专利名称：一种免疫增强型抗大肠杆菌etec重组乳酸菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及融合基因DC-pep-FaeG, 一种重组DC-p印-FaeG的乳酸菌表达质粒韓bet-DC-p印-FaeG, 一种免疫增强型抗大肠杆菌(ETEC)重组乳酸菌及其制备方法。
背景技术：
产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是常见的病原性大肠杆菌，由ETEC引起的仔猪腹泻病发病迅速，发病率和死亡率均较高，是造成养猪业重大经济损失的疾病之一，研究和创制该种疫苗是预防本病发生发展、促进健康养殖的重要保障。ETEC感染仔猪后，首先通过粘附素与小肠上皮细胞的特异性受体结合，促使ETEC在小肠内定居、繁殖，然后分泌肠毒素引起肠上皮细胞产生一系列的病理变化，从而扰乱细胞内水和电解质的平衡，最后导致仔猪发病甚至死亡。在这个过程中，粘附素介导了大肠杆菌与肠上皮受体结合，构成了 ETEC致病的首要条件。粘附素主要是指细菌表面的菌毛，是一种丝状的多聚蛋白结构，介导细菌粘附宿主细胞。K88菌毛是构成粘附素的重要物质，主要由FaeG和一些小亚基构成，FaeG是由数百个重复的蛋白亚单位组成，是K88菌毛的主要蛋白亚基，也是其粘附亚基，促使细菌与小肠粘膜上皮细胞的特异性受体结合，导致K88 (+)ETEC在肠道内定植，然后产生毒素，致使仔猪发生腹泻。由于K88(+)ETEC的流行较为普遍，对K88的研究也相对广泛，因此利用K88菌毛研制粘附素疫苗对预防仔猪大肠杆菌腹泻病具有重要意义。Vanden Broeck利用纯化的K88菌毛抗原经口服免疫含有K88受体的仔猪，在其肠道内诱导K88的特异性免疫反应，在血清中检测到IgA和IgM抗体，有效预防了K88(+)ETEC 的侵袭。众所周知，树突状细胞(DCs)是机体功能最强大免疫递呈细胞，DCs在启动获得性免疫中发挥着关键性作用，DCs接触抗原后，对抗原进行识别、捕获和加工，并形成MHC-抗原肽复合物以启动机体的细胞免疫和体液免疫应答。肠道粘膜免疫系统由上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞和Peyer’s Patches (PP)等肠相关淋巴组织构成。在肠道内的很多组织区室已经鉴定出了具有专门抗原提呈作用的DCs，包括粘膜固有层(LP)，滤泡相关肠上皮下穹隆，粘膜相关淋巴组织的T细胞丰富区，位于上皮细胞或其下方的DCs可通过M细胞捕捉穿越上皮细胞的各种细菌抗原。因此，DCs对免疫原的识别是疫苗发挥作用的免疫学基础。树突状细胞诱导肽(DC-targeting peptide, DCpep)是由36个碱基组成的短肽，具有特异性靶向结合DCs的作用，有助于DCs直接、有效的识别并捕获目的抗原，引发肠道内高效的粘膜免疫反应，从而指导和调节获得性免疫。已有研究证实针对丙型肝炎病毒抗原融合DCpep作用于DCs，结果表明诱发机体产生了高效的抗原特异性免疫反应，并发现抗原融合DCpep没有修改DCs的表型和功能,而是介导DCs祀向识别抗原,强化抗原的成熟。
乳酸菌作为体内重要的益生菌，已被国际公认为“安全级”的微生物，利用乳酸菌的这一优势，采用重组DNA技术，构建可稳定表达DCp印与抗原肽融合的重组乳酸菌，在创制口服疫苗方面具有重要的现实意义和潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫增强型预防产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染的重组乳酸菌。一种融合基因其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所不；
一种融合基因的制备方法,它包括:
提取ETEC CVCC200的内源性质粒，并以其为模板，用引物: Pl: ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC ；
P2:CGAAGCTTTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAATTAGTAATAAGT ；
PCR方法扩增。一种重组的乳酸菌表达质粒调Mbet-DC-pep-FaeG,它是在表达载体pW425et上插入了其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不的基因；
