可以任何合适方式评价核糖开关的活化。例如，可将核糖开关与报道RNA连接并在试验化合物存在和不存在时测定报道RNA的表达、表达水平或表达水平上的变化。作为另一个实例，核糖开关可包含构象依赖性标记，来自所述标记的信号依赖于核糖开关的活化状态而变化。这样的核糖开关优选使用来自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。可使用对照测定或测量或者不使用对照测定或测量，对核糖开关的活化进行评价。用于鉴定去活化核糖开关的化合物的方法可以类似方式进行。
[0020]可以任何合适方式完成对封闭核糖开关的化合物的鉴定。例如，可在已知活化或去活化核糖开关的化合物存在时和在试验化合物存在时进行测定，以评价核糖开关的活化或去活化。如果未观察到活化或去活化，正如在试验化合物不存在时所观察的那样，则该试验化合物被鉴定为封闭核糖开关的活化或去活化的化合物。
[0021]还公开了生物传感器核糖开关。生物传感器核糖开关是经工程改造的核糖开关，其在它们关联的触发分子存在时产生可检测的信号。有用的生物传感器核糖开关在触发分子的阈值水平时或超过阈值水平时可被触发。生物传感器核糖开关可被设计为用于体内或体外。例如，通过工程改造细胞或生物体使其携带编码核糖开关/报道RNA的核酸构建体，可在体内使用与报道RNA操作性连接的生物传感器核糖开关，所述报道RNA编码作为信号或参与信号产生的蛋白质。用于体外的生物传感器核糖开关的实例是包含构象依赖性标记的核糖开关，来自所述标记的信号依赖于核糖开关的活化状态而变化。这样的生物传感器核糖开关优选使用来自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。还公开了使用生物传感器核糖开关来检测化合物的方法。所述方法可包括使试验样品和生物传感器核糖开关接触并评价生物传感器核糖开关的活化。生物传感器核糖开关的活化表明试验样品中存在着生物传感器核糖开关的触发分子。
[0022]还公开了通过鉴定活化、去活化或封闭核糖开关的化合物并制造所鉴定的化合物而制备的化合物。这可通过例如将在本文别处公开的化合物鉴定方法与制造所鉴定的化合物的方法组合而完成。例如，化合物可通过以下方法制备:使试验化合物与核糖开关接触，评价核糖开关的活化，并且如果试验化合物活化核糖开关，则制造活化核糖开关的试验化合物作为所述化合物。
[0023]还公开了通过检查化合物对核糖开关的活化、去活化或封闭并制造所检查的化合物而制备的化合物。这可通过例如将在本文别处公开的化合物活化、去活化或封闭评价方法与用于制造所检查的化合物的方法组合而完成。例如，化合物可通过以下方法制备:使试验化合物与核糖开关接触，评价核糖开关的活化，并且如果试验化合物活化核糖开关，则制造活化核糖开关的试验化合物作为所述化合物。检查化合物活化、去活化或封闭核糖开关的能力，是指鉴定先前未知的活化、去活化或封闭核糖开关的化合物以及评价已知活化、去活化或封闭核糖开关的化合物的活化、去活化或封闭核糖开关的能力。
[0024]还公开了用于选择、设计或获得识别新的触发分子的新的核糖开关和/或新的适体的方法。这样的方法可包括在核糖开关中产生一组适体变体，评价在目标化合物存在时变体核糖开关的活化，选择被活化的变体核糖开关(或者，例如，最高或最大选择性活化的核糖开关)，并重复这些步骤直到得到所需要的活性、特异性、活性和特异性的组合或其它特性组合的变体核糖开关。还公开了由这些方法产生的核糖开关和适体结构域。
[0025]所公开的核糖开关，包括其衍生物和重组形式，通常可来自任何来源，包括天然存在的核糖开关和重新设计的核糖开关。任何这样的核糖开关都可用于所公开的方法或通过所公开的方法使用。然而，可定义不同种类的核糖开关并且某些这样的亚类可用于特定方法或通过特定方法使用(通常如本文在别处所述)。核糖开关的种类包括例如天然存在的核糖开关、天然存在的核糖开关的衍生物和修饰形式、嵌合核糖开关和重组核糖开关。天然存在的核糖开关是具有自然界中存在的核糖开关序列的核糖开关。这样的天然存在的核糖开关可以是自然界中存在的天然存在的核糖开关的分离或重组形式。也就是说，核糖开关具有相同的一级结构，但经在新的遗传或核酸环境中分离或改造。嵌合核糖开关可由例如以下组成:任何或特定的核糖开关类别或种类的核糖开关的一部分和相同或任何不同的核糖开关类别或种类的不同核糖开关的一部分；任何或特定的核糖开关类别或种类的核糖开关的一部分和任何非核糖开关序列或组分。重组核糖开关是在新的遗传或核酸环境中分离或改造的核糖开关。
[0026]不同类别的核糖开关是指具有相同或相似的触发分子的核糖开关或具有相同或相似的总体结构(预测的、测定的或组合)的核糖开关。相同类别的核糖开关通常(但不必)具有相同或相似的触发分子和相同或相似的总体结构两者。
[0027]本文提供了包含核酸分子的可调节的基因表达构建体，所述核酸分子包含与某一序列操作性连接的核糖开关，其中所述核糖开关包含适体结构域和表达平台结构域。在某些实施方案中，所述核糖开关和序列是异源的。在某些实施方案中，所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。在某些实施方案中，所述核糖开关和序列是同源的。在某些实施方案中，所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。在某些实施方案中，所述表达平台结构域包含一个或多个表达调节元件。在某些实施方案中，所述适体结构域不控制核酶。
[0028]一方面，本文提供了基因表达控制装置(核糖开关)，包含:氯霉素抗性基因，其以5’至3’方向连接到茶碱特异性适体片段。所述茶碱-特异性适体片段的3’端连接到hc/基因的核糖体结合位点的5’端，然后是含有4个Iac启动子、2个Lac1-结合位点的天然
基因间隔区和IacZ的核糖体结合位点。当将该盒在靶基因的翻译起始位点的上游插入到大肠杆菌MG 1655基因组中时，靶基因的转录速率受到与适体结合的茶碱的控制。·
[0029]在特定的实施方案中，将所述茶碱-特异性适体片段与接头部分操作性连接。在某些实施方案中，将所述接头部分与4、5、6、7、8或9个核苷酸随机序列操作性连接。在特定的实施方案中，核苷酸随机序列具有5个核苷酸。在某些实施方案中，所述祀基因是lacZ、rpoS.、csrB 基因。
[0030]另一方面，本文提供了靶基因转录控制系统，包含:阻遏靶基因转录的转录阻遏蛋白和转录阻遏蛋白的2个结合位点，所述结合位点操作性地连接到所述靶基因。所述系统还包含ON-核糖开关，其具有操作性地连接到靶基因DNA基因座的转录阻遏蛋白的适体和表达平台。第一配体与核糖开关的适体的结合诱导了转录阻遏物的表达，其反过来减少了所述祀基因的表达，而第二配体与转录阻遏蛋白的结合增加了靶基因的表达。在特定的实施方案中，第一配体是茶碱。在特定的实施方案中，第二配体是IPTG。
[0031]另一方面，本文提供了靶基因控制系统，其包含0N-7aCJ核糖开关、LacI阻遏蛋白和2个LacI结合位点。0N_7acJ核糖开关、LacI阻遏蛋白和Lac1-结合位点位于同一条染色体上。Lac1-结合位点也可位于染色体外部的元件上而不影响所述装置在基因调节中的有效性。[0032]另一方面，本文提供了核糖开关盒文库，其包含在5’至3’方向上的以下元件:氯霉素抗性基因、茶碱-特异性适体片段、接头部分和5-nt随机序列。当将所述盒在靶基因的核糖体结合位点的5’位置上插入到大肠杆菌MG1655基因组中时，靶基因的转录受到与所述适体结合的茶碱的控制。使用标准测定方法检测靶基因的转录。
[0033]另一方面，本文提供了用于检测生物体的DNA克隆的方法。首先，在生物体的染色体上构建hcJ-hcZ构建体。然后，将具有茶碱-特异性适体片段的基因表达控制装置在所述hcJ-hcZ翻译融合物的核糖体结合位点的上游的位置插入到所述生物体的基因组中，以形成生物体的突变体群。然后，使DNA突变体群的一部分在无茶碱的溴-氯-氯-吲哚基-半乳吡喃糖苷(X-gal)琼脂板上生长。自不表达半乳糖苷酶活性的突变体生物体的所得白色菌落中选择克隆。使突变体生物体的所回收的白色克隆的一部分在有茶碱的X-gal琼脂板上生长。使用标准测定法，检测表现出β_半乳糖苷酶活性的所得蓝色克隆。
[0034]通过以下给出的不同实施方案的附图和发明详述说明本发明。附图不应视为将本发明限制在特定的实施方案中，而是用于解释和理解。发明详述和附图仅仅用于说明本发明而非限制，本发明的范围由所附权利要求书及其等同方案限定。附图不按比例。根据发明详述以及附图，将会更容易理解本发明的前述方面和其它相关优势。
[0035]在一个实施方案中，基因表达控制装置包含:氯霉素抗性基因，其以5’至3’方向连接到茶碱-特异性适体片段；所述茶碱-特异性适体片段的3’端以5’至3’方向连接到接头部分和5-nt随机序列的5’端基因，其前面是其天然核糖体结合位点；和含有Iac启动子和2个LacIb的天然lacl-lacl基因间隔区，其中当将所述控制装置在靶基因的翻译起始位点的上游插入到大肠杆菌MG1655基因组中时，所述靶基因的转录速率受到与所述适体结合的茶碱的控制。
[0036]在基因表达控制装置中，所述5-nt随机序列是以5’至3’方向的TGTAT。
[0037]此外，在基因表达控制装置中，所述靶基因选自7acZ基因座、基因座和基因座。
`[0038]本文提供了靶基因转录控制系统，包含:阻遏靶基因的DNA基因座的转录速率的转录阻遏蛋白；转录阻遏蛋白的2个结合位点，其操作性地连接到靶基因DNA基因座；和ON-核糖开关，其具有操作性地连接到靶基因的转录阻遏蛋白的适体和表达平台，其中第一配体与核糖开关的适体的结合减少了靶基因的表达，第二配体与转录阻遏蛋白的结合增加了靶基因的转录。
[0039]在靶基因转录控制系统中，第一配体与核糖开关的适体的结合诱导了转录阻遏蛋白的表达。
[0040]此外在上述系统中，ON-核糖开关是0N_7acJ核糖开关，转录阻遏蛋白是LacI阻遏蛋白，转录阻遏蛋白的2个结合位点是LacIb。
[0041]此外在上述系统中，靶基因选自7acZ基因座、基因座和arS基因座。
