带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置制造方法

带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及用于解析细胞中的基因表达的方法、设备及装置。具体而言，本发明涉及一种基因表达解析用设备、以及使用该基因表达解析用设备的方法及装置；所述基因表达解析用设备的特征在于，具有在支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有核酸探针的支撑体，所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列、具有已知序列且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列、和具有已知序列的通用引物序列。
【专利说明】带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达 解析方法及基因表达解析装置

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于解析细胞中的基因表达的方法、设备及装置。

【背景技术】
[0002] 基因表达解析中使用如下方法，即，从细胞群中获取mRNA并制作作为其互补链的 cDNA，用PCR等扩增其拷贝数，使用DNA探针阵列（DNA芯片）在与靶对应的探针位置将其捕 获，并进行荧光检测。但是，使用PCR扩增和DNA芯片的方法的定量分析精度低，期待精度高 的基因表达谱分析方法。最近期望从1个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。作为定 量性良好的分析方法，虽然有定量PCR，但其为如下方法，即准备具有与靶相同的DNA序列 的标准试样，在相同条件下进行PCR扩增，用荧光探针监视扩增的进行情况并进行比较，从 而进行定量分析的方法。在靶为1个细胞时，原本mRNA数量就少，难以进行定量分析。此 夕卜，为了进行多个基因表达的定量分析，需要将试样分割并各自独立地进行定量分析。在作 为对象的基因数多、包含表达量少的基因时，还可能由于试样分割而无法测定。
[0003] 在这样的状况下，本发明人所在的研宄组考察了下述方法，即，制作将全部mRNA 变换为cDNA并保持在珠上的cDNA文库（包含全部cDNA的cDNA集合体），将其用于定量分 析。该方法显示，通过cDNA文库的重复利用避免了试样分割所致的微量表达基因的测定错 误，可以正确地测定1个细胞中包含的多个基因的表达量。
[0004] 此外，开始使用下述方法，S卩，将单个细胞中的微量mRNA通过逆转录变换为cDNA， 使用PCR扩增而进行核酸扩增后，使用大规模DNA测序仪对该扩增产物进行测序，并统计测 序结果，从而对扩增后的核酸序列数进行计数，由此推定mRNA分子数（非专利文献1)。该 方法能够测定的基因数的上限取决于大规模DNA测序仪的并列数，因此原理上不仅能够测 定2万几千种的全部的基因，而且还能够通过计数测定包括剪接变体在内的十万种序列。 此外，在多个反应槽的每一个中各插入一个细胞，将用于识别细胞的标签序列在液相下导 入反应槽中作为试剂，PCR扩增后将这些扩增产物集中到一起，用大规模DNA测序仪进行序 列解析，此时通过参照标签序列即能够鉴定出测序得到的扩增产物原来所在的细胞（非专 利文献1)。
[0005] 另一方面，PCR扩增时存在基因不同使得扩增率不同的扩增偏倚（bias)问题。非 专利文献2中提出如下方法，即由mRNA进行逆转录时引入随机序列，对该序列和靶cDNA同 时进行序列解析，从而从数据中去除在引入随机序列后进行的PCR扩增时发生的PCR偏倚 的影响（非专利文献2)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 非专利文献
[0008] 非专利文献 1 :Islam,S?等、GenomeResearchVol. 21，No. 7,pp. 1160-1167, 2011 年
[0009]非专利文献 2 :Kivioja，T?等、NatureMethods,Vol. 9,No.l，pp. 72-74, 2011 年
[0010] 发明要解决的课题
[0011] 如上所述，期望对构成组织的一个一个的细胞的内含物进行定量分析、以保存组 织的2维信息的形态定量监视各种基因的表达量。
[0012] 上述的通过对珠上的cDNA文库重复定量从而确定多个基因表达量的方法，能够 重复测定的次数仅限于10?20次左右，因此能够测定的基因数一定程度上受到限制。另一 方面，在逆转录及PCR扩增后使用大规模DNA测序仪的方法虽然测定基因数足够多，但通常 核酸扩增倍率因基因而异，或者扩增倍率的再现性低。进而，能够同时测定的细胞数为100 细胞左右以下，所需的试剂费用也非常高。
[0013] 此外，两种方法中任一种的情况下，为了实现单个细胞中的基因表达解析，都必须 将细胞分离一下并导入各个反应孔，进行细胞破碎、逆转录以及将用于PCR扩增的试剂分 注到这些反应孔中。因此，为了对数量众多的细胞进行解析而需要用于分注的机器手，解析 装置变得大型且变得昂贵。进而，为了代替用机器手进行的分注而使用微射流技术从细胞 提取mRNA、进行核酸扩增时，必须将反应液流路排列成列状，因此需要与排列数成比例地放 大芯片尺寸，因此微射流设备的尺寸变得大型且变得昂贵。
[0014] 为了对数量众多的细胞一次性、低成本地实现基因表达解析而使用cDNA文库片 时，虽然能够一次性地测定数量众多的细胞，但为了使能够解析的基因数增多，需要重复使 用cDNA文库。因此，解析基因数存在限制。
[0015] 因此，本发明的目的在于提供一种方法及手段，所述方法用于以1个细胞水平对 在构成生物体组织的多个细胞中表达的基因、以保存各个细胞的位置信息的形态进行基因 表达解析。
[0016] 用于解决问题的手段
[0017] 为了解决上述课题，本发明提供一种基因表达解析方法，其包括：于在支撑体表面 或表面附近2维地分布、固定有核酸探针的支撑体中，使作为靶的被检核酸与该核酸探针 杂交的工序，所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列、具有已知序列且根据在支撑体表面 或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列；进行与上述被检核酸互补的DNA 链的合成，制作由包含上述标签序列的DNA互补链构成的cDNA文库的工序；以及对上述 cDNA文库的全部或一部分进行核酸扩增的工序。此外，本发明提供用于实施上述方法的设 备及装置。
[0018] 发明的效果
[0019] 根据本发明，提供一种用于进行基因表达解析的方法、设备及装置。例如，本发明 中，对生物体组织内的全部细胞能够将表达的基因的mRNA变换成cDNA、以保存细胞在组织 内的位置信息的状态制作cDNA文库，因此能够获知关注的任意位置的基因表达、或全部位 置的基因表达。由此，能够使迄今为止无法获得的各种信息、如基因信息在组织中如何扩散 等可视化。因此，例如根据本发明可以获得基因信息在细胞或组织中的流动、刺激对组织的 影响等多种新信息。因此，本发明在基因表达解析、细胞功能解析、生物体组织的解析方法、 疾病的解明和诊断方法、药品开发等领域中有用。
[0020] 上述以外的课题、构成及效果通过以下的实施方式的说明可以明确。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1是表示本发明的方法的一例和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片）的 构成例及使用方式的图。
[0022] 图2是表示本发明的方法的一例和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片）的 构成例及使用方式的图。
[0023] 图3是表示用于捕获细胞的反应室的一例的上表面及剖面的图。
[0024] 图4是示意性地表示包含分子识别用标签序列的PCR扩增产物的测序数据的图。
[0025] 图5是表示本发明的方法的另一例和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片） 的构成例及使用方式的图。
[0026] 图6是表示本发明的方法的另一例和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片） 的构成例及使用方式的图。
[0027] 图7是表示本发明的方法的另一例和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片） 的构成例及使用方式的图。
[0028] 图8是表示用于调制细胞阵列的设备的一例的横剖面及剖面的图。
[0029] 图9是表示用于调制细胞阵列的设备的另一例的横剖面及剖面的图。
[0030] 图10是表示用于构建cDNA文库的基因表达解析用设备（珠）的构成例的图。
[0031] 图11是在基因表达解析用设备（细孔阵列片）中由组织切片构建cDNA文库的方 法的模式图。
[0032] 图12是表示本发明的基因表达解析用装置的构成例的图。
[0033] 图13是表示本发明的基因表达解析用装置的具体构成的一例的图。
[0034] 图14是表示本发明的基因表达解析用装置的具体构成的另一例的图。
[0035] 图15是表示本发明的基因表达解析用装置的具体构成的另一例的图。

【具体实施方式】
