美人蕉黄斑驳病毒巢式pcr检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于美人蕉黄斑驳病毒的检测。该试剂盒包括：外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物、内侧下游引物、PCR?Buffer、dNTPs、Mgcl2、Taq?DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和ddH2O。本发明根据美人蕉黄斑驳病毒基因序列设计2对特异性引物，以提取的DNA为模板进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小为352bp的特异性目的片段，则判定检测的病毒为美人蕉黄斑驳病毒。本发明利用巢式PCR技术对美人蕉黄斑驳病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、检测用时短的优点，能够满足进出境口岸检疫及农业生产的需要。
【专利说明】美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫【技术领域】，适用于进出境及农业生产上美人蕉黄斑驳病毒的快速检测和监测。
【背景技术】
[0002]美人蕉黄斑驳病毒(Canna yellow mottle virus,CaYMV)属于花椰菜花叶病毒科(Caulimo Viridae)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)成员，最早发现于日本美人蕉上。CaYMV病毒粒子呈杆状(120-130nmX28nm)，病毒基因组为环状双链DNA (含3个ORF)。CaYMV的寄主范围较窄，已报道的自然寄主为美人蕉，该病毒侵染美人蕉后可以产生多种症状，典型症状包括叶片产生褪绿斑、叶脉黄化、茎杆和花上出现条斑等，危害美人蕉的正常生长，影响其观赏价值和经济价值。CaYMV主要分布在日本、美国。CaYMV引起的美人蕉黄斑驳病防治极其困难，近年来在美国ー些地区发生严重，当地被迫采取销毁病株的手段来防止其大面积扩散。由于CaYMV可随美人蕉种苗的运输而进行远距离传播，因此建立快速、有效的检测方法对预防和控制该病毒的发生具有重要意义。针对CaYMV，目前可应用的检测方法主要有电镜观察、血清学和分子生物学检测方法。电镜观察不仅需要大量病株材料进行病毒纯化，而且操作繁锁、时间长。血清学方法使用前提是需要有病毒相应的抗体，而CaYMV至今尚无商品化的抗体，已报道的血清学方法主要是利用与其血清学关系较近的同属病毒抗体进行检測，因此电镜观察、血清学检测方法不适于ロ岸的快速检测。基于核酸水平的PCR分子检测方法可以克服以上弊端，具有特异性强、灵敏度高、检测用时短等优点。但到目前为止，尚未见专门用于CaYMV检测的巢式PCR检测方法，更未见专门用于该病毒检测的巢式PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供ー种美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，快速、准确地检测美人蕉黄斑驳病毒，满足进出境ロ岸检疫及农业生产的需要。
[0004]本发明技术方案如下:
[0005](一)一种用于美人蕉黄斑驳病毒检测的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0006]1)外侧上游引物:10 u mol/L，引物序列为 5’ -TAGGGCAGTCAAGGATTAAGC-3’ ；
[0007]2)外侧下游引物:10 u mol/L，引物序列为 5’ -CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3’ ；
[0008]3)内侧上游引物:10 ii mo I/L，引物序列为 5’ -ACTGCGTCAGITTCTCGG-3 ’ ；
[0009]4)内侧下游引物:10 ii mo I/L，引物序列为 5’ -GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3 ’ ；
[0010]5) PCR Buffer: 10X ;
[0011]6) dNTPs: 10mmol /I,；
[0012]7) Mgcl2:25mmol/L ；[0013]8) Taq DNA 聚合酶:2.5U/U L ；
[0014]9)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品；
[0015]10)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品；
[0016]11) ddH20o[0017](二)上述美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0018]I)第一轮PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA4ii L，按每管加浓度为2.5U/U L Taq DNA 聚合酶 0.5 y L、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LUOXPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/L MgCl22 y L、浓度为10 y mol/L外侧上游引物2 y L、浓度为10 y mol/L外侧下游引物2 ii L、CldH2Ol 1.5 ii L，使反应总体积为25ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、53°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0019]2)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物0.2 ii L，按每管加浓度为2.5U/ u LTaq DNA 聚合酶 0.5iiL、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LU0XPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/L MgCl22 y L、浓度为IOy mol/L内侧上游引物I U L、浓度为IOy mol/L内侧下游引物I y L、ddH2017.3 u L，使反应总体积为25 ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、54°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0020]3) PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物10 ii L用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验結果；含有美人蕉黄斑驳病毒样品的电泳检测结果为在352bp处出现明亮的DNA条带。