[0042]此外在上述系统中，第一配体是茶碱，第二配体是异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)。
[0043]此外在上述系统中，在细菌生长培养基中，靶基因的转录速率与约100 μΜ至约1600 μΜ范围内的茶碱浓度成反比。
[0044]此外在上述系统中，在细菌生长培养基中，靶基因的转录速率与约0.16 μΜ至约40μΜ范围内的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)浓度成正比。
[0045]还公开了 m-lacl核糖开关，其具有紧接着核糖体结合位点的上游的核苷酸序列GUAU，其中所述核糖开关在茶碱不存在时形成茎结构。
[0046]还公开了靶基因控制系统，其包含0N-7aCJ核糖开关、编码LacI阻遏蛋白的IacI基因和2个LacIb结合位点，其中0N-7acJ核糖开关和LacI阻遏蛋白位于一条染色体上，LacIb结合位点位于相同的染色体上。
[0047]还公开了靶基因控制系统，其包含m-lacl核糖开关、编码LacI阻遏蛋白的IacI基因和2个LacIb结合位点，其中m-lacl核糖开关和IacI位于一条染色体上，LacIb结合位点位于染色体外部的元件上。
[0048]还公开了核糖开关盒文库，其包含在5’至3’方向上的氯霉素抗性基因、茶碱-特异性适体片段、接头部分和5-nt随机序列-JacI基因和2个LacIb (LacI结合位点)，其中当将所述盒在靶基因的核糖体结合位点的5’位置上插入到大肠杆菌MG1655的基因组中时，靶基因的转录受到与适体结合的茶碱的控制，并使用标准测定方法检测靶基因的转录。
[0049]还公开了 用于检测生物体的茶碱敏感性DNA克隆的方法，所述方法包括以下步骤:a)在生物体的染色体上构建翻译融合物；b)将包含茶碱-特异性适体片段的基因表达控制装置在hcJ-hcZ翻译融合物的核糖体结合位点的5’位置上插入到生物体的基因组中，以形成DNA突变体群；c)使步骤b的DNA突变体群的一部分在无茶碱的X-gal琼脂板上生长；d)按标准测定法检测，自不表达β -半乳糖苷酶活性的DNA突变体生物体的所得白色菌落中选择克隆；e)使自步骤d的DNA突变体生物体的所得白色克隆的一部分在有茶碱的X-gal琼脂板上生长；和f)通过使用标准测定法，检测表现出β_半乳糖苷酶活性的蓝色克隆。
[0050]4.附图简述
图1A是环状AMP受体蛋白(由“crp”编码)的ON核糖开关的构建示意图。根据一个实施方案，通过使用基于文库筛选的方法，测定crp基因。
[0051]图1B是cr/7基因的OFF核糖开关的构建示意图，根据一个实施方案，通过使用基于文库筛选的方法，检测crp基因。
[0052]图1C显示根据一个实施方案，在2 mM茶碱存在和不存在时，0N-cr/7, 0￥￥~crp,Dcrp突变体和野生型大肠杆菌MG1655的IacrL活性。
[0053]图2A显示根据一个实施方案，在渐增浓度的茶碱存在时，大肠杆菌MG1655ON-CTjD菌株的运动力。
[0054]图2B显示根据一个实施方案，在渐增浓度的茶碱存在时，大肠杆菌MG1655OFF-CTjD菌株的运动力。
[0055]图2C显示在增加浓度的茶碱存在时，大肠杆菌MG1655野生型菌株的运动力。
[0056]图3A是根据一个实施方案使用文库筛选方法构建基因的ON-核糖开关的不意图。
[0057]图3B显示根据一个实施方案，在大肠杆菌MG1655的突变菌株中ON-1acI核糖开关对IacI表达的调节作用。
[0058]图3C显示根据一个实施方案，由LacI所调节的0N_7acJ核糖开关对IacZ表达的间接调节作用。[0059]图3D显示根据一个实施方案，由HacI核糖开关和Lac1-结合位点的组合所介导的对靶基因(即的双向、可调的控制。
[0060]图4A是显示根据一个实施方案，在茶碱存在和不存在时，ONUacJ核糖开关的预测结构的示意图。
[0061]图4B是显示根据一个实施方案，在茶碱存在和不存在时，0N2-hcJ核糖开关的预测结构的示意图。
[0062]图5A是显示根据一个实施方案，在茶碱存在和不存在时，0FF_7acJ核糖开关的预测结构的示意图。
[0063]图5B是显示根据一个实施方案，紧接着与IacZ融合的IeicI的RBS的上游的突变的茎(10 nt)环结构的结构的示意图。
[0064]图6A是根据一个实施方案，可移植的核糖开关系统的示意图。
[0065]图6B显不根据一个实施方案,对rpoS基因的可移植的、可调的、双向控制。
[0066]图7Α是根据一个实施方案,在携带廣0N_7acJ核糖开关的大肠杆菌菌株的自动聚集和生物膜形成中的反式作用基因控制系统和相应的表型变化的图示。
[0067]图7B显示根据一个实施方案，德荀pLacIb-CsrB构建体的ON-hcJ文肠杆菌菌株的细胞悬液的扫描图像和荧光显微图像。
[0068]图7C显示根据一个实施方案，茶碱和IPTG对由携带pLacIb-CsrB构建体的m-lacl大肠杆菌菌株所致的生物膜形成的影响。
·[0069]图7D是琼脂糖凝胶图像,显示根据一个实施方案，分离自德荀pLacIb-CsrB构建体的ON-^cJ文肠杆菌菌株的胞内CsrB、小的非编码RNA在PCR扩增后的水平。
[0070]图8A显示根据一个实施方案，野生型和株大肠杆菌的胞外乙酸浓度随时间变化的曲线。
[0071]图SB显示根据一个实施方案，野生型大肠杆菌、缺陷型大肠杆菌和缺陷型大肠杆菌的胞外乙酸浓度随时间变化的曲线。
[0072]图SC是显示大肠杆菌中的乙酸同化作用途径的示意图。
[0073]图8D显示根据一个实施方案，複荀acs-lacZ或ackA-lacZ翻译融合物、有或无rpoS的大肠杆菌菌株的Iacl活性。
[0074]5.发明详述
本文提供了可移植的可调节的基因表达构建体，其包含操作性连接到靶基因的双向核糖开关。所述核糖开关包含适体结构域、表达平台结构域、阻遏蛋白及其结合位点。
[0075]核糖开关的适体结构域符合高度保守的共有序列和结构。因此，序列同源性搜索可用于鉴定相关的核糖开关适体结构域。本文描述了使用核糖开关盒文库的方法，所述文库包含操作性连接到适体和阻遏蛋白的一段随机序列及其结合位点。在某些实施方案中，核糖开关RNA的适体结构域长度约70-170个核苷酸。在某些实施方案中，本文所提供的核糖开关的适体结构域是天然的适体序列。在某些实施方案中，适体结构域是以高亲和性和选择性发挥作用的人工适体。可通过本领域已知的常规方法测定靶配体的人工适体的亲和性和选择性。在某些实施方案中，构建体包含用于终止转录的终止信号。
[0076]在某些实施方案中，本文提供了响应茶碱的变体核糖开关。这些核糖开关携带在序列和二级结构上与茶碱-特异性适体亲近的适体结构域。变体核糖开关携带在适体的保守核心中的1、2、3、4、5或6个突变。在某些实施方案中，变体核糖开关携带在适体中的1-5、6-10、11-15、16-20个突变。在一个实施方案中，茶碱-特异性适体包含ATACCAGCATCGTCTTGATGCCCTTGGCAG 的核苷酸序列(AUACCAGCAUCGUCUUGAUGCCCUUGGCAG _图 4A、4B 和 5A)。
[0077]公开了分离的和重组的核糖开关，含有所述核糖开关的重组构建体，与所述核糖开关操作性连接的异源序列，以及携带所述核糖开关、核糖开关重组构建体和与异源序列操作性连接的核糖开关的细胞和转基因生物体。异源序列可以是例如编码目标蛋白或肽(包括报道蛋白或肽)的序列。优选的核糖开关是或衍生自天然存在的核糖开关。
[0078]所公开的核糖开关，包括其衍生物和重组形式，通常可来自任何来源，包括天然存在的核糖开关和重新设计的核糖开关。任何这样的核糖开关都可用于所公开的方法或通过所公开的方式使用。然而，可定义不同种类的核糖开关并且某些这样的亚类可用于特定方法或通过特定方法使用。核糖开关的种类包括例如天然存在的核糖开关、天然存在的核糖开关的衍生物和修饰形式、嵌合核糖开关和重组核糖开关。天然存在的核糖开关是具有自然界中存在的核糖开关序列的核糖开关。这样的天然存在的核糖开关可以是如自然界中存在的天然存在核糖开关的分离或重组形式。也就是说，核糖开关具有相同的一级结构，但不同于自然界中存在的核糖开关。重组核糖开关是使用重组技术而分离或改造的核糖开关。
[0079]还公开了含有异源适体结构域和表达平台结构域的嵌合核糖开关。也就是说，嵌合核糖开关是由来自一个来源的适体结构域和来自另一来源的表达平台结构域组成。异源来源可来自例如不同特异性的核糖开关、不同类型的核糖开关或不同种类的核糖开关。异源适体还可来自非核糖开关适体。异源表达平台结构域也可来自非核糖开关来源。
[0080]可根据其它已知的、已开发的或天然存在的核糖开关修饰核糖开关。例如，可通过改变一个或多个核苷酸修饰开关结构域部分，而保留核糖开关的已知或预测的二级、三级或二级和三级两者的结构。例如，可将一个碱基对中的两个核苷酸改变为同样能碱基配对的核苷酸。允许保留碱基配对的改变在本文中称为碱基对保守改变。
[0081]还可使用体外选择和进化技术`，产生修饰的或衍生的核糖开关。一般而言，应用于核糖开关的体外进化技术包括产生一组变体核糖开关，其中核糖开关序列的一部分或多部分不同，而核糖开关的其它部分则保持恒定。然后可评价这组变体核糖开关的活化、去活化或封闭(或其它功能的或结构的条件)并且选择满足目标条件的那些变体核糖开关用于使用或再一轮进化。
[0082]还公开了具有改变调节的修饰的核糖开关。可通过将适体结构域与核糖开关的表达平台结构域操作性连接(所述核糖开关是嵌合核糖开关)改变核糖开关的调节。然后，适体结构域可通过例如适体结构域的触发分子的作用介导核糖开关的调节。可以任何合适方式将适体结构域与核糖开关的表达平台结构域操作性连接，所述方式包括例如通过用新的适体结构域替代核糖开关的正常的或天然的适体结构域。通常，能够活化、去活化或封闭核糖开关(适体结构域从其中衍生)的任何化合物或条件都可用于活化、去活化或封闭嵌合核糖开关。
[0083]还公开了钝化的核糖开关。可通过共价改变核糖开关(通过例如交联核糖开关的一部分或者将化合物与核糖开关偶联)钝化核糖开关。以该方式的核糖开关的钝化可起因于例如以下改变:阻止核糖开关的触发分子结合，阻止在与触发分子结合后核糖开关状态上的变化，或者阻止在与触发分子结合后核糖开关的表达平台结构域对表达的影响。