[0036] 本发明以保存生物体组织内的2维细胞分布信息的形态由被检核酸（例如mRNA) 制作cDNA文库片。此时，为了使得即使在其后的核酸扩增工序中获得的扩增产物从cDNA 文库片游离时、已知的标签序列（用于识别cDNA文库片上的位置或区域的序列）也能被包 含在扩增产物的部分序列中，在制作cDNA文库片的设备（支撑体）的表面或其表面附近固 定包含该已知的标签序列和用于捕捉被检核酸的序列的核酸探针。此时，在核酸探针中，可 以将核酸扩增工序中使用的通用扩增用引物序列配置在与上述标签序列相比的5'末端侧。 通过对由cDNA文库经核酸扩增工序而获得的扩增产物进行测序或荧光测定等光学测定从 而定量，由此确定基因表达量。此时，能够同时得到所获得的标签序列的信息，因此能够对 cDNA文库片上的各位置或区域确定特定的基因表达量。使用测序进行定量时，可以对由其 并列数而确定的数量众多的基因进行定量。此外，进行荧光测定时，由于进行核酸扩增工 序而使高荧光检测灵密度并非必需，能够利用的荧光体的种类增加且容易将多个荧光体组 合，可以使能够同时识别的基因数增加。
[0037] 因此，本发明的基因表达解析方法包含以下工序：
[0038] 于在支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有核酸探针的支撑体中，使作为靶 的被检核酸与该核酸探针杂交的工序、所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列、和具有已 知序列且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列。
[0039] 进行与上述被检核酸互补的DNA链的合成，制作由包含上述标签序列的DNA互补 链构成的cDNA文库的工序、以及
[0040] 对上述cDNA文库的全部或一部分进行核酸扩增的工序。
[0041] 本发明中，"基因表达解析"或"生物体分子表达解析"是指，对样品（细胞、组织切 片等）中的基因或生物体分子、即作为靶的被检核酸的表达进行定量分析，对样品中的基 因（被检核酸）或生物体分子的表达分布进行分析，获得样品中的特定的位置和基因（被 检核酸）或生物体分子表达量的相关性数据。
[0042] 样品只要是来自想要进行基因表达解析的生物体的样品即可，没有特别限定，可 以使用细胞样品、组织样品、液体样品等任意样品。具体而言，可以列举由1个细胞构成的 样品、包含多个细胞的样品、组织切片样品、使多个细胞中的各细胞排列成2维保持的阵列 状的样品等。
[0043] 此外，作为样品来源的生物体也没有特别限定，可以使用来自于脊椎动物（例如 哺乳类、鸟类、爬虫类、鱼类、两栖类等）、无脊椎动物（例如昆虫、线虫、甲壳类等）、原生生 物、植物、真菌、细菌、病毒等任意生物体的样品。
[0044] 本发明的方法中，关于作为靶的被检核酸，可以使用信使RNA(mRNA)、非编码 RNA(ncRNA)、microRNA和DNA、以及它们的片段。例如，可以通过该【技术领域】公知的方法提 取包含在样品中的核酸，来制备被检核酸。例如，可以使用蛋白酶K之类的蛋白酶、硫氰酸 胍?盐酸胍之类的离液盐、Tween及SDS之类的表面活性剂、或市售的细胞溶解用试剂将细 胞溶解，使其中包含的核酸即DNA及RNA溶出。使用mRNA作为被检核酸时，将上述的通过 细胞溶解而溶出的核酸中的DNA用DNA分解酶（DNase)分解，获得仅包含RNA作为被检核 酸的试样。
[0045] 本发明中，例如，作为靶的被检核酸的具体例没有限定，为构成生物体组织的细胞 内的mRNA、或排列成2维保持的阵列状的多个细胞内的mRNA。
[0046] 使用的核酸探针至少包含能够捕捉作为靶的被检核酸的序列（本说明书中称为 "被检核酸捕捉用序列"）和根据支撑体的位置?区域的不同而不同的序列（本说明书中称 为"细胞识别用标签序列"）。
[0047] 被检核酸捕捉用序列只要是能够与作为靶的被检核酸杂交并将其捕捉的序列即 可，没有特别限制，本领域技术人员可以考虑被检核酸的种类及序列而适当设计。例如，作 为靶的被检核酸为mRNA时，作为被检核酸捕捉用序列，优选使用聚T序列。包含聚T序列 的核酸探针、即寡聚（dT)可以根据常规方法合成，寡聚（dT)的聚合度为可以与mRNA的聚 A序列杂交并将mRNA捕捉至固定有包含寡聚（dT)的核酸探针的支撑体的聚合度即可。例 如，可以设为10?30碱基、10?20碱基、10?15碱基左右。此外，寡聚（dT)序列中，优 选在其3'末端附加2碱基的随机序列。由此能够大幅降低合成互补DNA链时的人为构造 (artifict)的量。作为这样的随机序列，有VN序列（V为A或G或C，N为A或G或C或T)。 此外，例如作为靶的被检核酸为microRNA、基因组DNA时，作为被检核酸捕捉用序列，可以 使用随机序列、与靶被检核酸的一部分互补的序列。
[0048] 细胞识别用标签序列可以设为包含任意长度的已知序列的序列。例如，通过使用 5碱基的已知序列，可以准备4 5(1024)种不同的细胞识别用标签序列。此外，例如通过使用 10碱基的已知序列，可以准备41(1种不同的细胞识别用标签序列。因此，关于细胞识别用标 签序列，根据欲识别的支撑体上的位置或区域的数量，按照可以准备出能够识别它们的不 同的细胞识别用标签序列的方式来确定其长度。具体而言，优选设为5?30碱基、5?20 喊基、5?15喊基或5?10喊基。
[0049] 核酸探针还可以包含分子识别用标签序列。分子识别用标签序列只要具有一定长 度（例如5?30碱基、优选10?20碱基、更优选10?15碱基）的随机序列，则没有特别 限制，可以是具有已知序列的序列或具有未知序列的序列。关于此后进行的核酸扩增工序， 当在容量特别大的支撑体（细孔片、珠等）中进行扩增时，根据扩增对象的被检核酸的长 度、序列构成、其存在位置等，扩增效率会产生偏倚。通过利用分子识别用标签序列，能够校 正核酸扩增工序中的扩增偏倚，能够进行准确的定量。作为具体的分子识别用标签序列，可 以使用例如序列号25?29所示的随机序列。
[0050] 此外，核酸探针也可以是还包含通用引物序列（扩增用通用序列）的序列。通用 引物序列只要具有适合于进行核酸扩增的长度的已知序列则没有特别限制。这样的通用引 物序列可以由本领域技术人员适当设计。例如，通用引物序列可以设为10?50碱基、15? 50碱基、15?40碱基、15?30碱基、15?20碱基长。通过将这样的通用引物序列添加至 核酸探针中，能够简便地实施此后的核酸扩增工序中的扩增反应。
[0051] 如后所述，核酸扩增工序中，在利用转录因子进行由cDNA转录为cRNA的转录反应 时，核酸探针优选还包含转录因子的启动子序列。作为这样的启动子序列，使用T7,此外可 以列举SP6、T3等。在核酸的扩增中，使用I7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶的 活性。附加至核酸探针中的转录因子的启动子序列可以根据所使用的转录因子的种类来选 择。例如，使用T7RNA聚合酶作为转录因子时，可以将T7启动子序列（具体而言，例如序列 号24的碱基1?42位所示的序列）附加至核酸探针中。使用了转录因子的启动子序列的 核酸扩增为等温扩增，因此不仅不需要用于施加温度循环的温度控制器，而且可以降低固 定在设备表面的探针DNA高温时发生脱离的可能性。
[0052] 关于核酸探针中的被检核酸捕捉用序列及细胞识别用标签序列的位置、以及当存 在分子识别用标签序列和/或通用引物序列和/或转录因子的启动子序列时它们的位置， 本领域技术人员可以容易地理解、设计。
[0053] 本发明中，预先将核酸探针2维地分布、固定在支撑体的表面或表面附近。由此， 不会损伤包含作为靶的被检核酸（或生物体分子）的细胞或组织、也不使用机器手等就能 够获得来自源于各细胞的被检核酸的基因信息。特别是，由于不会损伤细胞或组织，因此能 够避免该损伤所致的基因表达的变化。
[0054] 使用的支撑体只要是在cDNA文库的制作【技术领域】中通常使用的材料而制作的， 则没有特别限制，例如片、滤膜（membrane)、凝胶膜、毛细管板、珠、薄膜等。作为其材料，可 以列举例如金、银、铜、铝、钨、钼、铬、铂、钛、镍等金属；不锈钢等合金；硅；玻璃、石英玻璃、 熔融石英、合成石英、氧化铝及感光性玻璃等玻璃材料（这些材料基本上是透明的）；聚酯 树脂、聚苯乙稀、聚乙稀树脂、聚丙稀树脂、ABS树脂（AcrylonitrileButadieneStyrene树 脂）、尼龙、丙烯酸类树脂及氯乙烯树脂等塑料（一般不透明，但为了能够进行光学测定而 希望设为透明材料）；琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚乙烯醇、硝基纤维素、几丁质、壳聚糖。例 如使用片作为支撑体时，可以用例如氧化铝、玻璃等制作片。此外，使用凝胶膜作为支撑体 时，可以使用例如丙烯酰胺凝胶、明胶、修饰聚乙烯醇、修饰聚乙烯基吡咯烷酮、水凝胶等制 作凝胶膜。使用滤膜作为支撑体时，可以使用例如纤维素醋酸酯、硝基纤维素或它们的混合 滤膜、尼龙滤膜等。使用珠作为支撑体时，可以使用树脂材料（聚苯乙烯等）、氧化物（玻璃 等）、金属（铁等）、琼脂糖凝胶、及这些的组合等来制作珠。从操作的简便性出发，优选使 用磁性珠。一个实施方式中，支撑体优选由对于波长300nm?lOOOOnm的光中的至少部分 波长的光为透明的材料制作。由此，能够在支撑体上通过光学方法进行基因表达的解析。
[0055] 在此，优选支撑体具有2维分区而成的多个微细空间，以使cDNA文库中以保存2 维位置信息的状态来保持cDNA。例如，通过在片、凝胶膜、毛细管板上设置细孔（为多孔 性）、使用细孔片或在小室等那样分区而成的空间中装有珠，可以设定这样的多个微细空 间。一个实施方式中，支撑体中沿着与2维垂直的方向设置多个贯通孔，至少使核酸探针固 定在该贯通孔的内壁，核酸探针中的细胞识别用标签序列根据贯通孔的位置不同而不同。 采取这样的构成的原因是：在将细胞配置在支撑体时，其正下方的面积需要为能够用于被 检核酸（例如mRNA)的捕捉的面积，但支撑体表面上的面积对于捕捉全部的被检核酸（例 如mRNA)而言并不充分，必须增大细胞正下方的支撑体的表面积。另一方面，在使用通过设 定多个微细空间而增大了表面积的支撑体来制作cDNA文库的情况下，将通过核酸扩增工 序获得的产物取出到支撑体之外进行序列解析等时，来自支撑体的内部的扩增产物与来自 支撑体表面附近的扩增产物相比，非特异性吸附在支撑体表面的概率低，扩增产物中产生 偏倚。本发明中，为了解决该问题而将上述那样的分子识别用标签序列引入到核酸探针中。 由此，在对扩增产物进行序列解析时，由于已知具有相同分子识别用标签序列的扩增产物 在核酸扩增工序前为相同分子，从而能够抵消扩增工序中的偏倚。这样的支撑体中的微细 空间的间隔为与1个细胞相当的尺寸或比细胞的尺寸小是更为优选的。