[0021]本发明根据美人蕉黄斑驳病毒基因序列设计2对特异性引物(外侧引物I对、内侧引物I对)，经过大量筛选实验，优化确定了最佳反应体系和反应程序，实现了对美人蕉黄斑驳病毒的快速、准确、灵敏检测。较之现有技术而言，本发明所提供的美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于:1)特异性强:由于使用外侧、内侧2对特异性引物，大大提高了 PCR扩增的特异性，有效避免了非目的片段的扩增。本发明能够从感染美人蕉黄斑驳病毒的样品上扩增到大小为352bp的特异性目的片段，而从其他病毒样品及健康样品上均未扩增到相应的目的片段；2)灵敏度高:与普通PCR相比，本发明经过2轮PCR反应，检测灵敏度得到了显著提高。本发明使整个PCR检测灵敏度提高了 IO3倍(第一轮、第二轮PCR的检测下限分别为10_5和10_2倍稀释的DNA)，这对于美人蕉黄斑驳病毒含量低的样本检测具有极其重要的意义；3)检测用时短:本发明检测时间快，能够克服电镜观察和血清学检测方法存在的不足，实现对美人蕉黄斑驳病毒的快速、准确和高效检測。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为实施例2的美人蕉黄斑驳病毒检测結果。其中M:DNA分子量标准(IOObp);
1:阳性对照；2:携帯有美人蕉黄斑驳病毒的样品；3:阴性对照；4:空白対照。
[0023]图2为实施例3的特异性测定結果。其中M =DNA分子量标准(IOObp) ；1:美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV);2:菜豆黄花叶病毒(BYMV)样品；3:黄瓜花叶病毒(CMV)样品；4:番茄不孕病毒(TAV)样品；5:阴性对照。[0024]图3-4为实施例4的灵敏度測定结果(图3为第一轮PCR測定結果，图4为第二轮PCR测定結果)。其中M:DNA分子量标准(IOObp);1:DNA原液；2 =KT1稀释；3:10_2稀释；4:10_3 稀释；5:10_4 稀释；6:10_5 稀释；7:10_6 稀释；8:10_7 稀释；9:10_8 稀释；10:10_9 稀释；
11:阴性对照；12:空白对照。
【具体实施方式】
[0025]以下通过具体实施例对本发明作进ー步说明。
[0026]实施例1:美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
[0027]1)外侧上游引物:10 U mol/L, 1 管(30yL);
[0028]2)外侧下游引物:10 u mol/L, 1 管(30iiL)；
[0029]3)内侧上游引物:10 u mol/L, 1 管(30iiL)；
[0030]4)内侧下游引物:10 u mol/L, 1 管(30iiL)；
[0031]5) dNTPs:10mmol/L，1 管(20ii L);
[0032]6)PCR Buffer:10X， 1 管(60iiL);
[0033]7) Mgcl2:25mmol/L, ` 管(50 U L);
[0034]8) Taq DNA 聚合酶:2.5U/ii L，1 管(10 ii L);
[0035]9)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品1管(50 y L);
[0036]10)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品，1管(50y L);
[0037]11) ddH20，1 管(lmL)。
[0038]实施例2:美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的检测方法
[0039]上述美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
[0040]1)第一轮PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA4ii L，按每管加浓度为2.5U/U L Taq DNA 聚合酶 0.5 y L、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LU0XPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/L MgCl22 y L、浓度为10 y mol/L外侧上游引物2 y L、浓度为10 y mol/L外侧下游引物2 ii L、CldH2Ol 1.5 ii L，使反应总体积为25ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、53°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0041]2)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物0.2 ii L，按每管加浓度为2.5U/ u LTaq DNA 聚合酶 0.5iiL、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LU0XPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/L MgCl22 y L、浓度为IOy mol/L内侧上游引物I U L、浓度为IOy mol/L内侧下游引物I y L、ddH2017.3 u L，使反应总体积为25 ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、54°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0042]3) PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物10 ii L用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验結果；含有美人蕉黄斑驳病毒样品的电泳检测结果为在352bp处出现明亮的DNA条带(图1)，否则无。
[0043]实施例3:美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的特异性測定
[0044]DDNA的提取:分别以携帯有美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV)、菜豆黄花叶病毒(Beanyellow mosaic virus,BYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番爺不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)的样品为材料,各取50_100mg用液氮充分研磨后,转置1.5mL离心管，加入500 u L TES, 50-100 u g蛋白酶K，56°C温育0.5_lh，期间轻轻摇动混匀；加入一定体积 10mol/L NaCl (使之终浓度为 1.4mol/L), 1/10 倍体积 10%CTAB，65°C温育 IOmin ；加入I倍体积氯仿/异戊醇(24:1 )，轻摇混匀，置冰上30min，4°C下12000r/min离心IOmin ；取上清，加入225 u L NH4AC(5mol/L)，混匀，放置冰上lh，4°C下12000r/min离心IOmin ;取上清，加 3 u L Rnase,37°C温育 15min,4°C下 12000r/min 离心 IOmin ;取上清,カロ 0.5 倍体积异丙醇，置冰上15-30min,4°C下12000r/min离心IOmin ;弃上清,沉淀用70%こ醇(预冷)洗涤2次，干燥后溶解于50 ii L TE中，_20°C冷冻保存备用；
