产油单针藻lb59的获得及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产油单针藻LB59的获得及应用，涉及产油微藻的筛选和培养技术；自野外环境分离获得的藻种经18SrDNA序列分析和形态鉴定，确定该藻为单针藻属（Monoraphidium）成员，其序列为SEQ?ID?NO.1。本产油单针藻LB59能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，富含油脂，在维持23.6g/m2d的生长和收集速率的情况下，油脂含量可达到细胞干重的30.2%，脂肪酸中含有20%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸。
【专利说明】产油单针藻LB59的获得及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及产油微藻的筛选和培养技术，尤其涉及一种产油单针藻LB59的获得及应用。具体地说，本发明是从野外采集水样，通过分离纯化得到一种可作为生产油脂原料的产油藻株。
【背景技术】
[0002] 地球上被鉴定的藻类大约超过40000种，其中一些种类富含油脂。从油藻提取的油脂可以经过与甲醇反应转化为生物柴油，被认为最有可能替代日渐枯竭的石油来源的柴油。其含有的16碳和18碳的脂肪酸对于生物柴油的生产最为有利。藻类的油脂也含有不饱和脂肪酸，可以添加到动物饲料中促进生长。筛选获得容易培养、生长快、产油高的藻种是生产出具有市场竞争力的油藻生物质的关键。早在上世纪70年代，美国国家可再生能源实验室的水生物种计划，就开始利用藻类提取油脂、制备生物柴油的研发工作，从海洋和湖泊中分离了 3000多种藻类，从中筛选出300多种生长快、含油高的硅藻、绿藻和蓝藻等藻种，但当时未解决成本问题。世界上其它各国的研究者也都利用各种手段积极地筛选寻找能适应商业化生产的优良藻种。
[0003]当前需要亟待解决以下问题:对生长速率快、油脂含量高的微藻藻株的筛选和遗传改良；低成本、高密度培养体系的建立；高效、低成本光生物反应器的开发；高效率、低成本的采收技术；微藻的高效能源转化技术等。从以上可以看出，对于生长快、容易大量培养、油脂含量高的微藻的选育是当前需要解决的首要问题。近几年，国内多家实验室已经开始分别在科技部、自然科学基金委以及大型企业的资助下，开展大规模采集和筛选高产油藻株的工作，并且取得了一些进展。选自自然生境的微藻往往在温度、光照和盐度适应方面具有一定的抗逆性，适于在开放的跑道池中大量培养生产。
[0004]本发明就是基于以上背景从内蒙野外水体采集、分离和纯化而得到的一个优良的
产油藻株。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就在于克服现有技术中用于生产微藻油脂的优良藻株不足的问题，提供一种产油单针藻LB59的获得及其应用，即在内蒙野外水域采集水样，分离纯化获得的了一种具有抗逆性、易开放培养的产油微藻，并建立培养和收集等方法。
[0006]一、单针藻LB59的获得
①样品采集
水样采自内蒙古锡林格勒盟锡林浩特市桃林塔拉分场G303国道水洼，精确位置为北纬43°54’4.85”，东经116。19’32.71”。采样时间是2011年7月29日，当天的水温为28.1。。，水样的电导率为0.392 ms/cm, pH为7.45。
[0007]②藻种的分离、18S rDNA序列分析和形态鉴定
水样通过稀释涂平板法在补加8.4g/L碳酸氢钠的BGll培养、分离出单藻落，各藻落少量培养提取总脂在薄层层析板上比较。选含油量较高的一株，通用引物扩增18S rDNA,经克隆后送测序，其序列为SEQ N0.1 (见序列表)；通过系统关系树构建确定该藻为单针藻属(Monoraphidium)成员(图1);在显微镜下观察其形态符合单针藻属特征，具有片状叶绿体，命名为单针藻LB59 (Monoraphidium sp.LB59)(图2);与同属的LB50藻株(另一专利申请)相比，细胞较小，18S rDNA有8个碱基不同(见序列表中方框中的碱基);2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M2013349。
[0008]二、单针藻LB59的培养收集方法
①培养:采用降低硝酸钠含量的BGlI，补加高浓度碳酸氢钠进行培养，培
养基全部成分见表1 ;
通过试验比较，建立了单针藻LB59培养条件，单针藻LB59培养条件是:光照强度200μΕ/m2.S，温度条件30-35°C，培养基为具有0.75 g/L硝酸钠的BG11，补加12.6 g/L碳酸氢钠(培养基全部成分见表1)。以圆形开放式光反应器进行培养(见图3)，每天通入二氧化碳I小时，每5天收集1/2的培养细胞，并补充等体积的新鲜培养基，其生长速率能够达到23.6 g/m2d(每天每平米获得的干物质)，这样可以长时间持续培养和收集；由于其光合放氧活性在2000 μ E/m2.s达到饱和，还可以进一步提高光照强度促进其生长和产油。
[0009]表1培养基成分
【权利要求】
1.一种产油单针藻LB59，其特征在于: 用含有碳酸氢钠的BGll中培养、分离获得的一种绿藻，在显微镜下察其形态符合单针舊MMonoraphidiuni特篆;其18S rDNA序列SEQ N0.1,经系统关系分析证明属于一种单针藻，命名为单针藻LB59,即sp.LB59 ;该藻种能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，在维持23.6 g/m2d的生长和收集速率的情况下，油脂含量可达到细胞干重的30.2%，脂肪酸中有20%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸；2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013349。
2.按权利要求1所述的一种产油单针藻LB59的培养收集方法，其特征在于: ①单针藻LB59的培养:采用降低硝酸钠含量的BG11，补加高浓度碳酸氢 钠进行培养，培养基全部成分见表1 ; ②单针藻LB59的絮凝采收:在大量培养后用稀盐酸调节培养液pH，加壳聚糖絮凝沉淀细胞。
3.按权利要求2所述的培养收集方法的应用，其特征在于: ①其大量培养获得的含油藻细胞用于油脂提取； ②其藻细胞直接添加到动物饲料中增加不饱和脂肪酸营养； ③其藻细胞的大量培养可 吸收工业排放的二氧化碳。
【文档编号】C12R1/89GK103540533SQ201310428561
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】孔任秋, 徐旭东, 席玮芳, 高宏, 方仙桃 申请人:中国科学院水生生物研究所, 中国石油化工股份有限公司