[0056] 核酸探针向支撑体的固定可以通过该【技术领域】公知的任意方法来进行。例如，可 以利用共价键、离子键、物理吸附、生物结合（例如，生物素和抗生素蛋白（avidin)或者链 霉亲和素的结合、抗原与抗体的结合等）将核酸探针固定在支撑体的表面、细孔内部、滤膜 的纤维、珠表面等。此外，还能借助间隔序列将核酸探针固定在支撑体上。
[0057] 核酸探针借助共价键向支撑体的固定，例如可以通过在核酸探针中引入官能团且 将具有与该官能团的反应性的官能团引入支撑体表面，并使两者反应而实施。例如，可以 在核酸探针中引入氨基、在支撑体中引入活性酯基、环氧基、醛基、碳二亚胺基、异硫氰酸酯 基或者异氰酸酯基，由此形成共价键。此外，可以在核酸探针中引入巯基、在支撑体中引入 活性酯基、马来酰亚胺基或二硫基。作为将官能团引入支撑体的表面的方法之一，可以列 举通过具有期望官能团的硅烷偶联剂对支撑体进行处理的方法。作为偶联剂的例子，可以 使用y-氨丙基三乙氧基硅烷、N- 0 -(氨乙基）-y-氨丙基三甲氧基硅烷、或N- 0 -(氨乙 基氨丙基甲基二甲氧基硅烷等。作为将作为结合部位的官能团引入支撑体的其它方 法，可以列举等离子体处理。此外，作为通过物理吸附将核酸探针固定在支撑体上的方法， 可以列举利用核酸探针的荷电使其与用聚阳离子（聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺等） 进行表面处理后的支撑体静电结合的方法等。
[0058] 需要说明的是，支撑体优选进行表面涂布，以免其它物质（核酸、蛋白质等）吸附 在其上。
[0059] 本发明的方法中，例如作为靶的被检核酸为构成生物体组织的细胞内的mRNA，使 细胞识别用标签序列包含在比该细胞的尺寸小的每个区域不同的序列，由此能够以保存有 构成生物体组织的细胞在平面内的位置信息的形态制作cDNA文库。由此，可以解析构成生 物体组织的细胞内或细胞间的基因表达的不同。在此，例如生物体组织为组织切片时，将构 成组织切片的细胞内的mRNA转录至固定有包含在每个区域不同的细胞识别用标签序列的 核酸探针的支撑体，由此能够以保存有构成组织切片的细胞在平面内的位置信息的形态制 作cDNA文库。由此，能够对多个细胞间的基因表达的不同进行解析。
[0060] 或者，本发明的方法中，例如作为靶的被检核酸为排列成2维保持的阵列状的多 个细胞内的mRNA，使细胞识别用标签序列包含对每一个细胞不同的序列，由此能够以保存 有该多个细胞的位置信息的形态制作cDNA文库。
[0061] 为了使细胞或组织等样品中的被检核酸与固定在支撑体上的核酸探针杂交，按照 上述方式提取样品中的被检核酸后使其与支撑体接触。此时，例如还可以采用如下方法，即 利用核酸的带负电的性质，对包含被检核酸的样品和支撑体施加电场，通过电泳使被检核 酸向固定在支撑体上的核酸探针的附近移动的方法。
[0062] 杂交反应可以通过对固定有核酸探针的支撑体和被检核酸进行孵育而实施。为 了进行所述杂交而进行的孵育优选在温度70°C、5分钟左右的温和搅拌下进行，然后以 〇. 1°C/秒左右缓慢降温至室温。此外，杂交反应后优选从支撑体清洗?除去试剂、非结合 成分。
[0063] 使被检核酸和核酸探针杂交后，合成与被检核酸或其部分序列互补的DNA链 (cDNA)。该互补链的合成可以通过该【技术领域】公知的方法进行。例如，被检核酸为mRNA等 RNA时，可以通过例如使用逆转录酶的逆转录反应来合成cDNA。此外，在被检核酸为DNA时， 可以通过例如使用聚合酶的复制反应来合成cDNA。合成反应后，使用例如Rnase而将被检 核酸分解除去。结果，在支撑体上制作了由标签序列和与被检核酸对应的cDNA构成的cDNA 文库。制作的cDNA文库中，优选cDNA被保持在支撑体的2维分区而成的多个微细空间中。
[0064] 合成cDNA后，对cDNA文库（支撑体）实施清洗、除去操作，由此可以除去残留试 剂、例如细胞溶解试剂及DNA分解酶，其后的核酸扩增工序可以不被妨碍地进行。
[0065] 如上制作的cDNA文库在各操作后通过进行清洗而可以重复使用，使用相同的 cDNA文库能够进行多次后述的核酸扩增工序、基因表达的检测（例如测序）工序。
[0066] 此外，任选地，通过移动如上制作的cDNA文库中包含的cDNA或生成与cDNA文库 中包含的cDNA对应的核酸片段，从而可以将原cDNA文库中包含的cDNA的信息转移至液 相。
[0067] 然后，对如上制作的cDNA文库的全部或一部分进行核酸扩增。核酸扩增工序中， 首先，使包含作为基因表达解析对象的基因的特异性序列（本说明书中也称为"基因特异 性序列"）的引物，与cDNA文库所保持的cDNA退火，生成包含被检核酸的一部分和上述核 酸探针中包含的各序列的cDNA链。此时，引物中，通过使用与解析对象基因的3'末端相距 特定距离的序列作为基因特异性序列，可以在解析多个基因时，将核酸扩增工序中获得的 扩增产物的尺寸平均化。此外，通过在引物中附加与上述核酸探针中包含的通用引物序列 对应的通用引物序列（例如，与核酸探针中包含的通用正向引物序列对应的通用反向引物 序列），能够使此后的核酸扩增反应简便且高效地实施。
[0068] 作为核酸扩增反应，可以使用该【技术领域】公知的任意方法，例如聚合酶链反 应（PCR)、NucleicAcidSequence-BasedAmplification(NASBA)法、Loop-Mediated IsothermalAmplification(LAMP)法、滚环扩增（RCA)反应。此外，本领域技术人员可以根 据所采用的扩增反应来适当设计使用的核酸探针。
[0069] 或者，在上述核酸探针中包含转录因子的启动子序列时，在核酸扩增工序中，也可 以使用该转录因子进行由cDNA转录为cRNA的转录反应。作为这样的转录因子，可以如上 述那样列举I7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶等。在转录为cRNA后，可以再次进 行cDNA的互补链的合成和核酸扩增反应。
[0070] 核酸扩增工序后，可以利用获得的扩增产物通过该【技术领域】公知的任意方法对基 因的表达进行解析。例如，一个实施方式中，可以对扩增产物进行测序，由此对解析对象的 基因表达的有无、表达的位置或区域（基于细胞识别用标签序列）、表达量（基于分子识别 用标签序列进行校正）等进行解析。在另一个实施方式中，可以利用具有与上述基因特异 性序列互补的序列的标记核酸探针，使构成cDNA文库的CDNA链或获得的扩增产物与该标 记核酸探针杂交，基于标记来检测解析对象的基因表达（例如通过光学方法进行检测）。这 样的检测中使用的核酸探针可以由本领域技术人员适当设计。使用的标记也可以使用该技 术领域公知的任意标记，例如荧光标记（Cy3、异硫氰酸荧光素（FITC)、四甲基异硫氰酸罗 丹明（TRITC)等）、化学发光标记（荧光素等）、酶标记（过氧化物酶、0 -半乳糖苷酶、碱 性磷酸酶等）、放射性标记（氚、碘125等）。在另一个实施方式中，可以利用具有与上述基 因特异性序列互补的序列的核酸探针进行核酸扩增反应，基于化学发光或荧光来检测扩增 的有无，由此对解析对象的基因表达进行解析。
[0071] 本发明中，通过使如上述那样获得的cDNA文库中的基因表达的解析结果和样品 (细胞、组织等）的2维位置信息对应，还能够获得细胞或组织中的特定的位置和基因表达 的相关性数据。这样的样品的2维位置信息为例如细胞样品或组织切片样品的显微镜像、 通过其它标记法获得的荧光像或化学发光像等。
[0072] 在又一方式中，本发明的方法是：代替上述那样的使被检核酸与核酸探针杂交的 方式，使任意的生物体分子与包含用于捕捉该生物体分子的序列（例如，能够与该生物体 分子特异性结合的配体、具体为抗体或适体等）和细胞识别用标签序列的探针分子杂交， 在支撑体上对生物体分子的表达进行解析，获得定量数据，此外还能够在从细胞提取该生 物体分子前通过显微镜观察获得显微镜像，使该显微镜像和生物体分子的定量数据对应。 这样的方法中，作为成为解析对象的生物体分子，可以列举蛋白质、肽核酸、高分子（聚合 物）、低分子等任意分子。为了利用特异性结合而将其捕捉至支撑体，优选存在与其特异性 结合的配体的生物体分子。例如，可以选择蛋白质作为生物体分子、选择抗体或适体作为与 其特异性结合的配体（生物体分子捕捉用序列）。
[0073] 此外，本发明涉及用于实施上述那样的基因表达解析方法的设备及装置。
[0074] 本发明的基因表达解析用设备具有在支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有 核酸探针的支撑体，所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列、具有已知序列且根据在支撑 体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列、和具有已知序列的通用引 物序列。核酸探针还可以包含分子识别用标签序列。核酸探针及支撑体如上所述。
[0075] 此外，本发明的基因表达解析用装置的一个实施方式中，具有：
[0076] 上述基因表达解析用设备；