[0084]还公开了识别新的触发分子的修饰的或衍生的核糖开关。可自已知核糖开关选择、设计或衍生识别新的触发分子的新的核糖开关和/或新的适体。这可通过例如以下方法完成:在核糖开关中产生一组适体变体，评价在目标化合物存在时变体核糖开关的活化，选择被活化的变体核糖开关(或者，例如，最高或最大选择性活化的核糖开关)，并重复这些步骤直到得到具有所需活性、特异性、活性和特异性的组合或其它特性组合的变体核糖开关。 [0085]特别有用的适体结构域可形成茎结构，在本文中称为Pl茎结构(或简称PD。Pl茎结构中的杂交链称为适体链(也称为Pla链)和控制链(也称为Plb链)。控制链可与适体链和所连接的表达平台中称为调节链(也称为Plc链)的序列形成茎结构。因此，控制链(Plb)可与适体链(Pla)和调节链(Plc)形成备选的茎结构。核糖开关的活化或去活化导致从一个茎结构向另一个的转换(从Pla/Plb到Plb/Plc或反之亦然)。Plb/Plc茎结构的形成影响含有核糖开关的RNA分子的表达。经由该控制机制操纵的核糖开关在本文中称为备选的茎结构核糖开关(或称为备选的茎核糖开关)。
[0086]一般而言，通过将表达平台结构域中的调节链设计或改变为与适体结构域的控制链互补，任何适体结构域都可适用于任何表达平台结构域。或者，可修改适体结构域的适体链和控制链的序列，使得控制链与表达平台中功能上重要的序列互补。
[0087]在某些实施方案中，增加或减少转录速率以及核糖开关和表达平台元件的间隔，用于适当控制。可通过例如包含聚合酶暂停元件(例如一系列尿苷残基)调节转录速率，以暂停转录并允许核糖开关形成和检测触发分子。
[0088]公开了包含编码RNA的核酸分子的可调节的基因表达构建体，所述RNA包含与编码区操作性连接的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的表达，其中所述核糖开关和编码区是异源的。核糖开关可包含适体结构域和表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。核糖开关可包含适体结构域和表达平台结构域，其中所述适体结构域包含Pl茎，其中Pl茎包含适体链和控制链，其中所述表达平台结构域包含调节链，其中所述调节链、控制链或两者被设计为形成茎结构。
[0089]公开了核糖开关，其中所述核糖开关是天然存在的核糖开关的非天然衍生物。所述核糖开关可包含适体结构域和表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可衍生自天然存在的茶碱-应答性核糖开关。所述核糖开关可被触发分子活化，其中当所述核糖开关被触发分子活化时产生信号。
[0090]本文描述和提到了许多核糖开关和核糖开关构建体。特别考虑的是，可从本文所公开的本发明的某些方面中排除任何特定的核糖开关或核糖开关构建体或核糖开关组或核糖开关构建体组。
[0091]本文提供了核糖开关的适体结构域，其可衍生自任何来源，包括例如核糖开关的天然的适体结构域、人工适体、工程改造的、选择的、进化的或衍生的适体或适体结构域。核糖开关中的适体通常具有至少一部分，其可例如通过形成茎结构与所连接的表达平台结构域的一部分相互作用。这种茎结构可在与触发分子结合后形成或者被破坏。
[0092]在某些实施方案中，可修饰天然存在的适体结构域以产生可用于核糖开关的修饰或变体适体结构域。保守修饰包括碱基配对的核苷酸中的任何改变，使得这一对中的核苷酸依然互补。
[0093]在某些实施方案中，在修改的适体结构域中可修饰Pl茎及其构成链，用于表达平台和RNA分子。这样的修饰(其可是广泛的)在本文中称为Pl修饰。Pl修饰包括对适体结构域的Pl茎的序列和/或长度的改变。
[0094]在某些实施方案中，所公开的核糖开关的适体结构域还可用于任何其它目的，和在任何其它情况下作为适体。例如，适体可用于控制核酶、其它分子开关和任何RNA分子，其中结构上的改变可影响RNA的功能。
[0095]表达平台结构域是核糖开关的一部分，其影响含有该核糖开关的RNA分子的表达。表达平台结构域通常具有至少一部分，其可例如通过形成茎结构与所连接的适体结构域的一部分相互作用。这种茎结构可在与触发分子结合后形成或者被破坏。茎结构通常或者是表达调节结构，或者阻止表达调节结构的形成。表达调节结构是这样的结构:其允许、阻止、增强或抑制含有该结构的RNA分子的表达。实例包括起始密码子、转录终止子以及稳定性和加工信号。
[0096]触发分子是能够活化核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然或正常的触发分子以及能够活化核糖开关的其它化合物。天然或正常的触发分子是给定的自然界中的核糖开关的触发分子，或者在某些非天然的核糖开关的情况下，选择这样的触发分子:针对该触发分子设计核糖开关或用该触发分子选择核糖开关(正如在例如体外选择或体外进化技术中的那样)。非天然的触发分子可称为非天然的触发分子。
[0097]还公开了化合物和含有所述化合物的组合物，所述化合物能够活化、去活化或封闭核糖开关。在某些实施方案中，所述化合物是配体。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。化合物可用于活化、去活化或封闭核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其它活化化合物)可用于活化核糖开关。非触发分子的化合物通常可用于去活化或封闭核糖开关。核糖开关·还可通过例如从核糖开关的存在中去除触发分子被去活化。核糖开关可通过例如与不活化核糖开关的触发分子的类似物结合被封闭。
[0098]还公开了用于改变RNA分子或编码RNA分子的基因的表达的化合物，其中所述RNA分子包含核糖开关。这可通过使化合物接触所述RNA分子而完成。
[0099]核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。因此，使包含核糖开关的目标RNA分子经历活化、去活化或封闭所述核糖开关的条件，可用于改变所述RNA的表达。表达可由于例如终止转录或封闭与RNA结合的核糖体而被改变。根据核糖开关的性质，触发分子的结合可降低或阻止RNA分子的表达或者促进或增加RNA分子的表达。
[0100]还公开了活化、去活化或封闭核糖开关的化合物的鉴定方法。例如，活化核糖开关的化合物可通过使试验化合物与核糖开关接触并评价所述核糖开关的活化而鉴定。如果核糖开关被活化，所述试验化合物被鉴定为活化所述核糖开关的化合物。可以任何合适方式评价核糖开关的活化。例如，可将核糖开关与报道RNA连接并在试验化合物存在和不存在时测定报道RNA的表达、表达水平或表达水平上的变化。作为另一个实例，核糖开关可包括构象依赖性标记，来自所述标记的信号依赖于核糖开关的活化状态而变化。这样的核糖开关优选使用来自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。正如所观察的，可使用对照测定或测量或者不使用对照测定或测量，对核糖开关的活化进行评价。可以类似方式进行对去活化核糖开关的化合物的鉴定方法。[0101]可以任何合适方式完成对封闭核糖开关的化合物的鉴定。例如，可在已知活化或去活化核糖开关的化合物存在时和在试验化合物存在时进行测定，以评价核糖开关的活化或去活化。如果未观察到活化或去活化，正如在试验化合物不存在时所观察的那样，则该试验化合物被鉴定为封闭所述核糖开关的活化或去活化的化合物。
[0102]所公开的核糖开关可用于任何合适的表达系统。使用载体例如质粒，有效地完成重组表达。载体可包含操作性连接到核糖开关-编码序列和待表达RNA (例如编码蛋白的RNA)的启动子。载体还可包含转录和翻译所需的其它元件。载体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体。可产生适于携带核糖开关-调节的构建体的多种原核的和真核的表达载体。这样的表达载体包括例如pET、pET3d、pCR2.UpBAD,pUC和酵母载体。所述载体可用于例如多种体内和体外情况。
[0103]病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疫病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经兀营养病毒(neuronal trophic virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和其它RNA病毒，包括具有HIV主链的病毒。还可使用共有这些病毒的使其适合用作载体的性质的任何病毒家族。Verma (1985)所描述的逆转录病毒载体包括鼠莫罗尼白血病病毒MMLV和作为载体表达MMLV的所需性质的逆转录病毒。通常，病毒载体含有非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录本、复制和包入衣壳所需的反向末端重复序列和控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当将病毒工程改造为载体时，其通常具有一个或多个早期基因被去除，并且将基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中以替代所去除的病毒DNA。
[0104]在某些实施方案中，构建体包含启动子。“启动子”通常是一个或多个DNA序列，其在对于转录起始位点而言的相对固定的位置上时起作用。“启动子”含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并可含有上游元件和反应元件。
[0105]在某些实施方案中，构建体包含增强子。“增强子”通常是指在距离转录起始位点的不固定的距离上起作用的DNA序列，其可以是在转录单元的5’或者3’。此外，增强子可在内含子内以及在编码序列本身内。它们通常长度在10 bp和300 bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子起到增加附近的启动子的转录的作用。增强子，如同启动子，也经常含有介导转录调节的反应元件。增强子通`常决定表达的调节。
