一种优化的薏苡srap-pcr反应体系的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种优化的薏苡SRAP-PCR反应体系，该PCR反应体系为：3mmol/L的Mg2+、2U的Taq酶、0.15mmol/L的dNTPs、0.30μmol/L的引物和40ng的模板DNA。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，共5个循环；然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；扩增产物4℃保存。本发明可提高薏苡SRAP-PCR反应效率，显著提高薏苡SRAP-PCR反应产物条带的清晰性与多态性，适用于薏苡种质的鉴定、遗传多样性分析、薏苡遗传连锁图谱的构建等相关领域的研究，具有效率高，条带清晰，多态性好等特点。
【专利说明】—种优化的薏苡SRAP-PCR反应体系
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种优化的薏苡SRAP-PCR反应体系，属农业【技术领域】。
【背景技术】
[0002]SRAP(Sequence一related amplified polymorphism)标记是一种基于PCR技术的分子标记，主要针对基因外显子和内含子的特点设计一对独特的引物对基因的ORFs (Openreading frames)特定区域进行扩增,其上游引物(17bp)和下游引物(18bp)分别对外显子区域和内含子区域进行特异扩增，由于不同物种或不同个体它们的这些区域各不相同，从而产生多态性。该标记具有高效、稳定、简便、多态性丰富、不受环境条件影响和便于克隆目标片段等优点。目前SRAP已广泛应用于水稻、玉米、木薯、小麦、青稞等粮食作物的遗传多样性分析中，但未见相关SRAP标记应用于薏苡遗传研究的报道。SRAP应用于薏苡研究尚处于探索阶段，目前薏苡SRAP-PCR的反应产物条带清晰性差、多态性不好、效率不高，限制了该技术在薏苡遗传研究中的推广与应用。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于改进薏苡SRAP-PCR反应的药剂、温度与程序，提供一种高效、条带清晰、多态性好的薏苡SRAP-PCR反应体系。
[0004]本发明的技术方案如下:
一种优化的薏苡SRAP-PCR反应体系，其特征在于:PCR反应体系为3 mmol/L的Mg2+、2U 的 Taq 酶、0.15 mmol/L 的 dNTPs、0.30 μ mol/L 的引物和 40 ng 的模板 DNA。
[0005]其中，所述的反应体系的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min，94°C变性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸lmin，共5个循环；然后94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸lmin, 35个循环，最后72°C延伸IOmin ;扩增产物4°C保存。
[0006]本发明的优点:
(I)本发明的薏苡SRAP-PCR反应产物条带清晰性、多态性好，适用于薏苡种质的鉴定、遗传多样性分析、薏苡遗传连锁图谱的构建等相关领域的研究。
[0007](2)本发明提高了效率，降低研究的成本，适于研发单位应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为薏苡SRAP正交试验电泳结果，其中M: 100 bp分子质量标准100 bp DNAladder; 1-16:反应体系编号。
[0009]图2为90份薏苡SRAP-PCR扩增的电泳结果。
【具体实施方式】
[0010]以下为本发明的【具体实施方式】，进一步说明本发明，但本发明不仅限于此。
[0011]实施例11.薏苡种质资源
以2008年-2010年从各主要产地收集到的90份种质资源，其中福建省内收集的种质资源69份和国内其它地区(浙江、辽宁、山东、河南、云南、江苏、湖南、广东、上海)等的21份(其中台湾6份)为材料。2011-2012年分别种植于福建福州和闽清两地。
[0012]2.薏苡基因组DNA的提取
采用改良CTAB法提取薏苡基因组DNA。称取薏苡幼苗或分蘖的幼嫩叶片3g，去除叶脉，用剪刀迅速剪碎，液氮中迅速磨碎，后装入50ml离心管中，分别加入15ml 65°C预热好的CTAB抽提缓冲液和相应的抗氧化剂，每管加入不同浓度的CTAB抽提缓冲液和不同浓度的抗氧化剂，CTAB (m/M) 3%，β -巯基乙醇2%，盖上盖子摇匀；65°C温育1.5h，期间温和地摇匀3次；冷至室温,加入等体积氯仿-异戍醇，温和地颠倒混匀后静置IOmin ；8000rpm离心lOmin，吸上清于50ml离心管中，重复离心I次，然后加入2/3体积的冷冻异丙醇，混匀后_20°C过夜沉淀；8000rpm离心lOmin，倒掉上清液。沉淀用75%乙醇洗涤3次后稍微吹干；用500 μ I 65°C预热的TE溶解沉淀，_20°C保存。
[0013]3.SRAP正交实验
采用L(45)进行五因素四水平的正交试验设计，五个因素分别为:薏苡种质资源的模板DNA、Taq DNA聚合酶、SRAP弓丨物、dNTPs和Mg2+等。五因素中四个水平的设置见表1，试验设计见表2。PCR产物用7.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，并采用银染法染色。染色完成后拍照并根据扩增条带的清晰状况、清晰条带的数量、条带敏感性和特异性进行打分，背景清晰、清晰条带多的记16分，反之3分。将得分的平均值利用DPS软件中的正交方差分析进行统计分析。
[0014]
【权利要求】
1.一种优化的薏苡SRAP-PCR反应体系，其特征在于:PCR反应体系为3 mmol/L的Mg2+、2U 的 Taq 酶、0.15 mmol/L 的 dNTPs、0.30 μ mol/L 的引物和 40 ng 的模板 DNA。
2.根据权利要求1所述的薏苡SRAP-PCR反应体系，其特征在于:所述的反应体系的PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸lmin，共5个循环；然后94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;扩增产物4°C保 存。
【文档编号】C12Q1/68GK103525938SQ201310510377
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月26日 优先权日:2013年10月26日
【发明者】季彪俊, 夏法刚, 孙小芳, 程军, 徐良华, 毛大梅, 詹福杨, 邓邦柱 申请人:福建农林大学