[0077] 用于将用于合成与作为靶的被检核酸互补的DNA链的试剂引入上述基因表达解 析用设备的单元；
[0078] 将用于进行核酸扩增的试剂引入上述基因表达解析用设备的单元；以及
[0079] 用于控制上述基因表达解析用设备的温度的单元。
[0080] 上述温度控制单元只要是适合于在核酸扩增工序中实施扩增反应的温度控制单 元则没有特别限制。此外，上述基因表达解析用装置还可以具有：显微镜、以及使显微镜像 和使用上述设备获得的上述被检核酸的定量数据对应的单元，所述显微镜像是在从细胞提 取上述作为靶的被检核酸前由上述显微镜观察到的。
[0081] 另一个实施方式中，本发明的生物体分子表达解析用装置具有：
[0082] 在支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有探针分子的支撑体，所述探针分子 包含生物体分子捕捉用序列、和具有已知序列且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不 同而不同的细胞识别用标签序列；
[0083] 显微镜；和
[0084] 使从细胞提取上述生物体分子前由上述显微镜观察到的显微镜像和使用上述支 撑体获得的上述生物体分子的定量数据对应的单元。
[0085] 上述基因表达解析用装置及生物体分子表达解析用装置中，显微镜只要可以观察 细胞（包括排列成阵列状的细胞）或组织等样品即可，没有特别限定，可以使用例如相位差 显微镜、荧光显微镜、拉曼显微镜、微分干涉显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜、非线性拉 曼显微镜（CARS显微镜、SRS显微镜、RIKE显微镜）、IR显微镜等。
[0086] 上述基因表达解析用装置及生物体分子表达解析用装置还可以具有用于在支撑 体上捕获细胞的单元（例如用于使细胞在支撑体上排列成阵列状的单元）。
[0087] 实施例
[0088] 以下参照附图对本发明的实施方式的具体例进行说明。但是，这些实施例不过是 用于实现本发明的一例，对于本发明没有限制。
[0089] [实施例1]
[0090] 本实施例为由片状的细胞群以保存其中包含的mRNA的位置信息的形态将2维cDNA文库片构建在细孔阵列片（基因表达解析用设备的一例）中并使用的例子。以下将 呈2维状地形成有多个细孔的片称为细孔阵列片，将其中形成有cDNA文库者称为cDNA文 库细孔阵列片。该方法的概念图和使用的基因表达解析用设备（细孔阵列片）的构成例及 使用方式示于图1和图2。
[0091] 该方法由如下步骤构成，即，以保存呈片状配置的细胞2的位置信息的状态提取 mRNA和将mRNA4捕捉到固定在细孔阵列片1内部的DNA探针6(图1(a))、在片1内部利用 逆转录（1stcDNA链9的合成）制作cDNA文库（图1 (b))、接下来合成2ndcDNA链21 (图 2(c)、（d))、及PCR扩增（图 2(e))。
[0092] 为了保存细胞的位置信息并制作cDNA文库，需要将mRNA4提取至细胞2的正下 方并在片1内部捕捉mRNA4。为了进行该步骤，需要使细胞的破碎和核酸（mRNA4)的电 泳同时进行。为了将所捕捉的mRNA原来所在的细胞的位置信息转录为序列信息，固定在片 1内部的DNA探针6包含具有因片的位置或区域的不同而不同的序列的细胞识别用标签序 列，用该DNA探针捕捉mRNA。图1(a)中的细孔阵列片1上的不同的图案3表示固定有具有 不同的细胞识别用标签序列的DNA探针6。该mRNA捕捉用DNA探针6从5'末端方向起由 PCR扩增用通用序列（Forward方向）、细胞识别用标签序列、分子识别用标签序列、及寡聚 (dT)序列构成。通过将PCR扩增用通用序列引入DNA探针，在后续的PCR扩增工序中，可以 将该序列用作通用引物。此外，通过将细胞识别用标签序列（例如5碱基）引入DNA探针 中，能够识别45= 1024的位置或区域（例如4 5= 1024个单个细胞）。即，由于可以一次性 地由1024个单个细胞制备cDNA文库，因此具有可以将试剂成本及劳动量减少至1/1024的 效果，且能够识别最终获得的新一代测序仪的序列数据来自哪个细胞或位置或区域。进而， 通过将分子识别用标签序列（例如15碱基）引入DNA探针中，可以识别415= 1. 1X109的 被检分子（在此为mRNA)，因此能够识别新一代测序仪所获得的庞大解读数据是来自哪个 分子。即，扩增工序中会由于DNA的序列和长度、进行扩增反应的容积等产生扩增效率的偏 倚，但通过利用分子识别用标签序列可以修正扩增工序中产生的基因间的扩增偏倚，因此 能够高精度地定量最初存在于试样中的mRNA量。位于最3'侧的寡聚（dT)序列为被检核 酸捕捉用序列，与附加在mRNA的3'侧的聚A尾部杂交，用于捕捉mRNA(图1(a))。在此，作 为DNA探针6，包含30碱基的PCR扩增用通用序列（Forward方向）、5碱基的细胞识别用标 签序列、由15碱基的随机序列构成的分子识别用标签序列、及18碱基的寡聚（dT)序列+2 喊基的VN序列（序列号1)。
[0093] 本实施例中，为了对mRNA进行解析，捕捉用DNA探针的一部分使用了聚T序列，在 进行microRNA、基因组解析时，也可以使用随机序列、与解析对象的序列互补的序列的一部 分代替聚T序列。
[0094] 然后，详细说明cDNA文库片制作方法。作为用于制作cDNA文库的细孔阵列片，可 以使用由多孔质玻璃形成的整体（monolith)片、将毛细管捆扎并切片而成的毛细管板、尼 龙滤膜或凝胶膜等各种片，在此使用将氧化铝阳极氧化而得的细孔阵列片。这样的片也可 以通过阳极氧化从而自行制作，孔径20nm?200nm的片可以以市售品形式获得。在此说明 了使用孔径为200nm、厚度为60ym、直径为25mm的细孔阵列片1的例子，但细孔阵列的片 的形状并非仅限于此。片1中形成的细孔5贯穿了片1的厚度方向，细孔彼此完全独立。表 面为亲水性，表面对蛋白质的吸附极少、酶反应高效率地进行。首先，对细孔阵列片1的表 面进行硅烷偶联等处理，将DNA探针6固定在细孔表面。DNA探针6以平均30?lOOnm2固 定一个的比率固定在表面，因此1个孔中固定有4?10X106个DNA探针。然后，为了防止 表面吸附，用表面包覆剂将表面包覆。该表面包覆也可以与探针固定同时进行。该DNA探 针密度为可以以几乎100%的效率将通过该空间的mRNA捕获至DNA探针的密度。
[0095] 以下记载从细胞群提取mRNA、在细孔阵列片中制作cDNA文库的方法。将包含用于 破坏细胞膜的细胞溶解试剂7 (例如表面活性剂和酶的混合液）的凝胶如图1(a)所示那样 设置在细孔阵列片1的上部。在此，2为样品的细胞群，7为包含细胞溶解试剂的凝胶。然 后，使载置有片状的细胞样品的上部接触包含电解质的溶液。当然可以使细胞直接接触电 解质，但也可以通过凝胶等而接触。另一方面，下部的凝胶8也通过细孔而接触包含电解质 的溶液，从而能够在细胞片1的上下方向施加电场。带负电的mRNA4通过细孔5电泳至下 部，在细孔5中，mRNA4的聚A尾部被DNA探针6的寡聚（dT)序列捕捉。如图1 (a)的右 侧所示，在将mRNA4捕获至细孔5中后，样品及凝胶片7被去除，理想的是使用随着温度而 发生相变的凝胶即低融点琼脂糖凝胶作为凝胶材料。即，由于通过升高温度而变成液状，因 此能够洗掉。
[0096] 然后，以被细孔5中的DNA探针6捕捉的mRNA4为模板合成1stcDNA链9,本工 序中用包含逆转录酶及合成底物的溶液填满细孔部5,缓慢升温至50°C并进行50分钟左右 的互补链合成反应（图1 (b))。反应结束后，通过细孔5而流入Rnase将mRNA4分解除去。 然后通过细孔5流入包含碱变性剂的液体及清洗液，除去残存物及分解物。通过至此为止 的工艺在细孔5内构建反映了组织细胞的位置的如图1(b)所示那样的cDNA文库片。
[0097] 然后，使附加了PCR扩增用通用序列（Reverse)的多个（?100种）靶基因特异 性序列引物20与1stcDNA链9退火（图2(c))、通过互补链延伸反应合成2ndcDNA链 21(图2(d))。即在多重条件下进行2ndcDNA链的合成。由此，对于多个靶基因，合成了两 端具有PCR扩增用通用序列（Forward/Reverse)且其中包含细胞识别用标签序列、分子识 别用标签序列、及基因特异性序列的双链cDNA22。此外，本实施例中，作为一例，对于20种 (ATP5B、GAPDH、⑶SB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、 SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27及0AZ1)靶基因，使用从靶基因的聚A尾部起109 ± 8 碱基的上游部分的20±5碱基作为基因特异性序列（分别为序列号3?22)，这是为了在后 续的PCR扩增工序中将PCR产物的尺寸统一为约200碱基。通过统一PCR产物的尺寸，可 以避免繁杂的粒级精制的工序（电泳一凝胶的切出一PCR产物的提取?精制），具有可以直 接用于由1分子起的并列扩增（乳液PCR(emUlsi〇nPCR)等）的效果。然后，利用PCR扩增 用通用序列（Forward/Reverse)进行PCR扩增，制备来自多种基因的PCR产物（图2(e))。 该工序中，即使在基因间或分子间产生了扩增偏倚，也可以在获得新一代测序仪数据后利 用分子识别用标签序列进行扩增偏倚的校正，因此可以获得高精度的定量数据。
[0098] 需要说明的是，每个细胞的mRNA数约为106个，将细胞的尺寸示意性地设为直径 为10ym的圆形时，每个细胞所用的细孔数为约2500个。即1个细胞中表达的mRNA数为 1000拷贝以下时，1个细孔内平均可以形成1拷贝的cDNA。多于该数量时，同一mRNA种 类会在1个细孔内生成多个拷贝的cDNA。当减小细孔的尺寸时，还可以使每个细孔中的各 种mRNA为1拷贝以下（此外，在逐个处理细胞、使每个细胞的cDNA文库制作区域扩大时， 也可以使每个细胞为1拷贝以下）。各细孔中平均生成400个各种cDNA。由其中生成的 cDNA(1stcDNA链），使用附加有PCR扩增用的通用序列的数十种基因特异性序列引物合成 2ndcDNA链，此处公开了PCR扩增的例子。当然也可以使用滚环扩增（RCA)、NASBA、LAMP 法等其它扩增法。