[0106]用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)的表达载体还可含有终止转录所必需的序列，其可影响mRNA表达。将这些区转录为在编码组织因子蛋白的mRNA的未翻译部分中的聚腺苷酸化区段。3’未翻译区也包含转录终止位点。优选转录单元还含有聚腺苷酸化区。该区的一个好处是它增加了对已转录单元如同mRNA —样进行加工和运输的可能性。已经充分建立了对表达构建体中聚腺苷酸化信号的鉴定和使用。优选在构建体中使用同源聚腺苷酸化信号。
[0107]载体可包含编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定是否已将基因递送到细胞中并且一旦递送就会表达。优选的标记基因是大肠杆菌hcZ基因(其编码β-半乳糖苷酶)和基因(其编码绿色荧光蛋白)。
[0108]在某些实施方案中，标记可以是可选择标记。当将这样的可选择标记成功移入宿主细胞时，转化的宿主细胞在放在选择压力之下时可生存。有2个广泛使用的不同类型的选择性方案。第一类是基于细胞的代谢并使用缺乏不依赖补充培养基的生长能力的突变细胞系。第二类是优势选择，这是指用于任何细胞种类的选择方案并且不需要使用突变细胞系。所述方案通常使用药物以抑制宿主细胞生长。具有新基因的那些细胞将会表达具有抗药性的蛋白并在选择中生存下来。这样的优势选择的实例使用药物氯霉素、新霉素(Southern 和 Berg, 1982)、霉酌.酸(Mulligan 和 Berg, 1980)或潮霉素(Sugden 等人，1985)。
[0109]基因转移可使用直接转移以下载体中的遗传物质而获得:不限于质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体，或经由转移细胞或载体例如阳离子脂质体内的遗传物质而获得。这样的方法是本领域众所周知的并且容易修改以适用于本文所述的方法。转移载体可以是用于将基因递送到细胞的任何核苷酸构建体(例如质粒)，或作为递送基因的通用策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ram等人Cancer Res.53:83-88, (1993))。用于转染的合适方式，包括病毒载体、化学转染剂或物理-机械方法例如电穿孔和DNA的直接扩散，描述于例如Wolff, J.A.等人，Science,247，1465-1468，(1990);和 Wolff, J.A.Nature, 352，815-818，(1991)。
[0110]为了评价核糖开关的活化，可使用报道蛋白或肽。报道蛋白或肽可由RNA编码，所述RNA的表达受到核糖开关的调节。实施例描述了某些特异性报道蛋白的使用。报道蛋白和肽的使用是众所周知的并可容易地经修改而适用于核糖开关。报道蛋白可以是可被检测的或产生可检测信号的任何蛋白或肽。优选地，可使用标准技术(例如放射免疫测定、放射性标记、免疫测定、酶活性测定、吸光度、荧光、发光和蛋白质印迹)检测蛋白或肽的存在。更优选地，使用标准技术可以容易地定量测定报道蛋白的水平，甚至在低水平下。有用的报道蛋白包括萤光素酶、绿色荧光蛋白及它们的衍生物，例如来自萤火虫(/%o ii/wspyralis)的萤火虫萤光素酶(FL)和来自海肾^enilla reniformis)的海肾萤光素酶
(RL)。
[0111]一般而言，可以理解，定义本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可产生的那些变体和衍生物的一个方式，是通过按照与特定已知序列的同源性来定义变体和衍生物。一般而言，本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的变体通常与确定的序列或天然序列具有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的同源性。本领域技术人员容易理解如何测定两种蛋白质或核酸例如基因的同源性。例如，在比对两种序列之后可计算同源性，使得同源性在其最高水平。
[0112]计算同源性的另一方式可通过已公布的算法来进行。可通过局部同源性算法(Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)),通过同源性比对算法(Needleman和 Wunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970))、通过相似性方法的搜索(Pearson和 Lipman,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444 (1988))，通过这些算法的计算机执行(GAP,BESTFIT, FASTA 和 TFASTA，在威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage), Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, ffis.中)，或通过目测(by inspection),进行用于比较的序列最佳比对。
[0113]对于核酸，通过例如以下文献中公开的算法，可获得相同类型的同源性:Zuker, M.Science, 244:48-52，1989, Jaeger 等人 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:7706-7710，\9柳.Jaeger等K, Methods Enzymol..183:281-306，1989，其通过引用结合到本文中，用于至少与核酸比对相关的物质。可以理解，通常可使用这些方法中的任一种，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可以不同，但技术人员理解，如果用这些方法中的至少一种发现同一性(identity)，就可认为所述序列具有所述的同一性。
[0114]例如，如本文所用，认为某一序列与另一序列具有特定的百分比同源性，是指按照上述计算方法中的任何一种或多种计算，该序列具有所述的同源性。例如，使用Zuker计算方法，如果第一序列经计算与第二序列具有80%同源性，则第一序列与第二序列具有如本文中定义的80%同源性，即使按照其它计算方法中的任一种计算时第一序列与第二序列不具有80%同源性。作为另一实例，同时使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法，如果第一序列经计算与第二序列具有80%同源性，则第一序列与第二序列具有如本文中定义的80%同源性，即使按照Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或其它计算方法中的任一种计算时第一序列与第二序列不具有80%同源性。作为再一个实例，使用每种计算方法，如果第一序列经计算与第二序列具有80%同源性，则第一序列与第二序列具有如本文中定义的80%同源性(尽管在实践中，不同计算方法通常将会得到不同的计算同源性百分率)。
[0115]术语杂交通常是指至少2个核酸分子(例如引物或探针和核糖开关或基因)之间序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指以核苷酸特异性方式发生在2个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。通常序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面上。2个核酸的杂交受到本领域技术人员已知的多种条件和参数的影响。例如，反应的盐浓度、PH和温度都会影响到2个核酸分子是否杂交。
[0116]2个核酸分子之间的选择性杂交的参数是本领域技术人员众所周知的。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格的杂交条件。例如，杂交严格性受到杂交和洗涤步骤之一或两者的温度和盐浓度两者的控制。例如，获得选择性杂交的杂交条件可包括在高离子强度溶液^XSSC或6XSSPE)中、在低于Tm (解链温度，在该温度时半数分子与其杂交配偶体解离)约12-25°C的温度下杂交，然后在选择使得洗涤温度低于Tm约5°C-20°C的温度和盐浓度组合下洗涤。凭经验可在初步实验中容易地确定温度和盐条件，其中将固定在滤膜上的参考DNA样品与标记的目标核酸杂交，然后在不同严格性条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交，杂交温度通常更高。可使用如上所述的条件，或按照本领域已知的条件(Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ;Kunkel 等人Methods Enzymol.1987:154:367, 1987，其通过引用结合到本文中，用于至少与核酸杂交相关的物质)以达到严格性。对于DNA:DNA杂交，优选的严格杂交条件可以是在约68°C下(在水溶液中)在6XSSC或6XSSPE中，然后在68° C洗涤。如有必要，杂交和洗涤的严格性可随所需的互补性程度的降低而相应降低，并且此外还取决于在其中搜索变异性的任何区域的G-C或A-T丰富度。同样，如有必要，杂交和洗涤的严格性可随所需同源性的增加而相应增加，并且此外还取决于在其中需要高度同源性的任何区域的G-C或A-T丰富度，全部正如本领域已知的那样。
[0117]存在本文所公开的基于核酸的各种分子，包括例如核糖开关、适体以及编码核糖开关和适体的核酸。所公开的核酸可由例如核苷酸、核苷酸类似物、或核苷酸替代物组成。这些分子和其它分子的非限制性实例在本文中有讨论。可以理解，例如，当载体在细胞中表达时,所表达的mRNA通常由A、C、G和U组成。同样，可以理解，如果通过例如外源递送将核酸分子引入细胞或细胞环境，则核酸分子由核苷酸类似物组成是有利的，这减少了核酸分子在细胞环境中的降解。
