一种用于尿酸诱导目的蛋白表达的dna片段及相关启动子与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于尿酸诱导目的蛋白表达的DNA片段及相关启动子与应用。本发明提供了一种DNA分子，其核酸序列为序列表中序列1自5’末端第143-200位核苷酸。含有上述DNA分子的DNA片段也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明通过改造大肠杆菌lac启动子-35区和-10区，得到一个新的启动子，该启动子可在尿酸调控蛋白HucR和尿酸转运蛋白YgfU的配合下，利用尿酸诱导目的蛋白的表达。因此本发明的启动子及相关表达系统可用来在尿酸的诱导下进行目的蛋白表达，也可用于生物型尿酸检测系统。
【专利说明】一种用于尿酸诱导目的蛋白表达的DNA片段及相关启动子与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种用于尿酸诱导目的蛋白表达的DNA片段及相关启动子与应用。
【背景技术】
[0002]重组蛋白表达系统是现代生物技术的重要研究内容，已在食品、制药、洗涤剂生产等领域广泛应用。其中，细菌异源表达系统具有细菌生长代时短、菌体生长密度高、底物廉价、遗传背景清楚、适合进行工程菌株改造等显著优势，尤其是大肠杆菌表达系统，已成为应用最为广泛的表达系统之一。
[0003]异源蛋白的重组表达，通常要求通过分子克隆等技术将目标蛋白编码序列置于具有较强转录能力启动子之后。目前，已有多种大肠杆菌适用的启动子被研究报道。其中直接或间接受异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷调控的lac、tac、trc、T7启动子，受四环素调控的tet启动子，受阿拉伯糖调控的阿拉伯糖启动子(P_)，受鼠李糖调控的rha Pbad等已被应用，成功表达了多种不同类型的异源重组蛋白。
[0004]大肠杆菌的乳糖操纵子已被深入研究。乳糖启动子Iac本身转录能力较弱，不适用于重组蛋白的大量表达。但许多启动子的构建，都是在乳糖操纵系统的功能元件上改造而成。例如，经典的tac启动子和trc启动子均由色氨酸启动子的-35区和Iac启动子的-10区组合拼接而成 ，较之Iac启动子具有更高的表达效率。而T7启动子则利用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷来调控T7RNA聚合酶的表达，进而开启Τ7启动子系统表达下游重组蛋白；这一技术已被Novagen等公司研发出系列商业化载体，成功表达了多种不同来源的异源蛋白。
[0005]总结一下，一套成功的重组蛋白表达系统，首先要求启动子的相关元件能被宿主菌识别。而要成功表达异源重组蛋白，不仅要求启动子具有较高的转录效率，还要求启动子渗漏性表达水平较低，尤其是一些对宿主细胞具有一定毒性的蛋白。最后，从降低生产成本考虑，诱导物本身价格应较为低廉，来源广泛，且不被宿主菌本身代谢系统所降解利用。
[0006]具强耐福射特性的极端微生物耐福射球菌(Deinococcus rad1durans)的基因组分析揭示了该菌抗逆特性相关的部分功能组件。其中，编码区drll59编码的推测尿酸酶调控蛋白(hypothetical uricase regulator, HucR)的研究显不，HucR可形成蛋白二聚体结合于其自身编码序列和反向的尿酸酶编码序列的启动子区域(hucO)中的DNA结合位点序列；但与尿酸结合后，HucR蛋白结构发生变化，从DNA结合位点解离；因此，HucR调控系统成为耐辐射球菌根据环境尿酸情况变化，有效调控HucR蛋白本身及尿酸降解相关的尿酸酶表达的系统。因为尿酸是一种价格较低廉的化合物，并且不为大肠杆菌所代谢利用，此研究结果预示着可对此启动子加以改造，构建以尿酸为诱导物的大肠杆菌重组蛋白表达系统。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的是提供一种DNA分子。
[0008]本发明提供的DNA分子，其核酸序列为序列表中序列I自5’末端第143-200位核苷酸。
[0009]上述DNA分子作为启动子中的应用也是本发明保护的范围。
[0010]含有上述DNA分子的DNA片段也是本发明保护的范围。
[0011]上述DNA片段由DNA片段1、目的蛋白基因和含有上述DNA分子的DNA片段2组成；
[0012]所述DNA片段I为含有驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6、HucR编码基因、YgfU编码基因的片段；
[0013]上述DNA分子用于驱动所述目的蛋白基因表达。
[0014]上述HucR编码基因和YgfU编码基因的转录方向与目的蛋白基因的转录方向相反。
[0015]在上述DNA片段中，所述驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6的编码序列为序列I自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互补序列；
[0016]所述HucR编码基因的编码序列为序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列；
[0017]所述YgfU编码基因的编码序列为序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列；