[0099] 然后，详细说明向cDNA文库片的细孔内部固定DNA探针的方法。片内部的细孔 的表面需要为如下表面，即，高密度地固定DNA探针且不吸附mRNA和PCR扩增用引物等核 酸、以及逆转录酶和聚合酶等蛋白质。本实施例中，通过以适当比率将用于固定DNA探针的 硅烷偶联剂和防止吸附的硅烷化MPC聚合物同时与细孔表面共价结合而固定，从而实现了 DNA的高密度固定和稳定地抑制核酸、蛋白质的吸附。实际上，首先将氧化铝制的细孔片1 在乙醇溶液中浸渍3分钟后，进行5分钟UV03处理，用超纯水清洗3次。然后，在包含平均 分子量为9700(聚合度为40)的硅烷化MPC聚合物即MPQ^-MPTMSia.jMPCj-Methacrylo yloxyethylphosphorylcholine/MPTMSi:3-Methacryloxypropyltrimethoxysilane)(例 如，Biomaterials2009,30:4930-4938、及LabChip2007,7:199-206)3mg/ml、0.3mg/ml的 娃烧偶联剂GTMSi(GTMSi:3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane，信越化学）、及作为酸催 化剂的0. 02%醋酸的80%乙醇溶液中浸渍2小时。用乙醇清洗后，在氮气氛围中干燥，在 烘箱中于120°C加热处理30分钟。然后，为了固定DNA，对于包含lyM5'氨基修饰的DNA探针（序列号1)、7. 5%甘油和0. 15MNaCl的0. 05M硼酸缓冲液（pH8. 5)，通过与喷墨打印 相同的技术在每个25ymX25ym的区域喷出各100pL的包含不同的细胞识别用标签序列 (1024种）的DNA探针。然后，在加湿室内于25°C反应2小时。最后将未反应缩水甘油基 封闭，为了除去过量的DNA探针，用包含足量的10mMLys和0. 01%SDS和0. 15MNaCl的硼 酸缓冲液（PH8. 5)清洗5分钟，除去该清洗液后，用包含0. 01 %SDS和0. 3MNaCl的30mM 柠檬酸钠缓冲液（2xSSC，pH7. 0)在60°C清洗，除去过量DNA。由此完成了DNA探针的固定 和表面处理。
[0100] 以下对此前言及的、用来由细胞阵列制作CDNA文库片并通过新一代（大规模）测 序仪获得基因表达谱的装置系统进行说明。虽然是以细胞阵列为例来说明，但使用组织切 片时也是同样的。小心翼翼地将1000个左右以下的细胞用500yL的1XPBS清洗后，尽量 不残留PBS地除去溶液，加入冷却至4°C的1XPBS50yL。将该样品在片1上排列成阵列 状。具体而言，在具有0. 1ym细孔的厚度为60ym的片上，通过表面处理以25微米的间隔 设置带正电的直径为20ym的区域。细胞的表面带负电，因此当细胞流经该表面时以25ym 的间隔被捕获在表面上。即，在捕捉1个细胞的区域固定有4种细胞识别用标签序列。实 际上，使细胞流过而捕获时，在20%左右的位置上能够各捕获一个细胞。
[0101] 图3为用于捕获细胞（即制作细胞阵列）的反应室的一例。通过使用反应室，可 以在直径为25mm的片1之上一个一个地固定细胞2并用溶液填满细孔的内部。按照片的 周围填满溶液的方式在片1的周边部分设置聚丙烯制的保护环300,片1的上下的内侧被由 透明（IT0)电极溅射而成的上盖301及下盖302夹持，形成用于用反应溶液填满的上部反 应区域303及下部反应区域304。将电极设为透明的理由在于为了能够用光学显微镜观察 细胞，此次使用的IT0透明电极在400?900nm的波长范围具有40%以上的透过特性。从 入口 305注入缓冲液，从上部出口 306及下部出口 307排出缓冲液，将内部用溶液填满。然 后，边振荡反应室边使细胞群从细胞流路（入口 308)流入反应室内。细胞被带正电的部分 捕获，当然也可以用能够进入1个细胞的容器或分区来捕获细胞。然后使用在随着温度而 在凝胶状态和液体状态间发生相变的低融点琼脂糖凝胶（SeaPrepAgarose;2%时，凝胶化 温度为19°C、融点为45°C)中混合有细胞溶解试剂的溶液，在片上的细胞位置固定的状态 下破坏细胞膜及细胞组织，提取mRNA。
[0102] 将 4%SeaPrepAgarose(CambrexBioScienceRockland,Inc.)溶液 250yL和 LysisSolution495yL(TaqManMicroRNACell-t〇-CTKit；AppliedBiosystemsInc.) 和DNaseI5yL在40°C充分混合。然后，将片1的温度设定在4°C，除去反应区域303及 304的溶液后，由入口 305注入上述细胞溶解试剂溶液。确认片上的溶液发生了凝胶化后 将片温度升至20°C，反应8分钟后，在凝胶上添加StoppingSolution(使DNase失活的溶 液）50yL，反应5分钟，冷却至4°C。然后，加入包含分子量60万的0. 03%PE0 (聚环氧乙 烷）和分子量100万的0. 03%PVP(聚乙烯基吡咯烷酮）、及0. 1%Tween20的10mMTris Buffer(pH8.0)0. 5mL。此时上部电极301和下部电极302间的距离为2mm，片上部及下部 的空隙（反应区域303及304)被前述Trisbuffer完全填满。在使片及溶液温度维持为 4°C的状态下，以上部电极301为阴极（GND)、以下部电极302为阳极，用电源311施加+5V 电压2分钟，使带负电的mRNA由细胞内部向304的方向电泳。（关于电泳条件，还可以使用 on level 10V、off level 0V、频率100kHz、占空比50%的脉冲电泳代替施加DC电压）。
[0103] 通过该过程，mRNA基本被固定在片中的细孔中的DNA探针的寡聚（dT)部分捕获 (图1 (a))。但是，一部分mRNA由于2级结构而未被捕获，移动到片下部的缓冲液中（304)。 为了使mRNA完全被DNA探针捕获，将片1及溶液的温度升至70 °C并保持5分钟后，一边每分 钟使施加于下部电极302的电压的极性反转一边以-0. 1°C/sec冷却至4°C(最初施加-5V 1分钟，然后每分钟+5V- -5V地重复施加10次）。然后，从入口 305导入上述trisbuffer， 从出口 306排出，由此边更换片1上部的区域303中的溶液边将溶液及片1的温度升至35°C 使琼脂糖凝胶熔解，清洗、去除不要的细胞组织和琼脂糖。进而，将包含〇. 1%TWeen20的 10mMTrisBuffer(pH= 8. 0)585yL和 10mMdNTP40yL和 5xRTBuffer(Superscript III，Invitrogen公司）225yL和 0? 1MDIT40yL和RNaseOUT(Invitrogen公司）40yL 和SuperscriptIII(逆转录酶，Invitrogen公司）40yL混和，将填满片1的溶液从出口 306及307排出，立即从入口 305注入包含逆转录酶的上述溶液。然后，将溶液和片1升至 50°C并保持50分钟，从而完成逆转录反应，合成含有与mRNA互补的序列的1stcDNA链（图 1(b))。
[0104] 在此，每个细胞使用约1万个细孔来制作cDNA。细孔的每个细胞的总表面积为约 0. 7mm2。每lOOnm2固定有1个以上DNA探针，因此探针总数为约7x10 9个，对于1个细胞中 的mRNA(总数106左右）的捕获而言，量是充分的。核酸容易在细孔内吸附于细孔表面，因 此如上所述地使用MPC聚合物作为表面包覆剂覆盖细孔表面，防止吸附。
[0105] 通过以上的操作，对于每个细胞以文库形式获得了固定在多个细孔表面的cDNA。 这应该称之为1个细胞cDNA文库片，与迄今为止的由多个细胞获得的平均化的cDNA文库 是完全不同的。
[0106] 从由此获得的cDNA文库片，对于各种基因定量地测定每个基因的表达量。每个细 胞存在1万个细孔，因此每个细孔的cDNA的个数平均为100个。当1种cDNA在每个细胞 的cDNA拷贝数为1万个以下时，每个细孔平均的cDNA为1个以下。
[0107] 合成1stcDNA链后，在85°C保持1. 5分钟使逆转录酶失活，冷却至4°C后，将包含 RNase及 0? 1%Tween20 的 10mMTrisBuffer(pH= 8. 0) 10mL从入口 305 注入，从出口 306 及307排出，由此分解了RNA，同样地流入等量的碱变性剂，除去、清洗细孔内的残存物及 分解物。然后，将灭菌水 690yL和 10xExTaqBuffer(TaKaRaBio公司）100yL和 2. 5mM dNTPMix100yL和各10yM的附加了PCR扩增用通用序列（Reverse、序列号2)的20种基 因特异性序列引物組1(序列号3?22) 100 ^11^和￡11&9 11(^8七31'1：￥6^；[011(131(31^13；[0 公司）10yL混和，将填满片的溶液从出口 306及307排出，立即从入口 305注入包含逆转 录酶的上述溶液。然后，对溶液和片进行95°C3分钟一44°C2分钟一72°C6分钟的反应， 以1stcDNA链9为模板、与引物20的基因特异性序列退火后（图2(c))进行互补链延伸 反应，合成2ndcDNA链21 (图2 (d))。