一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，它是转化了^AltOet-DC-Pep-FaeG 的乳酸杆菌。所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。本发明利用DC-pep的祀向诱导功能和FaeG的抗原性,构建大肠杆菌_乳酸菌穿梭表达重组质粒mUDC-p印-FaeG,将重组质粒转化至乳酸杆菌中，获得了免疫增强功能的抗ETEC的重组乳酸杆菌，经过大量增菌培养后，每周灌胃小鼠3次，连续灌服2周，提高2倍剂量，继续灌胃4周，间隔2周后，分别攻菌ETEC I次，I周后处死小鼠。结果表明，与ETEC油苗相比，重组乳酸杆菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中⑶Ilc+DCs数量、血清中IgG和肠内容物中SlgA含量。本发明利用FaeG的抗原性和DC-pep祀向诱导DCs的功能,制备了可稳定表达DC-p印-FaeG融合蛋白的免疫增强型重组乳酸菌，该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的FaeG借助DC_p印的功能被靶向递呈给DCs，有效地诱导机体产生IgG和slgA，有效预防ETEC的感染。本发明制备了免疫增强型抗ETEC的重组乳酸菌，其制备方法和生产工艺相对简便，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。
图1.DC-pep-FaeG融合基因的PCR扩增；
图2.DC-pep-FaeG回收结果；
图3.pMDlST-jOedaM质粒电泳结果；
图 4.pMD18T-1^-/76>/7-/^a￡^ 双酶切鉴定结果；
图5.VHt-DCnFaeG双酶切鉴定结果；
图6.重组乳酸杆菌表达产物检测；图7.小鼠IgG抗体水平；
图8.小鼠肠内容物中slgA抗体水平；
图9.小鼠结肠的病理变化；
图10.⑶lie + DCs在脾脏和淋巴结中的表达。
具体实施例方式实施例\DC-p印-FaeG融合基因的获得 (I)引物的设计与合成
根据GenBank上发表的ETEC K88菌毛蛋白亚基/ %基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，在下游引物的5’端插入大小为36bp饱DC-卿片段，且上、下游引物分别设计Kpn I酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下:
上游引物(Pl): 5’ ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC 3’
下游弓丨物 (P2): 5’ CQkkQCimkTGGACGTTGTGGAGTTGAA TGGTA TGA TGGGTAGAATTAGTAATAAGT 3’(斜体为片段)
(2 ) DC-pep-FaeG融合基因的PCR扩增
采用质粒小提试剂盒，按照说明书操作提取ETEC CVCC2citl(血清型0149)的内源性质粒，并以其为模板，应用上述设计的引物，采用PCR方法扩增目的融合基因，结果扩增了大小约为888 bp的融合基因，如图1所示。PCR反应体系:
权利要求
1.一种融合基因其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.一种融合基因DC-p印-FaeG的制备方法，它包括: 提取ETEC CVCC200的内源性质粒，并以其为模板，用引物:Pl: ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC ；P2:CGAAGCTTTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAATTAGTAATAAGT ； PCR方法扩增。
3.一种重组的乳酸菌表达质粒调Albe弋-DC-pep-FaeG，它是在表达载体pff425et上插入了其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不的基因。
4.一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，它是转化了权利要求3所述的一种重组的乳酸菌表达质粒例Albet-DC-pep-FaeG的乳酸杆菌。
5.根据权利要求4所述的一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，其特征在于:所述的乳酸 杆菌为植物乳酸杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种免疫增强型抗大肠杆菌ETEC重组乳酸菌及其制备方法，利用DC-pep的靶向诱导功能和FaeG的抗原性，构建了融合基因DC-pep-FaeG，及大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-DC-pep-FaeG，将重组质粒转化至乳酸杆菌中获得免疫增强型重组乳酸菌。可稳定表达DC-pep-FaeG融合蛋白，该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的FaeG借助DC-pep的功能被靶向递呈给DCs，有效地诱导机体产生IgG和sIgA，预防ETEC的感染，优于ETEC油苗。生产工艺简便、安全，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。
文档编号C12N15/10GK103233027SQ20131014457
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者王春凤, 杨桂连, 佟盼盼, 杨文涛, 郝凤奇 申请人:吉林农业大学