[0018]所述DNA片段I具体为序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的双链DNA分子；
[0019]所述DNA片段2具体为序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0020]上述DNA片段中，所述目的蛋白基因为红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的编码序列为序列表中序列I自5’末端280-957位核苷酸；
[0021]所述DNA片段为序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的双链DNA分子。
[0022]含有上述的DNA分子或含有上述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0023]上述重组载体的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0024]上述重组菌为将所述重组载体转入宿主菌中得到的重组菌。在本发明的实施例中，上述宿主菌具体为大肠杆菌DH10B。
[0025]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述重组载体、转基因细胞系或重组菌在尿酸诱导目的蛋白的表达中的应用。
[0026]本发明的另一个目的是提供一种尿酸诱导目的蛋白的表达的方法。
[0027] 本发明提供的方法，包括如下步骤:将目的蛋白的编码基因通过上述重组载体导入宿主菌中，得到重组菌；再在含有尿酸的培养基中发酵上述的重组菌，实现尿酸诱导目的蛋白。
[0028]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述的重组载体、转基因细胞系或重组菌在利用目的蛋白表达水平监测尿酸浓度中的应用也是本发明保护的范围。
[0029]本发明的实验证明，本发明通过改造大肠杆菌Iac启动子-35区和-10区，得到一个新的启动子，该启动子可在尿酸调控蛋白HucR和尿酸转运蛋白YgfU的配合下,利用尿酸诱导目的蛋白的表达。因此本发明的启动子及相关表达系统可用来在尿酸的诱导下进行目的蛋白表达。本发明也可用于尿酸生物型检测系统。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为SHY质粒的结构示意图
[0031]图2为尿酸诱导系统诱导曲线
【具体实施方式】
[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]实施例1、启动子A及用于尿酸诱导的DNA片段的获得
[0035]下述实施例中的序列I所示的DNA为质粒SHY,序列2所示的DNA为对照质粒HY,SHY质粒的核苷酸序列序列I与对照质粒HY核苷酸序列序列2的唯一区别仅在于将序列2的自5’末端第143-200位核苷酸的Iac启动子替换为序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的启动子A。
[0036]上述质粒具体构建方法如下:
[0037]1、尿酸调控蛋白HucR及其编码基因的获得
[0038]提取耐福射球菌(Deinococcusrad1durans) (ATCC 13939)的基因组 DNA 并以其为模板，以 5，-gcacatatgatgagcgcgcgcatggataac-3> (forward)和 5，-agagagctcttaaacaccctgttcgaggc-3’ (reverse)为引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下:先95°C预变性4min，然后 95°C 45s, 55°C 30s, 72°C 30s，共 30 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。
[0039]回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得543bp的条带(经过测序，其编码序列为序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列)。
[0040]将上述获得543bp的PCR产物用NdeI和SacI双酶切，酶切产物与经相同酶切的331 Ibp的DsRed载体(Clontech公司，产品编号632412)载体骨架用T4连接酶(购自宝生物公司)16°C连接过夜，连接产物转化入大肠杆菌MC1061感受态细胞，获得重组菌。
[0041]提取重组菌的质粒，该质粒为将序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列所示的调控蛋白HucR基因插入DsRed载体(已有组成型启动子CP6,在该启动子后插入调控蛋白HucR基因)的NdeI和SacI酶切位点间得到的载体，测序验证无误，命名为SH质粒，该质粒包括驱动HucR编码基因表达的启动子CP6 (其编码序列为序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互补序列)、HucR编码基因(其编码序列为序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列)。