[0108]然后，将灭菌水495yL和 10xHighFidelityPCRBuffer(Invitrogen) 100yL和 2.5mMdNTPmixlOOyL和 50mMMgS0440yL和 10yMPCR扩增用通用序列引物（Forward、 序列号23) 100yL和10yMPCR扩增用通用序列引物（Reverse、序列号2)100yL和 PlatinumTaqPolymeraseHighFidelity(Invitrogen公司）15yL混和，将填满片的溶液 从出口 306及307排出，立即从入口 305注入上述溶液。然后，将溶液和片在94°C保持30秒 钟，将94°C30秒钟一55°C30秒钟一68°C30秒钟的3阶段工序重复进行40个循环，最后 在68°C保持3分钟，然后冷却至4°C，由此进行PCR扩增工序（图2 (e))。为了实现这样的温 度循环，而设为具有带加热器的加热块309 (铝合金或铜合金）和温度控制器310的构成。 由此对20种靶基因的目的部分进行了扩增，PCR产物尺寸均为200±8碱基，基本均一。回 收蓄积在片的细孔内部及外部的溶液中的PCR扩增产物溶液。为了除去该溶液中包含的游 离的PCR扩增用通用序列引物（Forward/Reverse)、酶等残留试剂，使用PCRPurification Kit(QIAGEN公司）进行精制。将该溶液用于emPCR扩增或桥式扩增后，使用各公司（例如 LifeTechnologies(Solid/IonTorrent)、Illumina(HighSeq)、Roche454)的新一代测 序仪对序列进行解析。
[0109] 然后，对使用分子识别用标签序列降低扩增偏倚的方法进行说明。图4中示意性 地示出除了分子识别用标签序列以外均相同的序列的获得的测序数据的状态（图中示意 性示出获得的测序数据的相关部分）。图4中，401、402、403、404及405为包含作为随机序 列的分子识别用标签序列的相同序列，表示分别获得1、7、4、2、2的读数（read)(表观上的 分子数计数）的情况。这些序列在图2(d)、即合成2ndcDNA链的时点均为1分子，在其后 的PCR扩增中分子数增多且分子个数变得不同。因此，分子识别用标签序列的相同读数视 为相同分子即可，即全部视为1分子。其结果，可以通过分子识别用标签序列的使用来克服 合成2ndcDNA链后的工序的PCR扩增、将溶液取至外部时吸附至细孔阵列片内部所致的各 序列的分子数的偏差。
[0110] 这里制作的片能够重复利用，对于需要了解表达量的基因群，制作附加有PCR扩 增用通用序列引物（Reverse、序列号2)的基因特异性序列引物Mix溶液，与上述同样地实 施2ndcDNA链的合成、PCR扩增、及emPCR，用新一代测序仪进行解析即可。即，通过对cDNA 文库进行重复利用，能够对必要的基因种类进行高精度的表达分布测定。
[0111] 或者，也可以由cDNA文库细孔阵列片回收cDNA文库（cDNA链）并在液相中进行 扩增工序。
[0112] [实施例2]
[0113] 本实施例为在从片状的细胞群以保存其中包含的mRNA的位置信息的形态将2维 cDNA文库片构建在细孔阵列片中并使用的例子中、使用转录因子17的启动子代替PCR扩增 的例子。
[0114] 本实施例的方法的对实施例1的变更点示于图5、6及7。固定在片内部的DNA探 针50 (序列号24)从5'末端方向起由下述序列构成，S卩，17启动子序列（碱基第1?42 号）、扩增用通用序列（Forward方向）（碱基第43?72号）、细胞识别用标签序列（碱基 第73?77号）、分子识别用标签序列（碱基第78?92号）、及寡聚（dT)序列（附加了VN 序列）（碱基第93?102号）。通过将17启动子序列引入DNA探针，能够利用基于后续的 IVT(InVitroTranscription)的cRNA63的扩增工序（图6(e))进行革巴序列的扩增。艮口， 17启动子序列被I7RNA聚合酶识别，从其下游序列开始转录（cRNA63扩增）反应。同样 地，通过引入扩增用通用序列，在后续的emPCR扩增工序中可以将其用作通用引物。此外， 通过将细胞识别用标签序列（例如5碱基）引入DNA探针，能够识别45= 1024的区域或 位置（即45= 1024个单个细胞），这与实施例1同样。进而，将分子识别用标签序列（例 如15碱基）引入DNA探针中，可以识别415= 1. 1X10 9分子，因此能够识别新一代测序仪 所获得的庞大的解读数据来自于哪个分子，这也与实施例1同样。即，由于能够修正在IVT/emPCR等扩增工序中产生的基因间的扩增偏倚，因此能够高精度地定量最初存在于试样中 的mRNA量。位于最3'侧的寡聚（dT)序列与附加在mRNA的3'侧的聚A尾部杂交，用于捕 捉mRNA(图 5(a))。
[0115] 然后依次说明反应的各步骤。如图5(a)所示，mRNA4与实施例1同样被与mRNA 4的3'末端的polyA序列互补的序列、即18碱基的polyT序列捕捉。然后，合成1stcDNA 链9、构建cDNA文库（图5(b))。然后，使与欲定量的基因对应的多个（?100种）靶基因 特异性序列引物60与1stcDNA链9退火（图6(c))，通过互补链延伸反应合成2ndcDNA链 61(图6(d))。即在多重条件下进行2ndcDNA链的合成。由此，对于多个靶基因，合成了两 端具有扩增用通用序列（Forward/Reverse)且其中包含细胞识别用标签序列、分子识别用 标签序列、及基因特异性序列的双链cDNA。此外，本实施例中，作为一例，对于20种（ATP5B、 GAPDH、⑶SB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、 丁8卩、￥頂、1^1^0、1^1^2、1^1^27、及(^21)基因，使用从靶基因的聚4尾部起109±8碱基的 上游部分的20±5碱基作为基因特异性序列（分别为序列号3?22)，这是为了在后续的利 用IVT的扩增工序中将扩增产物的尺寸统一为约200碱基。通过统一扩增产物的尺寸，可 以避免繁杂的粒级精制的工序（电泳一凝胶的切出一扩增产物的提取?精制），可以直接 用于由1分子起的并列扩增（乳液PCR等）。然后，将I7RNA聚合酶引入细孔中，合成cRNA 63(图6(e))。通过该过程合成了约1000拷贝左右的cRNA63。进而，为了合成用于emPCR 的双链DNA，以扩增出的cRNA63为模板，使其与附加了PCR扩增用通用序列（Reverse)的 多个（?100种）靶基因特异性序列引物71杂交（图7(f))，合成cDNA72(图7(g))。进 而，与实施例1同样地使用酶分解cRNA后，使用PCR扩增用通用引物（Forward)合成2nd cDNA链，由此合成emPCR用双链DNA73 (图7 (h))。该扩增产物的长度较一致，可以直接上 样至emPCR、新一代测序仪。该工序中，即使在基因间或分子间产生了扩增偏倚，也可以在获 得新一代测序仪数据后利用分子识别用标签序列进行扩增偏倚的校正，因此可以获得高精 度的定量数据，这与实施例1同样（图4)。
[0116] 然后，记载一系列工序的具体内容。合成1stcDNA链后，在85°C保持1.5分钟 使逆转录酶失活，冷却至4°C后，将包含RNase及0? 1%Tween20的lOmMTrisBuffer(pH =8. 0) 10mL从入口 305注入，从出口 306及307排出，由此分解了RNA，同样地流入等量 的碱变性剂，除去、清洗细孔内的残存物及分解物。然后，将灭菌水690yL和10xExTaq Buffer(TaKaRaBio公司）100yL和 2.5mMdNTPMixlOOyL和各 10yM的附加了PCR扩增 用通用序列（Reverse、序列号2)的20种基因特异性序列引物Mix(序列号3?22) 100yL 和ExTaqHotstartversion(TaKaRaBio公司）10yL混和，将充满片的溶液从出口 306 及307排出，立即从入口 305注入包含逆转录酶的上述溶液。然后，对溶液和片进行95°C3 分钟一44°C2分钟一72°C6分钟的反应，以1stcDNA链为模板、与引物的基因特异性序列 退火后（图6 (c))进行互补链延伸反应，合成2ndcDNA链（图6⑷）。
[0117] 然后，将包含 0? 1 %Tween20 的 10mMTrisBuffer(pH= 8. 0) 10mL从入口 305 注入、从出口 306及307排出，由此除去、清洗细孔内的残存物及分解物。进而，将灭菌水 340yL和AmpliScribe10XReactionBuffer(EPICENTRE公司）100yL和 100mMdATP 90yL和lOOmMdCTP90yL和lOOmMdGTP90yL和lOOmMdUTP90yL和lOOmMDTT、 及AmpliScribeT7EnzymeSolution(EPICENTRE公司）100yL混和，将填满片的溶液从 出口 306及307排出，立即从入口 305注入包含逆转录酶的上述溶液。然后，将溶液和片 升至37°C并保持180分钟，由此完成逆转录反应，进行了cRNA扩增（图6(c))。由此，对 20种靶基因的目的部分进行了扩增，cRNA扩增产物尺寸均为200±8碱基，基本均一。回 收蓄积在片的细孔内部及外部的溶液中的cRNA扩增产物溶液。为了除去该溶液中包含的 酶等残留试剂，使用PCRPurificationKit(QIAGEN公司）进行精制，并悬浮在50yL的 灭菌水中。在该溶液中混合10mMdNTPmixlOyL和50ng/yL的随机引物30yL，94°C加 热10秒后以0. 2°C/秒将温度降至30°C，在30°C加热5分钟，再降至4°C。然后，将5xRT Buffer(Invitrogen公司）20yL、0.1MDTT5yL、RNaseOUT5yL和SuperscriptIII 5yL混和，30°C加热5分钟，以0. 2°C/秒将温度升至40°C。为了除去该溶液中包含的酶等 残留试剂，使用PCRPurificationKit(QIAGEN公司）进行精制，用于emPCR扩增后，使用 各公司（例如LifeTechnologies、Illumina,Roche)的新一代测序仪进行序列解析。
[0118][实施例3]