[0045]2)第一轮PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA4 U L，按每管加浓度为2.5U/U L Taq DNA 聚合酶 0.5 y L、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LU0XPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/LMgCl22 u L、浓度为10 u mol/L外侧上游引物2 u L、浓度为10 u mol/L外侧下游引物2 ii L、CldH2Ol 1.5 ii L，使反应总体积为25ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、53°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0046]3)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物0.2 ii L，按每管加浓度为2.5U/ U LTaq DNA 聚合酶 0.5iiL、浓度为 10mmol/L dNTPs0.5 u LU0XPCR Buffer2.5 y L、浓度为25mmol/L MgCl22 y L、浓度为IOy mol/L内侧上游引物I U L、浓度为IOy mol/L内侧下游引物I y L、ddH2017.3 u L，使反应总体积为25 ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、54°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束；
[0047]4) PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物10 ii L用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果(图2)。从图2可见，仅美人蕉黄斑驳病毒样品在352bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品和健康样品均无，表明本发明试剂盒·具有很强的特异性。
[0048]实施例4:美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的灵敏度測定
[0049]将美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV)样品的DNA按10倍梯度稀释后，分别作为模板，按实施例2方法进行检测，试验同时设置阴性对照和空白对照。从图3和图4可见，第二轮PCR的检测灵敏度比第一轮PCR高IO3倍，即巢式PCR使检测灵敏度提高了 IO3倍，表明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。
[0050]实施例5:进境美人蕉上美人蕉黄斑驳病毒的检测
[0051]以我国ロ岸进境的美人蕉为材料(共计50份)，提取DNA后按实施例2方法进行检測，试验同时采用普通PCR方法进行检测作对比。结果表明，采用本发明能够从50份美人蕉样品中检测出美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV) 9份(检出率为18%)，比普通PCR检出率高10% (表1)。
[0052]表1进境美人蕉样品的检测结果
[0053]
检测方法~I阳性样品数~I检出率(％)
巢式 PCR 9' 18
普通PCR 48[0054]上述实施例1-5中所使用的各物质的浓度与本发明技术方案中所列出的各物质的浓度对应相同。``
【权利要求】
1.ー种美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:1)外侧上游引物:IOii mo 1/L，引物序列为5’ -TAGGGCAGTCAAGGATTAAGC-3’ ；2)外侧下游引物:10 ii mol/L，引物序列为 5 ’ -CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3 ’ ；3)内侧上游引物:10 y mol/L,引物序列为5’ -ACTGCGTCAGTTTCTCGG-3’ ；4)内侧下游引物:10iimol/L，引物序列为5’-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3’；5)PCR Buffer:10X ；6)dNTPs:10mmol/L ；7)Mgcl2:25mmol/L ；8)Taq DNA聚合酶:2.5U/U L ;9)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品；10)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品；11) ddH20。
2.利用权利要求1所述的美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)第一轮PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA4iiL，按每管加浓度为2.5U/y LTaq DNA 聚合酶 0.L、浓度为 10mmol/L dNTPs 0.5u LUOXPCR Buffer 2.5yL、浓度为25mmol/L MgCl2 2 u L、浓度为10 u mol/L外侧上游引物2 u L、浓度为10 u mol/L外侧下游引物2 ii L、CldH2Ol 1.5 ii L，使反应总体积为25ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、53°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束； 2)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物0.2 iiL，按每管加浓度为2.5U/U L Taq DNA聚合酶 0.L、浓度为 10mmol/L dNTPs 0.5u LU0XPCR Buffer 2.5 y L、浓度为 25mmol/L MgCl22 u L、浓度为10 u mol/L内侧上游引物I U L、浓度为10 u mol/L内侧下游引物I U L、ddH20 17.3 u L，使反应总体积为25 ii L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、54°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸IOmin,反应结束； 3)PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物10 ii L用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有美人蕉黄斑驳病毒样品的电泳检测结果为在 352bp处出现明亮的DNA条带。
【文档编号】C12Q1/70GK103571969SQ201310432439
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】沈建国, 虞赟, 蔡伟, 陈智明, 张永江, 闫诚 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心