[0042]序列表中序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列所示片段为尿酸调控蛋白HucR的编码基因，编码的尿酸调控蛋白HucR的氣基酸序列为序列表中序列3。
[0043]2、尿酸转运蛋白YgfU及其编码基因和对照质粒HY的获得
[0044]提取大肠杆菌MC1061 (Casadaban, MJ & Cohen, SN (1980) Analysis of genecontrol signals by DNA fus1n and cloning in Escherichia col1.J.Mol.B1l.138179-207 ;公众可从中国科学院微生物研究所获得)的基因组DNA并以其为模板，以5’_ttcgagctcaacaccctgttcgaggcccgc_3，(forward) #口 5，_gctgaagaaaaatgagcatggagaataagctagccca-3’ (reverse)为引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下:先95°C预变性4min，然后95°C45s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。
[0045]回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得1449bp的条带(为序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列所示的转运蛋白YgfU编码基因)。
[0046]将上述获得的1449bp大小的PCR产物用NheI和SacI双酶切，酶切产物与经相同酶切的3941bp的SH载体骨架用T4连接酶(购自宝生物公司)16°C连接过夜，连接产物转化入大肠杆菌MC1061感受态细胞，获得重组菌。
[0047]提取重组菌的质粒，该质粒为将序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列所示的转运蛋白YgfU编码基因插入SH载体的SacI酶和NheI切位点间得到的载体，测序验证无误，命名为HY质粒(ygfU基因紧跟hucR基因，也利用CP6启动子进行表达。
[0048]HY质粒包括对照DNA片段，对照DNA片段包括驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6 (其编码序列为序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互补序列)、HucR编码基因(其编码序列为序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列)、YgfU编码基因(其编码序列为序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列)、红色荧光蛋白RFP基因(其编码序列为序列表中序列I或2自5’末端第280-957)、驱动红色荧光蛋白RFP基因表达的乳糖启动子Iac (其编码序列为序列2自5’末端第143-200位核苷酸)。
[0049]对照DNA片段由含有驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6、HucR编码基因、YgfU编码基因的DNA片段1、红色荧光蛋白RFP基因和含有驱动红色荧光蛋白RFP基因表达的乳糖启动子Iac的DNA片段2组成；其中，DNA片段I为序列表中序列2自5’末端958-3303位核苷酸的所示的双链DNA分子，红色荧光蛋白RFP基因编码序列为序列表中序列I或2自5’末端第280-957，DNA片段2为序列表中序列2自5’末端143-279位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0050]HY质粒的核苷酸序列为序列表中的序列2，其中对照DNA片段为序列表中序列2自5’末端第143-3303核苷酸所示的双链DNA分子。
[0051]序列表中序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列所示的片段为尿酸转运蛋白YgfU的编码基因，编码的尿酸转运蛋白YgfU的氨基酸序列为序列表中序列4。
[0052]3、驱动目的基因(红色荧光蛋白基因)表达的启动子A、用于尿酸诱导的DNA片段及重组载体SHY的获得
[0053]耐辐射球菌基因组中，尿酸调控蛋白HucR在hucO中的DNA结合序列已被实验证实。为了改造HY质粒中的启动子Iac的-35区和_10区，在设计如下引物时加入新的片段，得到新的启动子。
[0054]I^l 5，-atctaagtatat￡ttgtgtggaaccgatttaataaaacaa-3> (forward) #口 5，—gtctacctatgtaaagcctggggtgcctaatg-3’ (reverse)为引物、上述2得到的HY质粒为模板进行PCR扩增，将HY质粒线性化。PCR扩增条件如下:先95°C预变性4min，然后95°C 45s, 55°C30s, 72°C 6min，共 30 个循环；最后 72°C延伸 1min00
[0055]回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得5404bp的条带。
[0056]将上述5404bp线性化质粒片段用T4连接酶(购自宝生物公司)16°C连接过夜，连接产物转化入大肠杆菌MC1061感受态细胞，获得重组菌。