[0119] 本实施例为制作粘附性弱的血球细胞的细胞阵列、使用细孔阵列片构建cDNA文 库片并进行基因表达解析的例子。实施例1中，为了制作细胞阵列使用了细孔阵列片的表 面处理。因此，需要细胞的粘附性达到某种程度。本实施例中，以具有下述设备结构的装置 为例进行说明，所述设备结构具有不依赖于细胞的粘附性、而是通过溶液的流动使细胞排 列成阵列状的构成。
[0120] 图8(a)示出细胞阵列设备的剖面图。本实施例中，测定对象为白血球800,非测定 对象的红血球已经事先用红血球细胞Lysis缓冲液溶解、除去。细胞的入口 308和试剂的 入口 305及上部出口 306及下部出口 307与实施例1(图3)同样。本实施例中，细孔阵列 片使用了使用半导体工艺制作的片，使用从细胞入口 308向着下部出口 307的溶液流，为了 使白血球排列成正方格子状，按照仅在1条边为15ym的正方形区域吸引细胞的方式形成 有细孔阵列，其以外的部分并无细孔，片的厚度也较厚，从而能够保持设备的机械强度。
[0121] 这里使用的细孔阵列片如下形成，即在硅基板802上形成厚度为10ym的SiOjl， 使用干式蚀刻形成直径为〇. 3ym的通孔后，将硅基板薄层化后通过光刻形成50ym周期的 格子803,通过湿式蚀刻使格子以外的区域贯通。这样获得的细孔内壁能够通过与实施例1 同样硅烷偶联处理进行DNA探针的固定。图8(c)中示出B-B'处的横剖面图，不同的阴影 表示固定有不同的细胞识别用标签序列。此外，图8(b)中示出A-A'处的横剖面图。露 出了贯通的细孔的部分805进行了图案化而成为能够收纳一个细胞大小。
[0122] 图9中示出了在设备中进行红血球的分离的情况。细孔阵列片与图8相同（C一 C'处的横剖面图示于图9(c))，但其上部设有细胞过滤器900。细胞过滤器900上的横剖 面图如图9 (b)所示。为了使红血球由于其尺寸小而直接通过、白血球、CTC(Circulating TumorCell)由于尺寸大从而被捕获至过滤器900上部，作为贯通孔的尺寸选择了 6ym。
[0123][实施例4]
[0124] 作为构建cDNA文库的设备，除了细孔阵列片以外还可以是使用珠的设备。此时 DNA探针的固定并非必须在设备上进行，有DNA固定密度高的优点。图10(a)中示出仅构建 cDNA文库阵列片的设备部分的剖面俯瞰图。
[0125] 设备上设有一条边为10ym的反应槽1000,其中装有直径为1ym的磁性珠 1001 (此处使用表面预先固定有链霉亲和素的珠）。该磁性珠上固定有mRNA捕捉用DNA探 针6,其从5'末端方向起由PCR扩增用通用序列（Forward方向）、细胞识别用标签序列、分 子识别用标签序列、及寡聚（dT)序列构成。珠表面的放大图示于图10的（b)。固定在珠上 的mRNA捕捉用DNA探针6的细胞识别用标签序列按照在设备上的反应槽的位置不同则序 列不同的方式而构成。具体而g，将具有不同的细胞识别用标签序列的mRNA捕捉用DNA探 针6在各反应管中与珠1001混和，边旋转边进行结合反应（10分钟）。然后，分别填充在喷 墨打印机打印头中，将固定有不同的序列的珠1001逐个填充到反应槽1000中。
[0126] 上述反应槽1000是树脂制的网1002和实施例1中也曾使用的氧化铝制的细孔阵 列片1003通过热熔接而粘附形成的。在此，使用细孔的直径为100nm的网。
[0127] 树脂制网通过纳米印迹技术而制作，也可以使用市售的尼龙网、径迹蚀刻滤膜。反 应槽的底面设为网是为了能够使溶液通过，氧化铝制的细孔阵列的亲水性高，溶液能够快 速浸渗。
[0128] 此外，该反应槽1000还可以使用半导体工艺进行一体加工。
[0129] 1个反应槽1000中的珠1001的数设为1000个。
[0130] 将这样的设备设置在如图8(a)那样的设有入口和出口的流路系统中，引入细胞。 溶液贯通珠及细孔阵列并流动，细胞被捕获到珠上部，与实施例1同样地同时进行利用细 胞溶解试剂进行的细胞破碎和利用电泳提取mRNA，将mRNA4捕捉至磁珠1001上。
[0131][实施例5]
[0132] 本实施例为由组织切片1101将2维cDNA文库片构建在细孔阵列片1中并使用的 例子。
[0133] 将冻结组织样品用切片机制成厚度为5?20ym左右的膜状样品，如图11所示地 将组织切片1101载置于氧化铝制的细孔阵列片1，立即用包含细胞溶解试剂的低融点琼脂 糖覆盖组织切片。琼脂糖溶液在35°C保持溶液状态，在将片1冷却为4°C后立即凝胶化，然 后，设置于图3所示的反应室，与实施例1同样提取mRNA。
[0134] 此时，为了在组织切片中即使存在多达100万个左右的细胞时也能够识别它们， mRNA捕捉用的DNA探针的细胞识别用标签序列变更为10碱基的长度，以10ym的间隔通过 喷墨打印各喷出10PL。
[0135][实施例6]
[0136] 在使用2维cDNA文库的基因表达解析中，可以使细孔阵列片等平面设备上的细胞 位置和基因表达解析结果相对应。此时，在为了进行基因表达解析而将细胞破碎、进行详细 的基因表达解析前，预先进行细胞存活状态下的形状观察、利用荧光染色的基因/蛋白质 的定量或拉曼成像，使这些成像数据和基因表达解析数据能够对应。以下说明用于实现上 述对应的系统构成。
[0137] 首先，图12中，对于为了构建2维cDNA文库而配置在平面状的设备（细孔阵列片 等）之上的细胞样品，示出用于通过使光学显微镜测定和使用上述设备的基因表达解析结 果与各个细胞的数据对应、从而详细测定细胞的动态的系统构成。
[0138] 1200表示以细孔阵列片为代表的平面设备及细胞破碎前配置在设备上的细胞样 品。1201为用于以图3为代表的从细胞提取mRNA和进行核酸扩增的流路系统（反应室或 设备）。箭头1208表示核酸提取过程（用粗箭头表示物质的移动）。箭头1209表示对细胞 添加细胞溶解试剂和用于其后的核酸反应的试剂。通过对这些进行控制，可以获得用新一 代（大规模）DNA测序仪1205测序所需的量的、具有一定长度且末端包含记载有核酸处理 前的信息的标签序列的扩增产物。在此，箭头1211表示扩增产物的移动。另一方面，设备 上的细胞在事前规定了细胞在设备上的位置的形态下用显微镜1203进行观察（1210)。其 中，细箭头表示信息的移动。作为显微镜1203,可以列举相位差显微镜、微分干涉显微镜、荧 光显微镜、激光扫描共聚焦焚光显微镜、拉曼显微镜、非线性拉曼显微镜（CARS显微镜、SRS 显微镜、RIKE显微镜）、IR显微镜等。用这些显微镜获得的信息中，关于基因信息，获得的 信息少。但是，基本上能够在细胞存活的状态下进行测定，能够测定细胞的经时变化，能够 实时测定细胞对刺激的应答。通过利用保存有在设备上的位置信息的设备，可以使基因表 达相关详细信息和利用显微镜获得的包含时间变化的信息对应。为了实现该对应，需要在 系统内设置信息系统1206,所述信息系统1206对来自新一代（大规模）DNA测序仪的序列 信息1212、显微镜像的信息1213和与标签序列对应的位置信息1214进行综合。本发明中， 上述说明的对细胞的测定信息进行综合的系统的最小构成是除了新一代（大规模）DNA测 序仪1205以外的部分即系统1207,是具有输入来自DNA测序仪的信息功能和输出样品（核 酸扩增产物）功能的系统。
[0139] 图13示出组合荧光显微镜来作为显微镜时的系统构成例子。该例中1201为流路 系统，1203为荧光显微镜。示出细孔阵列片1上配置有细胞2的状态。细胞2中，使欲测定 的蛋白质（例如P53)表达GFP或者利用免疫染色在特定蛋白质中引入荧光体。关于这样获 得的各个细胞中的表达蛋白质量的数据，可以在细胞破碎后在细孔阵列片1上进行样品处 理，通过DNA测序进行定量而获得基因表达数据，获取基因表达数据和每个细胞的相关性。 此时，为了识别细胞而利用DAPI将核酸染色从而识别细胞核，由此通过荧光显微镜识别细 胞位置。蛋白质量通过GFP的表达而测定，因此可以追踪经时变化，但能同时测定的蛋白质 种类为几种的程度。另一方面，通过测序进行的基因表达解析一次则能够测定100种左右， 若准备必要数量的探针则甚至能够解析1000种。因此，能够对各细胞获得细胞内的详细的 基因表达控制的相关信息。但是，关于该信息，不能获得经时变化。若事前通过将两者组合 而获得在何种蛋白质表达时为何种基因在表达的数据，则仅由蛋白质表达数据即能够推定 基因控制的相关信息。由信息系统1206来进行这样的、使荧光显微镜数据和基因表达数据 的对应以及基因控制相关信息的推定。
[0140]然后，显示荧光显微镜1203的构成细节。1300为光源，在此为汞灯。1301为确定 激发波长的激发滤色镜、1302为分色镜、1303为选择受光波长的发射滤色镜。当在细胞中 引入多种荧光体同时测定时，通过控制1304选择1301U302及1303,从而仅检测来自特定 荧光体的光。细胞的荧光成像通过物镜1305、成像镜1306、C⑶相机1307进行。对这些进 行控制、获取图像数据的控制电脑为1308。
[0141] 然后，说明流路系统1201的控制系统。流路系统的控制电脑为1309,其控制XY载 物台1310从而使显微镜像移动。此时，利用控制电脑1309,能够使细孔阵列片1上的位置 坐标与用细胞识别用标签序列的序列数据、及XY载物台位置坐标计算出的、显微镜像上的 位置坐标对应。该控制电脑1309适当地对下述进行控制，S卩：控制将细胞引入细胞的流动 池系统的细胞引入控制装置1311，控制改变细胞状态的分化诱导剂/欲调整细胞的应答的 药剂、用于破碎细胞的细胞溶解试剂、用于样品处理的试剂的引入的试剂控制装置1312,控 制细胞培养条件、PCR时的温度循环的温度及C02浓度控制装置1313,用于排出不要的试剂 以及用于细胞、培养基交换等的上部试剂排出装置1314,用于排出所制备的核酸扩增产物 的下部试剂排出装置1315。最终获得的核酸扩增产物转移至新一代（大规模）DNA测序系 统1205并进行序列解析。此时，用于测序的emPCR、桥式放大（bridgeamp)在该系统中实 行。在控制电脑上对比后的图像位置信息和细胞识别用标签序列的序列信息被传送至综合 信息系统1206,进行由荧光像获得的蛋白质量和基因表达量的对应。进而在相同系统中进 行基因表达解析数据的经时变化的推定。由此，能够测定基因表达网络的动力学。