[0118]只要维持它们的相关功能，核糖开关、适体、表达平台和任何其它寡核苷酸和核酸都可由修饰的核苷酸(核苷酸类似物)组成或包含修饰的核苷酸(核苷酸类似物)。许多修饰的核苷酸是已知的并可用于寡核苷酸和核酸中。核苷酸类似物是在碱基、糖或磷酸部分含有某一类型的修饰的核苷酸。碱基部分的修饰可包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基(例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基)的天然的和合成的修饰。修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤和3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。其他碱基修饰可见于例如:美国专矛I」号 3，687，808 ;Englisch 等人，Angewandte Chemie, International Edition, 1991,30, 613 ;和 Sanghvi, Y.S.,第 15 章，Antisense Research and Applications,第289-302 页，Crooke, S.Τ.和 Lebleu, B.编著，CRC Press, 1993。某些核苷酸类似物，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可增加双链体形成的稳定性。其它修饰的碱基是起通用碱基作用的那些碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基取代正常碱基，但在碱基配对中无偏好。也就是说，通用碱基可与任何其它碱基进行碱基配对。通常可将碱基修饰与例如糖修饰(例如2’ -O-甲氧基乙基)组合，以获得独特性质，例如增加的双链体稳定性。有很多美国专利号4，845，205 ;5，130，302 ;5，134，066 ；5，175，273 ;5，367，066 ;5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ;5，502，177 ；5，525，711 ;5，552，540 ;5，`587，469 ;5，594，121 ;5，596，091 ;5，614，617 ；和 5，681，941，其详述和描述了一系列碱基修饰。这些专利的每一篇都通过引用全部结合到本文中，尤其是对于碱基修饰、它们的合成、它们的用途和将它们掺入到寡核苷酸和核酸中的描述。
[0119]固体支持物是分子(例如触发分子)和核糖开关(或在所公开的方法中使用的或通过所公开的方法产生的其它成分)可与之缔合的固体-状态基底或支持物。核糖开关和其它分子可与固体支持物直接或间接地缔合。例如，可将分析物(例如触发分子、试验化合物)结合到固体支持物表面或者与固定在固体支持物上的捕获剂(例如结合分析物的化合物或分子)缔合。作为另一实例，可将核糖开关结合到固体支持物表面或者与固定在固体支持物上的探针缔合。阵列是将多个核糖开关、探针或其它分子以阵列、网格或其它组织形式缔合在其上的固体支持物。
[0120]用于固体支持物的固体-状态基底可包括组分可与之直接或间接缔合的任何固体材料。这包括例如以下材料:丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、硝基纤维素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧化乙烯、聚硅酸酯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基富马酸酯(polypropylfumerate)、胶原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固体-状态基底可具有任何有用形式，包括薄膜、膜、瓶、板、纤维、编织纤维、成型聚合物、颗粒、珠、微粒或组合。固体-状态基底和固体支持物可以是有孔的或无孔的。小片(chip)是长方形或方形的小片材料。固体-状态基底的优选形式是薄膜、珠或小片。固体-状态基底的有用形式是微量滴定板。在一些实施方案中，可使用多孔玻璃载玻片。
[0121]阵列可包含固定在固体支持物上的已鉴定或预定的位置上的多个核糖开关、触发分子、其它分子、化合物或探针。固体支持物上的每个预定位置通常具有同一类型的成分(也就是说，在该位置上的所有成分都是相同的)。或者，可将多种类型的成分固定在固体支持物的相同预定位置上。每个位置都具有多拷贝的给定成分。不同成分在固体支持物上的空间分离允许分别检测和鉴定。
[0122]尽管有用，但不需要固体支持物是单一单元或结构。一组核糖开关、触发分子、其它分子、化合物和/或探针可分布在任何数量的固体支持物上。例如，在一个极端，可将每种成分固定在分离的反应管或容器中，或固定在分离的珠或微粒上。
[0123]已充分建立了将寡核苷酸固定到固体-状态基底的方法。使用已建立的偶联方法，可将寡核苷酸(包括寻址探针和检测探针)偶联到基底上。例如，合适的连接方法描述于 Pease 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 91 (11): 5022-5026 (1994)和 Khrapko 等人，Mol Biol (Mosk) (USSR) 25:718-730 (1991)。将3’-胺寡核苷酸固定在包被酪蛋白的玻片上的方法描述于 Stimpson 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:6379-6383(1995)。将寡核苷酸连接到固体-状态基底的有用方法描述于Guo等人，Nucleic AcidsRes.22:5456-5465 (1994)。
[0124]固定在固体支持物上的每一成分(例如核糖开关、触发分子或其它分子)可位于固体支持物的不同预定区中。不同位置可以是不同的反应室。可将每个不同预定区与每个其它不同区物理地分开。固 体支持物的不同预定区之间的距离可以是固定的或者可变的。例如，在阵列中，可将每种成分安排在彼此固定的距离上，而与珠缔合的成分将没有固定的空间关系。具体地讲，使用多个固体支持物单元(例如，多个珠)将导致可变的距离。
[0125]可以任何密度，将成分缔合或固定在固体支持物上。可以超过400种不同成分/立方厘米的密度将成分固定到固体支持物上。成分的阵列可具有任何数量的成分。例如，阵列可具有固定在固体支持物上的至少1，000种不同成分，固定在固体支持物上的至少10，000种不同成分，固定在固体支持物上的至少100，000种不同成分，或固定在固体支持物上的至少1，000, 000种不同成分。
[0126]可将上述材料以及其它材料以任何合适组合包装在一起作为试剂盒，用于进行或有助于进行所公开的方法。如果在给定试剂盒中设计试剂盒成分并适用于所公开的方法，则是有利的。例如公开了用于检测化合物的试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个生物传感器核糖开关。试剂盒还可含有用于检测核糖开关的活化的试剂和标记。
[0127]公开了用于进行或有助于进行所公开的方法的系统。系统通常包括例如结构、机器、装置等制造品和组合物、化合物、材料等的组合。考虑这样的组合，其是公开的或者从公开内容中显而易见。例如，公开和考虑了包含生物传感器核糖开关、固体支持物和信号读取装置的系统。[0128]公开了用于所公开的方法、由所公开的方法产生或产生自所公开的方法的数据结构。数据结构通常是在组合物或介质中采集、组织、储存和/或包含的任何形式的数据、信息和/或对象。以电子形式储存在例如RAM中或在储存碟中的核糖开关结构和活化测量就是一种类型的数据结构。
[0129]所公开的方法、或其任何部分或为其的准备，可由计算机控制而控制、管理或以另外方式辅助。这样的计算机控制可由计算机控制的过程或方法来完成，可使用和/或产生数据结构，并可使用计算机程序。这样的计算机控制、计算机控制的过程、数据结构和计算机程序都被考虑并且应当理解为在本文中被公开。
[0130]公开了用于活化、去活化或封闭核糖开关的方法。这样的方法可包括例如，使核糖开关与能够活化、去活化或封闭该核糖开关的化合物或触发分子接触。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。化合物可用于活化、去活化或封闭核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其它活化化合物)可用于活化核糖开关。非触发分子的化合物通常可用于去活化或封闭核糖开关。核糖开关还可通过例如从核糖开关的存在中去除触发分子而去活化。因此，所公开的核糖开关去活化的方法可包括例如，从核糖开关的存在中或从与核糖开关的接触中去除触发分子(或其它活化化合物)。核糖开关可通过例如与不活化核糖开关的触发分子类似物结合而被封闭。
[0131]还公开了用于选择、设计或获得识别新的触发分子的新的核糖开关和/或新的适体的方法。这样的方法可包括在核糖开关中产生一组适体变体，评价在目标化合物存在时变体核糖开关的活化，选择被活化的变体核糖开关(或者，例如，最高或最大选择性活化的核糖开关)，并重复这些步骤直到得到具有所需活性、特异性、活性和特异性的组合或其它特性组合的变体核糖开关。还公开了由这些方法产生的核糖开关和适体结构域。