[0057]提取重组菌的质粒，该质粒的核苷酸序列为序列表中的序列1，命名为SHY质粒，为重组载体(其结构示意图如图1所示，其中受尿酸调控的启动子为驱动目的蛋白基因表达的启动子A)。
[0058]SHY质粒中的含有用于尿酸诱导的DNA片段，用于尿酸诱导的DNA片段包括驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6 (其编码序列为序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互补序列)、HucR编码基因(其编码序列为序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列)、YgfU编码基因(其编码序列为序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列)、红色荧光RFP蛋白基因(其编码序列为序列表中序列I或2自5’末端第 280-957)、驱动红色荧光蛋白RFP基因表达的启动子A (其编码序列为序列I自5’末端第143-200位核苷酸)。
[0059]用于尿酸诱导的DNA片段由含有驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6、HucR编码基因、YgfU编码基因的DNA片段1、红色荧光蛋白RFP基因和含有驱动红色荧光蛋白RFP基因表达的启动子A的DNA片段2组成；其中，DNA片段I为序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的双链DNA分子，红色荧光蛋白RFP基因编码序列为序列表中序列I或2自5’末端第280-957，DNA片段2为序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0060]用于尿酸诱导的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列I自5 ’末端第143-3303核苷酸所示的双链DNA分子(即包括改造后受尿酸调控启动子、报告基因、受组成型启动子调控表达的调控蛋白HucR和转运蛋白YgfU)。
[0061 ] SHY质粒的核苷酸序列序列I与对照质粒HY核苷酸序列序列2的唯一区别仅在于将序列2的自5’末端第143-200位核苷酸所示的启动子Iac替换为序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的启动子A。
[0062]实施例2、启动子A及用于尿酸诱导的DNA片段的在尿酸诱导目的基因表达中的应用
[0063]将由实施例1得到的重组载体SHY和对照质粒HY分别转入大肠杆菌DHlOB中，得到含有SHY的重组菌DH10B/SHY和含有HY的重组菌DH10B/HY (分别提取质粒测序验证正确)。
[0064]挑取重组菌DH10B/SHY和重组菌DH10B/HY的单菌落，在加入氨苄抗生素抗性的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母提取物5g/L，添加抗生素氨苄霉素至100 μ g/mL) 37°C摇床培养过夜(12h)至菌浓度达到饱和(0D600为3.5)，得到种子液；
[0065]将种子液按照接种量1%接入不同浓度的尿酸培养基中诱导12h，培养条件为37°C摇床(250rpm)。至诱导时间结束,取出培养物,离心收集菌体弃上清液(3000g, lOmin);再以磷酸缓冲液(lOOmM，pH6.0)重悬菌体，吸取200 μ L菌体以酶标仪测试菌浓度0D_及红色荧光蛋白读数。
[0066]上述不同浓度的尿酸培养基按照如下方法制备:将胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物、氨苄霉素、尿酸与PH7.0、浓度为500mM的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液母液和水混合，其中胰蛋白胨的终浓度为10g/L、NaCl的终浓度为10g/L、酵母提取物的终浓度为5g/L、氨苄霉素的终浓度为100μ g/mL、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液的终浓度为17mM，不同浓度的尿酸培养基中的尿酸终浓度分别为 0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、
0.02mM,0.03mM,0.04mM 和(λ 05mM。
[0067]重组菌DH10B/SHY的诱导结果如图2所示，纵坐标为报告基因红色荧光蛋白诱导倍数(为尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数/不经尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数的比值)；可以看出，在尿酸终浓度为 0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM,