[0142] 此外，该荧光显微镜不仅用于细胞内测定，还可以导入细孔阵列片中、用抗体对捕 捉细胞因子等由细胞分泌的物质进行免疫荧光染色从而测定其量。当然，也可以同样地用 于破碎后的基因表达量的解析。
[0143] 图14不出组合微分干涉显微镜1203作为显微镜的例子。微分干涉显微镜像不使 用荧光试剂，仅仅测定形状，但在再生医疗等需要将细胞返送回体内的情况下却是对细胞 的影响度最小的测定方法之一。在能够使由该图像获得的细胞形状的变化和基因表达的变 化之间对应的情况下，成为对细胞的损伤最少、能够进行详细的细胞分类的测定系统。
[0144] 1401为光源，在此为卤素灯。1402为偏光子，1403及1404分别为Wollaston过滤 器及Wollaston棱镜。1405为聚光镜，1406为物镜。
[0145] 图15示出使用CARS显微镜1203作为显微镜的例子。与拉曼显微镜、IR显微镜 同样地，CARS显微镜能够为了获得与激光激发部分的化学种对应的谱图而比微分干涉显微 镜更大地放大细胞状态的信息量。但是，CARS为非线性过程，与拉曼信号相比信号强度强， 在较弱的激光激发强度下也能够获得充分的信号，因此具有对细胞的损伤小的优点。通过 使这样的CARS像和基因表达解析数据对应，由此能够判定出更详细的细胞状态。
[0146] 1501为光源，在此为脉冲激光（微芯片激光）。将其用激光分束器1502分成两部 分，一部分引至非线性光纤（光子晶体光纤）1503,生成斯托克斯光。另一部分光直接用作 泵浦光及探针光，在样品（细胞中）通过水浸物镜1504聚光而生成反斯托克斯光。利用高 通过滤器1505使仅反斯托克斯光透过，通过分光器1506,利用分光器用C⑶相机1507获得 相干反斯托克斯拉曼谱图。用相机1507测定的位置，通过可动式xyz载物台1508扫描而 构建xyz像。
[0147] 需要说明的是，本发明不受上述实施例限定，而是包含了各种变形例。例如，上述 实施例是为了容易理解本发明而详细说明的，并非限定为具有所说明的全部构成的方案。 此外，某些实施例的部分构成可以变更为其它实施例的构成，此外，某些实施例的构成中可 以加入其它实施例的构成。此外，可以对各实施例的部分构成进行其它构成的追加、削除或 置换。
[0148] 本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请的全文均作为参考引入本说明书 中中。
[0149]【符号的说明】1细孔阵列片
[0150] 2细胞
[0151] 300保护环
[0152] 301上盖、上部电极
[0153] 302下盖、下部电极
[0154] 303上部反应区域
[0155] 304下部反应区域
[0156] 305 入口
[0157] 306 上部出口
[0158] 307 下部出口
[0159] 308 入口
[0160] 309加热块
[0161] 310温度控制器
[0162] 311 电源
[0163]800 白血球
[0164] 802娃基板
[0165] 803 格子
[0166] 805露出了贯通的细孔的部分
[0167] 900细胞过滤器
[0168] 1000 反应槽
[0169] 1001 磁性珠
[0170] 1002 网
[0171] 1003细孔阵列片
[0172] 1200平面设备及配置在该设备上的细胞样品
[0173] 1201流路系统
[0174] 1203 显微镜
[0175] 1205DNA测序仪（DNA测序系统）
[0176] 1206信息系统
[0177] 1207系统的最小构成
[0178] 1300 光源
[0179] 1301激发滤色镜
[0180] 1302 分色镜
[0181] 1303发射滤色镜
[0182] 1305 物镜
[0183] 1306 成像镜
[0184] 1：3〇7CCD相机
[0185] 1308控制电脑
[0186] 1309控制电脑
[0187] 1310 XY载物台
[0188] 1311细胞引入控制装置
[0189] 1312试剂控制装置
[0190] 1313温度及C02浓度控制装置
[0191] 1314上部试剂排出装置
[0192] 1315下部试剂排出装置
[0193] 1401 光源
[0194] 1402 偏光子
[0195] 1403Wollaston过滤器
[0196] 1404 Wollaston棱镜
[0197] 1405 聚光镜
[0198] 1406 物镜
[0199] 1501 光源
[0200] 1502激光分束器
[0201] 1503非线性光纤（光子晶体光纤）
[0202] 1504水浸物镜
[0203] 1505高通过滤器
[0204] 1506 分光器
[0205] 1507分光器用C⑶相机
[0206] 1508可动式xyz载物台
[0207] 序列表自由文本
[0208] 序列号1?29:人工序列（DNA探针、引物和随机序列）
【权利要求】
1. 一种基因表达解析方法，其包括： 于在支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有核酸探针的支撑体中，使作为靶的被 检核酸与该核酸探针杂交的工序，所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列、具有已知序列 且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列； 进行与上述被检核酸互补的DNA链的合成，制作由包含上述标签序列的DNA互补链构 成的cDNA文库的工序；以及 对上述cDNA文库的全部或一部分进行核酸扩增的工序。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，核酸探针还包含分子识别用标签序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，作为靶的被检核酸为构成生物体组织的细胞内 的mRNA，使细胞识别用标签序列包含在比该细胞的尺寸小的每个区域不同的序列，由此能 够以保存有构成生物体组织的细胞在平面内的位置信息的形态制作cDNA文库。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，生物体组织为组织切片，将构成该组织切片的细 胞内的mRNA向支撑体转录，所述支撑体上固定有包含在每个区域不同的细胞识别用标签 序列的核酸探针。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，作为靶的被检核酸为排列成2维保持的阵列状的 多个细胞内的mRNA，使细胞识别用标签序列包含对每一个细胞不同的序列，由此能够以保 存有该多个细胞的位置信息的形态制作cDNA文库。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，核酸探针还包含转录因子的启动子序列，核酸扩 增工序包含使用该转录因子由cDNA转录为cRNA的转录反应。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包含对扩增出的产物进行测序的工序。
8. -种基因表达解析用设备，其特征在于，具有在支撑体表面或表面附近2维地分布、 固定有核酸探针的支撑体，所述核酸探针包含：被检核酸捕捉用序列、具有已知序列且根据 在支撑体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列、和具有已知序列的 通用引物序列。
9. 根据权利要求8所述的基因表达解析用设备，其中，核酸探针还包含分子识别用标 签序列。
10. 根据权利要求8所述的基因表达解析用设备，其中，被检核酸捕捉用序列包含与作 为靶的被检核酸的一部分互补的序列。
11. 根据权利要求8所述的基因表达解析用设备，其中，支撑体由对波长300nm? lOOOOnm的光中的至少一部分波长的光为透明的材料制作。
12. 根据权利要求8所述的基因表达解析用设备，其中，支撑体为细孔片。
13. -种基因表达解析装置，其特征在于，具有： 权利要求8所述的基因表达解析用设备； 用于将试剂引入上述基因表达解析用设备的单元，所述试剂用于合成与作为靶的被检 核酸互补的DNA链； 用于将用于进行核酸扩增的试剂引入上述基因表达解析用设备的单元；以及 用于控制上述基因表达解析用设备的温度的单元。
14. 根据权利要求13所述的基因表达解析装置，还具有： 显微镜；以及 使显微镜像和使用上述设备获得的上述被检核酸的定量数据对应的单元，所述显微镜 像是在从细胞提取上述作为靶的被检核酸前由上述显微镜观察到的。
15. -种基因表达解析装置，其特征在于，具有： 支撑体，在所述支撑体表面或表面附近2维地分布、固定有探针分子，所述探针分子包 含生物体分子捕捉用序列、和具有已知序列且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不同 而不同的细胞识别用标签序列； 显微镜；以及 使显微镜像和使用上述支撑体获得的上述生物体分子的定量数据对应的单元，所述显 微镜像是在从细胞提取上述生物体分子前由上述显微镜观察到的。
【文档编号】C12M1/00GK104508128SQ201280074958
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2012年7月30日 优先权日:2012年7月30日
【发明者】白井正敬, 神原秀记, 谷口妃代美, 田边麻衣 申请人:株式会社日立制作所