[0132]用于功能性核酸分子的体外选择和体外进化的技术是已知的并且可适用于核糖开关和它们的成分。有用的技术描述于例如，A.Roth和R.R.Breaker (2003)Selection in vitro of allosteric ribozymes.载于:Methods in MolecularBiology Series—Catalyt·ic Nucleic Acid Protocols (Sioud, M.编著)，Humana,Totowa, N.J.；R.R.Breaker (2002) Engineered Allosteric Ribozymes as BiosensorComponents.Curr.0pin.Biotechnol.13:31-39 ；G.M.Emilsson 和 R.R.Breaker(2002) Deoxyribozymes: New Activities and New Applications.Cell.MoL LifeSc1.59:596-607 ；Y.Li, R.R.Breaker (2001) In vitro Selection of Kinase andLigase Deoxyribozymes.Methods 23:179-190 ;G.A.Soukup, R.R.Breaker (2000)Allosteric Ribozymes.载于:Ribozymes: Biology and Biotechnology.R.K.Gaur和 G.Krupp 编著.Eaton 出版；G.A.Soukup, R.R.Breaker (2000) AllostericNucleic Acid Catalysts.Curr.0pin.Struct.Biol.10:318-325 ；G.A.Soukup,R.R.Breaker (1999) Nucleic Acid Molecular Switches.Trends Biotechnol.17:469-476 ；R.R.Breaker (1999) In vitro Selection of Self-cleaving Ribozymesand Deoxyribozymes.载于:1ntracellular Ribozyme Applications: Principlesand Protocols.L.Couture, J.Rossi 编著.Horizon Scientific Press, Norfolk,England ；R.R.Breaker (1997) In vitro Selection of Catalytic Polynucleotides.Chem.Rev.97:371-390 ;和其中引用的参考文献；这些出版物中的每一篇都通过引用他们对体外选择和进化技术的描述而特别地结合到本文中。
[0133]在本说明书全文中，同样的数字是指同样的元件。
[0134]本文提供了靶-特异性核糖开关装置，以及用于构建和检测所述装置的方法。在一个实施方案中，构建核糖开关装置，其在微生物中实现基因表达的双向控制，从而可以可逆地调节靶基因，而不改变微生物的生长环境。在某些实施方案中，所述装置是可调节的基因表达构建体。 [0135]在一个实施方案中，构建关闭-开启(off-on)核糖开关，其具有茶碱应答性适体作为传感器结构域。这些核糖开关在宿主微生物的染色体内在平衡时采用多个构象。所述构象中的一些允许下游靶基因表达；其它则阻遏靶基因表达。如果茶碱与适体结合有利于形成允许靶表达的构象，则核糖开关是ON-开关。相反，如果茶碱结合使平衡分布变为阻遏靶表达的构象，则核糖开关是OFF-开关。
[0136]在一个实施方案中，构建核糖开关文库并用于筛选在响应茶碱时有效控制靶基因表达的克隆。首先，自大肠杆菌ON-开关突变体分离DNA，所述突变体具有用于基因的茶碱应答性ON-核糖开关。使用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增茶碱-特异性适体片段。然后使用PCR连接方法将适体连接到氯霉素抗性基因(mi)，产生在染色体上含有
适体-接头-随机片段序列的核糖开关盒文库。基因有助于重组工程改造(重组工程)技术将盒插入基因组中，并且5 nt-随机序列允许核糖开关文库的构建。使用重组工程方法，将所述盒在紧接着靶基因的核糖体结合位点(RBS)上游整合到大肠杆菌MG1655菌株基因组中，产生大量突变体菌株。突变体菌株中的每个在染色体上携带核糖开关候选者(功能性或非功能性的)。在理论上，突变体文库含有45 (1024)个核糖开关候选者。
[0137]在一个实施方案中，选择大肠杆菌CTjD基因用于使用核糖开关的控制。CrjD基因编码环状AMP受体蛋白(CRP)，其是一种控制超过180个基因(包括基因)的转录起始的通用调节剂。CRP蛋白是产生β-半乳糖苷酶的基因的正调节剂。因此，CRP蛋白浓度与β_半乳糖苷酶水平线性相关，这允许通过检查β_半乳糖苷酶产生水平而检测crp基因表达。当将大肠杆菌维持在含有溴-氯-氯-吲哚基-半乳吡喃糖苷(X-gal)作为指示剂的平板上时，可通过蓝色来检测大肠杆菌菌落中的cr/7基因表达。或者，可使用标准β-半乳糖苷酶测定法定量测定β_半乳糖苷酶。
[0138]本文描述了阐明本文所提供的各种实施方案的实施例。
[0139]实施例1
使用大肠杆菌菌株MG1655。所有细菌菌株都在37°C下生长在Luria-Bertani (LB)培养基中，同时以220 rpm振摇。当合适时,抗生素氨节青霉素(50 Pg/ml)、卡那霉素(50 Pg/ml)和氯霉素(12.5 Pg/ml)用于选择。
[0140]为了筛选cr/7基因的操作性ON-核糖开关，使含有核糖开关盒102 (ca1-适体-接头-随机序列)的大肠杆菌161655突变体菌株在含有0.06 mg/ml X-gal和I mM IPTG但无茶碱的琼脂板104上生长(图1A)。因为CRP是IacZ 106转录所需的，低水平的CRP将导致白色菌落108。因此，选择在无茶碱的X-gal琼脂板104上生长的白色菌落108。筛选大约1500个菌落的颜色。相对于其它菌落，5个菌落显示白色。将这5个菌落放在含I mMIPTG和2 mM茶碱的琼脂板110上。培养24小时后，3个克隆形成蓝色菌落，表明它们携带ON核糖开关，所述核糖开关开启crp基因，使得在响应茶碱时IacZ魏(通过蓝色显示)。在包含茶碱的琼脂板110上选择最深的蓝色克隆(ON-cr/7菌株)，用于进一步试验。使用标准β_半乳糖苷酶测定法，证实其对茶碱的应答性；该测定的结果见图1C的图122，122-1列。测序结果表明ON-cr/7中的5 nt-随机序列是CATGC (CAUGC)。
[0141]先前已经证明CRP通过活化主要操纵子202的转录而增加细菌运动力，见图2A。测定ON-cr/7菌株的运动力表型，以进一步证实ON-核糖开关的有效性。0N-cr/7菌株在不存在茶碱的半固体运动力板204上显示出差的运动力，但当加入茶碱配体时获得运动力，如在板206中所示(图2A)。另外，0}1-crp菌株的运动力随更高茶碱浓度而增加，表明茶碱以浓度依赖性方式启动crp基因的翻译，并因此，ON-核糖开关可用于精细调节crp基因表达。
[0142]实施例2
为了筛选crp基因的操作性OFF开关(图1B)，将含有盒102 (上述)的大肠杆菌MG1655突变体菌株首先铺板在含有I mM IPTG和2 mM茶碱两者的X-gal板116上。根据白色菌落可能携带OFF-核糖开关并在响应茶碱时关闭crp基因表达的假设，选择白色菌落。筛选大约3000个菌落，与其它菌落相比，5个显示白色。将白色菌落在含I mM IPTG但无茶碱的X-gal板118上培养。得到I个蓝色克隆，表明该克隆在茶碱存在时几乎没有cr/7表达，但在茶碱配体不存在时却有相当大的cr/7表达。因此,该克隆(OFF-c/y?)携带了 crp基因的茶碱敏感性OFF-核糖开关。测序结果表明其随机序列是CCGGA。β -半乳糖苷酶测定证实OFF-cr/7在调节crp表达中的有效性；(图1C，图122，122-2列)。此外，0FF-cr/7在响应茶碱时以剂量依赖性方式精细调节所克隆的微生物的运动力(图2B)。结果见运动力板208和210。
[0143]实施例3
将上述用于构建合成的核糖开关的文库筛选方法应用于hc/基因。LacI蛋白众所周知是IacZ的阻遏物，因此IeicI基因的表达如同cr/7基因一样可在X_gal板上检测。构建在大肠杆菌MG1655 无效突变体的染色体上的翻译融合物，以说明在X-gal板上的文库筛选允许检测任何靶基因的核糖开关，只要hcZ与它们融合。
[0144]使用重组工程方法，将loxP-ca1-loxP选择盒插入到MG1655染色体上紧接着基因的终止密码子之后。然后，JacZ-loxP-ca1-loxP盒经PCR扩增并插入到(框架内)染色体上紧接着靶基因终止密码子之前。插入的hcZ片段从基因的第8个密码子开始，并且与所融合的基因共转录和翻译。使用β_半乳糖苷酶测定法定量测定基因融合物的表达。使用以下公式计算β_半乳糖苷酶水平:
单位(U) =00420 X 1000/(00600 χ水解时间χ水解物体积)。
[0145]为了工程改造IacI基因的ON-核糖开关，使用标准重组工程方法，将核糖开关盒302 {cat-适体-接头-随机序列)在Ieic1-1eicZ融合物304的核糖体结合位点上游整合到染色体上(图3A) 。
[0146]使所得突变体收集物生长在无茶碱的X-gal板306上。筛选大约2000个菌落的颜色。鉴定2个白色克隆。当生长在含茶碱的X-gal板308上时，这2个克隆都变为蓝色，表明它们含有茶碱敏感性ON-核糖开关302 (m-lacl)。对克隆测序，它们的随机序列分别显示为 TGTAT (UGUAU)和 CGTAT (CGUAU)。携带 TGTAT 的核糖开关(UGUAU-402-图 4A)称为0Nl-7acJ，携带CGTAT的核糖开关(CGUAU-406-图4B)称为0N2_7acJ。使用β -半乳糖苷酶测定法证实与有和无茶碱的Iac1-1acZ融合物304水平相比，携带IacI的TGTAT序列的ONl-7acJ的有效性(图310，图3B)。
[0147]用于构建cr/7廣基因的核糖开关的基于文库筛选的方法的成功应用，证明该方法不限于特定基因，而是一种可扩展的方法，可应用于许多基因座。