0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM和0.05mM中的培养基中，重组菌DH10B/SHY生长并诱导表达蛋白后，报告基因红色荧光蛋白读数分别为168、1539、7506、15726、20247、27946、40416、52698、62883、70139、72818 ;尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数/不经尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数的比值分别为 1、9.16,44.67,93.61,120.51,166.34,240.57,313.67、374.30,417.49,433.44倍。测试结果显示，随着尿酸浓度增加，报告基因红色荧光蛋白读数增加。说明启动子A、含有启动子A的用于尿酸诱导的DNA片段、SHY载体可以在尿酸的诱导下使目的蛋白红色荧光蛋白表达。
[0068]重组菌DH10B/HY的诱导结果如下:在尿酸终浓度为0mM、0.002mM、0.005mM、
0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM 和 0.05mM 中的培养基中，重组菌DH10B/HY生长并诱导表达蛋白后，报告基因红色荧光蛋白读数基本均为80-160 ;不经尿酸诱导(OmM)报告基因红色荧光蛋白读数为153 ;因此可以看出，尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数/不经尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白读数的比值基本在I以内，即不被尿酸诱导。
[0069]重组菌DH10B/SHY的诱导结果显示，当尿酸浓度低于0.01mM时，尿酸诱导报告基因红色荧光蛋白诱导倍数与尿酸浓度呈线性关系，公式为y=11946x-ll.77(其中y为红色荧光蛋白诱导倍数，X为尿酸浓度，此标准曲线标准误差平方可达0.97，线性化良好)。因此，可以采用本发明的载体、启动子或片段用于外界尿酸浓度监测。
[0070]上述结果可以看出，与对照质粒HY相比，SHY质粒可以更好地在尿酸诱导下表达目的蛋白，且SHY质粒和对照质粒HY唯一的区别仅在于启动子的不同，说明SHY质粒的启动子A具有更好地在尿酸诱导下表达目的蛋白的功能。
【权利要求】
1.一种DNA分子，其核酸序列为序列表中序列I自5’末端第143-200位核苷酸。
2.权利要求1所述DNA分子作为启动子中的应用。
3.含有权利要求1所述DNA分子的DNA片段。
4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段由DNA片段1、目的蛋白基因和含有权利要求1所述DNA分子的DNA片段2组成； 所述DNA片段I为含有驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6、HucR编码基因、YgfU编码基因的片段； 权利要求1所述DNA分子用于驱动所述目的蛋白基因表达。
5.根据权利要求3或4所述的DNA片段，其特征在于: 所述驱动HucR编码基因和YgfU编码基因表达的启动子CP6的编码序列为序列I自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互补序列； 所述HucR编码基因的编码序列为序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互补序列； 所述YgfU编码基因的编码序列为序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互补序列； 所述DNA片段I具体为序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的双链DNA分子； 所述DNA片段2具体为序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的双链DNA分子。
6.根据权利要求3-5中任一所述的DNA片段，其特征在于:所述目的蛋白基因为红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的编码序列为序列表中序列I自5’末端280-957位核苷酸； 所述DNA片段为序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的双链DNA分子。
7.含有权利要求1所述的DNA分子或含有权利要求3-6中任一所述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌； 所述重组菌具体为将所述重组载体转入宿主菌中得到的重组菌。
8.权利要求1所述的DNA分子或权利要求3-6中任一所述DNA片段或权利要求7所述的重组载体、转基因细胞系或重组菌在尿酸诱导目的蛋白的表达中的应用。
9.一种尿酸诱导目的蛋白的表达的方法，其特征在于:将目的蛋白的编码基因通过权利要求7所述的重组载体导入宿主菌中，得到重组菌；再在含有尿酸的培养基中发酵所述重组菌，实现尿酸诱导目的蛋白。
10.权利要求1所述的DNA分子或权利要求3-6中任一所述DNA片段或权利要求7所述的重组载体、转基因细胞系或重组菌在利用目的蛋白表达水平监测尿酸浓度中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104073489SQ201310101960
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2013年3月27日
【发明者】梁朝宁, 熊丹丹, 唐双焱 申请人:中国科学院微生物研究所