[0148]然后使用RNAstructure 5.1 软件程序(University of Rochester MedicalCenter, Rochester, NY),预测/ac/游ON和OFF核糖开关的二级结构。对于起始自33nt-茎-环结构(相对于翻译起始位点而言，-136 nt)和结束于的第100个核苷酸的237-nt长片段，进行所有核糖开关的二级结构预测。对于每个核糖开关，选择具有最小自由能的最佳结构，用于结构分析。为了预测配体-结合形式的核糖开关结构，我们利用了RNAstructure 5.1程序的“强制配对(force pair) ”功能，以促使茶碱结合袋的形成。
[0149]结构分析表明非-配体-结合状态的0Nl-7acJ紧邻RBS而形成9 bp-茎402 (图4A)。茎402不仅存在于最佳结构中，而且也存在于具有较高自由能的备选结构中(数据未显示)。除了第一核苷酸，随机序列有助于形成茎402。当茶碱与核糖开关结合时，构象改变，邻近RBS的长茎402不形成(图4A)，而是结构404取而代之。在0N2_7acJ中，发现类似茎结构406 (图4B)。当茶碱与核糖开关m1-leicl结合时，结构408形成，取代茎结构406。有趣的是，2个ON核糖开关的5 nt-随机序列共有后4个核苷酸，这不太可能是巧合。我们提出后4个核苷酸GUAU (406-图4B)通过作为紧接着RBS上游的长茎的一部分而成为ONl-hcJ席0N2-hcJ作用的关键。如果这是真的，那么在茶碱不存在时，核糖开关0FF-7acJ将不含邻近RBS的长茎，允许基因翻译；但当与配体结合时会形成茎结构，阻遏表达。如图5A所示，在茶碱存在(504)和不存在(502)时，0FF-7acJ的预测结构与该假设完全一致。另见5个核苷酸延伸CUGGU (CTGGT)。根据使用RNA structure 5.1的自由能预测，非结合状态的所有结构都具有比配体结合状态的结构更低的自由能(图4、5)，因此提出了在茶碱不存在时占优势。仅当茶碱与核糖开关结合时，平衡分布才会变为形成具有茶碱结合袋的结构，转换ON或OFF靶。为了证实邻近RBS的长茎在核糖开关-介导的基因控制中的作用，我们将长茎(10 nt)-环结构在紧接着与IacZ融合的IeicI的RBS的上游整合(图5B)。在称为茎的所得突变体中，由于长茎506的插入(图5B) ,Iac1-1acZ融合物的表达水平降低了 74% (见图5B图508)。总之，合成的核糖开关在响应茶碱时通过形成或破坏紧接着RBS上游的长茎(9-10 nt)而调节hc/表达。
[0150]上述核糖开关执行ON或OFF功能，但不能同时进行这两者，因此是“单向”开关。这些核糖开关在关闭状态时充分抑制靶基因的翻译，而在开启状态时则增加翻译。然而，在关闭状态时未实现对翻译的完全阻遏，在开启状态时也未实现野生型水平的翻译(图1C，图3B)。然而，核糖开关在宿主细菌培养中在响应茶碱浓度时精细调节它们的靶基因的表达，并调节宿主生物体的相应生物行为(运动力)。
[0151]现有技术已知 的核糖开关缺乏可移植性，因为核糖开关功能明显受到侧翼序列的影响，使得当一个基因的活性核糖开关与另一基因装配时变成惰性。在一个实施方案中，通过将0N-7acJ孩糖开关302与LacI蛋白和LacI结合位点(LacIb)组合构建双向系统，克服了这种局限。
[0152]LacI是通过与上游的2个LacIb结合抑制基因转录的转录阻遏蛋白。含有0N-hcJ孩.糖开关302的大肠杆菌突变体在配体(茶碱)不存在时表现出高基础水平的LacI表达，并且在所述配体存在时LacI水平仅有I倍的增加(图3B)。然而，当LacI阻遏物控制其下游靶时，ON-hcJ孩.糖开关302的狭窄的动态范围被放大。
[0153]实施例4
将m-lacl核糖开关302在原封基因(即未与IacZ融合)上游掺入到染色体中。LacI蛋白阻遏的表达，使得ON核糖开关302在响应茶碱时间接关闭当与LacIb (IacZ的上游)组合时，0N_7acJ 302在茶碱不存在时表现出部分阻遏但在茶碱存在时几乎完全阻遏表达(图3C)。因此，LacI阻遏蛋白起到中间调节剂作用并明显改进ON-hcJ孩11开关302的性能。
[0154]0N_7acJ核糖开关302使得双向基因调节成为可能，因为LacI阻遏蛋白可被异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)钝化。因此，将茶碱加入到培养基中，开启翻译，并在转录上抑制LacI靶基因。相比之下，IPTG通过与所述蛋白结合而钝化LacI，并且去阻遏所述靶基因的转录。
[0155]通过测定携带ON-hcJ核糖开关302和原封hcZ基因座两者的细胞的β -半乳糖苷酶水平，证实双向控制。茶碱和IPTG以相反方向以浓度依赖性方式调节(图3D图312)。茶碱的有效浓度范围为100-1600 μΜ。小于100 μΜ的茶碱浓度导致几乎没有调节，而高于此范围的浓度则不能引起额外的阻遏，表明已饱和。当将IPTG加入到含1600 μΜ茶碱的培养基中时，被去阻遏。IPTG的有效范围为0.16-40 μΜ。
[0156]基于LacI阻遏蛋白与LacIb (结合位点)的结合的诱导型基因控制已在原核细胞和真核细胞中广泛用于各种非基因，表明Lac1-应答性启动子的可诱导性受到下游靶影响的可能性较少。因此，当使用LacI作为可移植的调节剂时，0N-7ac/核糖开关302能够调节前面是LacIb的任何靶基因。与LacI蛋白和LacIb (t)N-7ac/-LacIb)组合的0N-7acJ核糖开关302作为放大的、可调的、双向和可移植的装置用于基因控制。ON-Jac1-LacIb装置短至2500 bp,因此可以容易地进行PCR扩增并整合到靶基因中。
`[0157]RpoS是RNA聚合酶的备选σ因子，控制超过200个基因的表达，并在多种应激(包括酸激、渗透应激、热激、氧化破坏和饥饿)存在时在存活的微生物中具有关键作用。RpoS阴性地调节沙门氏菌{Salmonella)毒力，并因此经突变以改造减毒活疫苗菌株。考虑到RpoS作为通用应答调节剂的重要性及其潜在医学用途，将基因置于ON-hc J-LacIb核糖开关装置的控制之下用于可调的和双向表达控制是合乎需要的。
[0158]实施例5
使用半定量逆转录酶PCR方法，扩增来自携带IacI的ON核糖开关的菌株的基因组的m-lac1-Laclb盒(2500bp)。盒602是由cat基因、0N_7acJ核糖开关、基因和含有2个LacIb的基因间隔区组成。cat基因促进经由重组工程在紧接着任何靶基因上游的该盒的整合。将所述核糖开关盒插入到rpoS基因座406的核糖体结合位点的上游(图6A)。然后，从该菌株中删除天然7acJ，产生新的突变体菌株，0N-7acJ-r/7o?。该菌株用于测试茶碱-应答性和Lac1-阻遏型调节盒602是否可控制rpoS基因座606。因为rpoS是抗酸性所需，所以在酸性条件下测定菌株602的生存。过夜培养物用酸(pH 2.0)处理2小时，然后在中性培养基中连续稀释。培养过夜后，测定酸处理的和未处理的细胞的菌落形成单位(CFU)。使用以下公式计算酸生存率(%):酸生存率(%)= 100 χ (处理的CFU/未处理的CFU)。[0159]在2小时酸处理(pH 2.0)之后，可与野生型菌株相比的含有盒602的突变体菌株的生存百分率表明了在茶碱不存在时表达开启，如图6B图610所示。在茶碱不存在时开关关闭IacI 604因此，基因座606是在开启状态中。当加入茶碱时，细胞变得对酸敏感(图6B)，提供以下证据:茶碱的加入开启了 604的表达并且后者阻遏了基因座606的表达。在茶碱不存在时的酸生存与野生型水平大致相同，并随茶碱浓度增加而降低(图6B曲线608)。酸生存达到最小值612，这可与当茶碱增加到1600 μΜ时无效突变大肠杆菌菌株的值相比。加入到含1600 μΜ茶碱的培养基中的IPTG浓度增加，导致在酸生存614上相应增加，并且在40 μΜ IPTG存在时恢复到野生型水平616，这与0N_7ac/菌株的反应曲线一致。基因座604的这些数据不仅证实了 0N-7acJ-LacIb602装置的可移植性、可保持性和双向控制特征，而且还表明该装置在用于其它医学目的的灵活地操作活疫苗和细菌的毒力和免疫原性中的潜在用途。
[0160]天然存在的、小的非编码RNA 众所周知是作为CsrA蛋白的拮抗剂。先前已经证明，非编码RNA CsrB通过经由CsrA蛋白间接活化操纵子的表达而促进细胞自动聚集和生物膜形成。
[0161]将CsrB-过量产生的细胞与m-lacl核糖开关302装置结合，以控制操纵子702并显示靶基因表达的反式作用调节(图7A)。先前已经将CkrS基因座706克隆到高拷贝载体(质粒)704中。将2个LacIb 112插入到转录起始位点附近，以将CkrS基因座706的表达置于ON-hcJ核糖开关302的控制之下。因为一个LacIb在转录起始位点之后，所以所得CsrB与天然CsrB有稍许不同，具有额外21 nt-序列(即LacIb)。IPTG诱导CsrB基因座706的表达并发生自动聚集(其起到Ckri?表达指示剂的作用)(数据未显示)，表明CsrB基因座706是功能性的。将该CsrB-携带的载体704引入0N-7acJ菌株，并检查自动聚集和生物膜形成。
[0162]为了测定自动聚集，将过夜培养物1:500稀释在液体LB培养基中，在37°C孵育，同时以220 rpm振摇。当细胞聚集(肉眼检查到液体培养基中的细胞凝块或“起毛(fluffing)”)时,将100 μ·?每种细胞悬液移至平底96孔板(Iwaki, Tokyo, Japan)并通过扫描而捕获细胞聚集的图像。为了更好地观察细胞聚集，将I μι结晶紫(0.1%)加入各细胞悬液，然后立即进行图像捕获。也通过显微镜检查细胞自动聚集。将细胞悬液涂抹在显微镜载玻片上，加热固定，用DAPI (4’6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，然后用带有DAPI滤片组的突光立体显微镜SZX12 (Olympus, Tokyo, Japan)成像。
[0163]生物膜在聚苯乙烯平底96孔微量滴定板(Iwaki，Tokyo, Japan)上形成。将200μ?每种细胞悬液(IO5细胞/ml)移入微量滴定板的各孔，在75 rpm振动器上，在37°C孵育24小时。将所得生物膜用PBS洗涤3次并风干。然后，将生物膜用100 μ? 0.4%结晶紫水溶液染色15分钟。然后，将生物膜用无菌蒸馏水洗涤3次并立即用200 μ? 95%乙醇脱色。脱色30分钟后，将100 μ?脱色溶液转入新孔并用微量滴定板阅读器(SpectraMAX 340Tunable Microplate Reader ；Molecular Devices Ltd.)在 595 nm 处测定。
[0164]在茶碱不存在时，LacI水平低并且CkrS 706表达被开启(图7A)。正如所料，细胞自动聚集并形成高水平的生物膜，显示因CsrB蛋白的过量产生而诱导了/7识702表达，见扫描710和图712 (图7B-C)。在茶碱存在时，表达被开启并且LacI阻遏蛋白阻遏了 CsrB的产生。基因座706的阻遏导致CsrA 708上调，这反过来又抑制了自动聚集和生物膜形成(图7A)。因此，对于自动聚集和形成低水平生物膜而言细胞是阴性的(图7B-C)。当加入IPTG以及茶碱时，抑制了 LacI阻遏蛋白的活性，并形成高水平的CsrB (图7A)。作为结果，在IPTG和茶碱存在时恢复了自动聚集和生物膜形成(图7B-C)。
[0165]通过半定量逆转录聚合酶链式反应方法(RT-PCR)，证实了在响应茶碱和IPTG时基因座706表达中的变化。从LB培养基中的过夜培养物中分离总RNA。然后，使用 ThermoScript RT-PCR 系统(Invitrogen),在 20 μ? 的总反应体积中，将 2 Pg RNA逆转录。每次反应都在55°C孵育50分钟，然后在70°C孵育15分钟。然后将2 μ?所得逆转录产物(cDNA)用于18、20、22和24轮PCR (在94 °C、55 °C和72 °C下各30秒)，使用 Ex Taq DNA 聚合酶(Takara Bio Inc.)和与 csrB 互补的引物(RT-CsrB-F:5’-GTCAGACAACGAAGTGAACATCAGG-3’ 和 RT-CsrB-R: 5’-GGAGCACTGTATTCACAGCGCT-3’)和 16S rRNA 基因(RT-16S-F: 5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 RT-16S-R:5’ -CTCCGTATTACCGCGGCTG-3’)，以共扩增目标基因和内部控制。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶714上分离。
[0166]这些结果(图7D)表明，0N-7acJ核糖开关302可与小的非编码RNA组合使用，以发挥对靶表达的反式作用控制，缓解了对染色体修饰的需要并扩展了这种核糖开关系统的应用。
[0167]细菌细胞从快速生长(这期间在丰富营养存在下产生和排出乙酸(异化作用))转换为缓慢生长(当葡萄糖被耗尽时由输入和利用所排出的乙酸(同化作用)所支持)。该生理事件被定义为乙酸开关，一种生存应答，其允许细胞在碳饥饿期间成功竞争。先前已有报道称，RpoS通过活化乙酰辅酶A合成酶(Acs)的表达而正向调节乙酸的消耗。然而，用本文提供的ON-hcJ-rpa?构建体，获得相反的结果。当ON-^c在ON状态时和在茶碱和IPTG两者都不存在时，细胞表现出类似于野生型菌株的乙酸同化作用，见图602 (图8A)。当在茶碱(2 mM)存在和IPTG不存在下生长时，表达被关闭，并因此促进了乙酸同化作用(图8A)。当将IPTG (I mM)加入培养基以去阻遏基因座606表达时，乙酸同化作用恢复到野生型水平`(图8A)。无论是茶碱还是IPTG，在野生型菌株中对乙酸同化作用都没有任何影响(数据未显示)，这排除了这两种化学品的可能的非特异性影响。用新构建的基因座无效突变体也观察到了增强的乙酸同化作用，见图804 (图8B)。将所有细胞悬液调节至OD 0.08，然后进行乙酸测定，并且具有不同RpoS活性的细胞显示出可比较的细胞生长率(数据未显示)，这排除了生长率对乙酸同化作用的任何可能影响。因此显而易见，RpoS阻遏了乙酸同化作用。
[0168]乙酸同化作用取决于乙酰-辅酶A合成酶(Acs)和磷酸转乙酰酶(Pta)-乙酸激酶(AckA)途径，806 (图SC)。因此似乎可能的是，RpoS抑制Acs和/或Pta-AckA途径，并且删除的将会增加它们的表达水平。因此，将细胞在乙酸同化作用的条件下孵育6小时，然后检查RpoS对Acs和AckA-Pta水平的可能影响。β -半乳糖苷酶数据表明,rpoS基因座606的去除轻微降低了染色体上的翻译融合物的表达，图808 (图8D)。然而，删除巧化基因座606，导致翻译融合物表达水平的5倍增加(图8D)。pta和ackA基因座都在同一操纵子中。数据揭示了与野生型相比,在rpoS无效突变体和茶碱-生长的细胞两者中Pta-AckA途径都被增强。因此，由此推定，由子rpoS基因座606阻遏或删除(在茶碱存在时QUac1-rpoS')而增加的乙酸同化作用，至少部分地归因于Pta-AckA途径的升高活性。
[0169]值得注意的是，RpoS在乙酸同化作用中的作用的这些结果与使用rpoS突变体的先前研究的结果相反。突变体在Am基因(编码H-NS，一种富含类核-相关蛋白)内频繁产生次级突变，以补偿RpoS功能的损失。因此，很可能那些研究中使用的突变体已经积累了类似的补偿突变并因此表现出相反的表型。如果这是真的，那么与野生型相比，删除了的细胞应当具有降低的清除胞外乙酸的能力。正如所料，去除抑制了乙酸同化作用，如持续高水平的胞外乙酸所显示(图8B)，这支持了以下观点:用突变体的先前观察可能是由在Aas中的补偿突变所致。
[0170]本发明并不由本文描述的具体实施方案来限定范围。事实上，除了所描述的那些之外，根据上述描述和附图，本发明的各种修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修饰意图落入所附权利要求书的范围之内。
[0171]本文所引用的所有参考文献都通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的至以下所述的程度，如同每个单独的出版物或专利或专利申请特别并单独地指出通过引用以其整体结合到本文中用于所有·目的。
【权利要求】
1.基因表达控制装置，包含: 氯霉素抗性基因，其以5’至3’方向连接到茶碱-特异性适体片段； 所述茶碱-特异性适体片段的3’端以5’至3’方向连接到接头部分和5-nt随机序列的5’端； hc/基因，其前面是其天然核糖体结合位点；和 含有4个启动子和2个LacIb的天然lacl-lacl基因间隔区，其中当将所述控制装置在靶基因的翻译起始位点的上游插入到大肠杆菌MG1655的基因组中时，所述靶基因的转录速率受到与所述适体结合的茶碱的控制。
2.权利要求1的装置，其中所述5-nt随机序列是以5’至3’方向的TGTAT。
3.权利要求1的装置，其中所述靶基因选自7acZ基因座、基因座和基因座。
4.靶基因转录控制系统，包含: 转录阻遏蛋白，其阻遏所述靶基因的DNA基因座的转录速率； 所述转录阻遏蛋白2个结合位点，其操作性地连接到所述靶基因DNA基因座；和 ON-核糖开关，其具有操作性地连接到所述靶基因的转录阻遏蛋白的适体和表达平台，其中第一配体与所述核糖开关的适体的结合减少了所述靶基因的表达，第二配体与所述转录阻遏蛋白的结合增加了所述靶基因的转录。
5.权利要求4的系统，其中第一配体与所述核糖开关的适体的结合诱导了所述转录阻遏蛋白的表达。
6.权利要求4的系统，其中所述ON-核糖开关是m-lacl核糖开关，所述转录阻遏蛋白是LacI阻遏蛋白，所述转录阻遏蛋白的2个结合位点是LacIb。
7.权利要求4的系统，其中所述靶基因选自7acZ基因座、基因座和基因座。
8.权利要求4的系统，其中所述第一配体是茶碱，第二配体是异丙基β-D-l-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)。
9.权利要求8的系统，其中在细菌生长培养基中，所述靶基因的转录速率与约100μΜ至约1600 μΜ范围内的茶碱浓度成反比。
10.权利要求8的系统，其中在细菌生长培养基中，所述靶基因的转录速率与约0.16μΜ至约40 μΜ范围内的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)浓度成正比。
11.0N-hcJ核糖开关，其具有紧接着核糖体结合位点的上游的核苷酸序列GUAU，其中所述核糖开关在茶碱不存在时形成茎结构。
12.靶基因控制系统，其包含0N_7acJ核糖开关、LacI阻遏蛋白和2个LacIb结合位点，其中所述HacI核糖开关和LacI阻遏蛋白位于一条染色体上,所述LacIb结合位点位于相同的染色体上。
13.靶基因控制系统，其包含0N_7acJ核糖开关、LacI阻遏蛋白和2个LacIb结合位点，其中0N_7acJ核糖开关和LacI阻遏蛋白位于染色体上，LacIb结合位点位于染色体外部的元件上。
14.核糖开关盒文库，其包含在5’至3’方向上的氯霉素抗性基因、茶碱-特异性适体片段、接头部分和5-nt随机序列基因和2个LacIb (结合位点)，其中当将所述盒在靶基因的核糖体结合位点的5’位置上插入到大肠杆菌MG1655的基因组中时，靶基因的转录受到与所述适体结合的茶碱的控制，并使用标准测定方法检测所述靶基因的转录。
15.用于检测生物体的茶碱敏感性DNA克隆的方法，所述方法包括以下步骤: a.在所述生物体的染色体上构建heJ-hcZ翻译融合物； b.将包含茶碱-特异性适体片段的基因表达控制装置在所述翻译融合物的核糖体结合位点的5’位置上插入到所述生物体的基因组中，以形成DNA突变体群； c.使步骤b的DNA突变体群的一部分在无茶碱的X-gal琼脂板上生长； d.按标准测定法检测，自不表达β_半乳糖苷酶活性的DNA突变体生物体的所得白色囷落中选择克隆； e.使自步骤d的DNA突变体生物体的所得白色克隆的一部分在有茶碱的X-gal琼脂板上生长；和 f.通过使用标准测定法，检测表现出β_半乳糖苷酶活性的蓝色克隆。
【文档编号】C12N15/90GK103797118SQ201280032539
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】黃建东, 金叶 申请人:香港大学