一种重组卡介苗rBCG::Rv3425的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程和卡介苗【技术领域】，具体为一种结核杆菌的重组卡介苗。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。本发明的重组卡介苗，是将结核杆菌rv3425基因重组表达于卡介苗BCG中而构建获得，记为rBCG::Rv3425。这种新的重组卡介苗免疫小鼠后，小鼠外周血中CD4+，CD8+T淋巴细胞的比例均比BCG组明显增加，CD4+，CD8+T淋巴细胞在抗结核免疫中有重要作用。因此，重组卡介苗rBCG::Rv3425可以用于结核分枝杆菌的预防。
【专利说明】—种重组卡介苗rBCG:: Rv3425
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和卡介苗【技术领域】，具体涉及一种结核杆菌的重组卡介苗。【背景技术】
[0002]结核病是世界三大传染病之一，据WHO统计，2012年全球新发860万结核病病例，因结核病死亡人数130万。结核病已成为全球头号传染病杀手。
[0003]我国结核病疫情较严重，是全球22个结核病高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病严重流行的国家之一。2011年我国第五次全国结核病流行病学抽样调查结果分析，我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。
[0004]卡介苗(BCG)是目前唯一可用的结核病疫苗，可以有效预防粟粒型结核和结核性脑膜炎。但是其对成人保护效果有限，复种无效。在随机临床实验中，发现BCG表现出不一致的保护效果(保护效果从0%-80%浮动)。因此，研制新型结核疫苗迫在眉睫。
[0005]多种类型的新型疫苗已被广泛研究，包括重组BCG疫苗、营养缺陷型结核分枝杆菌疫苗、蛋白质多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒为载体的结核亚单位疫苗等。然而经检索，目前与本发明相似的疫苗尚未有报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种比目前市售卡介苗性能更佳的重组卡介苗。
[0007]本发明的另一个目的是提供上述重组卡介苗的制备方法。
[0008]本发明提供的重组卡介苗，是将结核杆菌器基因重组表达于卡介苗BCG中而构建获得，记为rBCG::Rv3425。
[0009]本发明的疫苗中，将来源于标准株H37Rv中完整的基因插入到穿梭质粒PMV261中，通过电转重组入BCG中实现重组表达。
[0010]本发明中，重组表达的RV3425抗原(PPE57)位于结核分枝杆菌的RDll区，NCBI中基因号NC_000962.3，蛋白号:YP_177971.1。编码该抗原的基因位于H37Rv基因组3842239...3842769之间，基因全长531bp，编码的Rv3425蛋白长度为176aa，分子量19855.1Da0该基因在BCG中缺失，可以用于结核病的血清学诊断。依据该抗原的上述性质，本发明将该抗原重组表达于BCG中，构建了重组表达Rv3425的重组卡介苗。
[0011]本发明还提供上述重组卡介苗的制备方法，具体步骤为:
(1)扩增器基因；
(2)用同样的酶双酶切器基因和穿梭质粒pMV261，将二者通过T4连接酶连接，形成质粒;
(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达；
(4)分离步骤(3)获得的重组质粒，用电击转化的方法转化BCG感受态，利用pMV261质粒上携带的卡那霉素抗性筛选重组rBCG::Rv3425阳性克隆。
[0012]本发明中，双酶切使用的酶是EcoR I和Sal I。利用报告基因GFP重组检验发现，EcoR I作为重组基因表达起始位点可以实现抗原的高效表达。
[0013] 本发明中，使用的穿梭质粒pMV261载体,还可以使用整合型质粒pMV361等。
[0014]本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
[0015]本发明中，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌等。
[0016]本发明疫苗具有下列优势:
重组表达了 BCG中缺失的抗原Rv3425，改善了 BCG缺失重要保护性抗原的缺陷。
[0017]研究发现，免疫6-8周龄C57BL/6雌性小鼠后，相对于BCG，本发明重组rBCG::Rv3425可以显著提高小鼠外周血中^4+,^8+ T淋巴细胞的比例，⑶4+，⑶8+ T淋巴细胞在抗结核免疫过程中均有重要作用。因此，该重组rBCG::Rv3425可以成为一种有效的新的重组BCG疫苗用于结核分枝杆菌感染的预防。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1.PCR验证重组rBCG::Rv3425 中重组情况。Lanel:DNA Marker。Lane2_8:从卡那霉素抗性平板上挑取的7个菌落。使用引物为PMV261质粒上的通用引物。从图中可以看出，克隆2，3，4，7均携带有重组Rv3425基因，表明Rv3425成功转化入BCG中。
[0019]图2.重组rBCG::Rv3425可以促进小鼠外周血中⑶4+ T细胞比例增加。取免疫8周后的小鼠外周血，经过红细胞裂解液处理后去除红细胞，直接进行流式抗体染色，计数⑶4+T细胞的比例。经过比较发现:免疫8周后，重组rBCG::Rv3425可以刺激外周血中⑶4+T细胞数量的增加，相对于BCG免疫组和未经免疫的PBS对照组相比均差异显著。
[0020]图3.重组rBCG::Rv3425可以促进小鼠外周血中⑶8+ T细胞比例增加。取免疫8周后的小鼠外周血，经过红细胞裂解液处理后去除红细胞，直接进行流式抗体染色，计数⑶8+ T细胞的比例。经过比较发现:免疫8周后，重组rBCG::Rv3425可以刺激外周血中⑶8+T细胞数量的增加，相对于未经免疫的PBS对照组相比差异显著。
[0021]图4.流式染色结果表明重组rBCG::Rv3425可以促进小鼠外周血中⑶4+和⑶8+T细胞比例上升，各组选取一只代表小鼠进行比较。
【具体实施方式】
[0022]本发明中未特定标注的试剂和条件均采用本领域普通技术人员熟知的常规产品和方法。
[0023]实施例1重组rBCG::Rv3425的制备
1.1结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA的制备
结核分枝杆菌(H37Rv)在7H9 Broth培养基中培养4周，80°C，2小时灭活。用细菌DNA(小量)抽提试剂盒抽提基因组DNA。因结核菌的细胞壁厚，细菌的消化时间延长至3到5小时。
[0024]1.2结核分枝杆菌H37Rv菌株器基因的扩增
根据基因及载体多克隆位点设计引物。引物设计如下: rv3425S:
5' -^gaattc ATGCATCCAATGATACCAGC-3’ EcoR I (SEQ.1D.NOl)
rv3425A:5' -kigtcgac Ctacccgcccctgtagatct-S' Sai I (seq.1d.N02)
PCR反应体系(全式金pfu试剂盒):
【权利要求】
1.一种重组卡介苗，其特征在于，是将结核杆菌器基因重组表达于卡介苗BCG中而构建获得，记为rBCG::Rv3425。
2.如权利要求1所述重组卡介苗的制备方法，其特征在于，具体步骤为: (1)扩增器基因； (2)用同样的酶双酶切器基因和穿梭质粒pMV261，将二者通过T4连接酶连接，形成质粒; (3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达； (4 )分离步骤(3 )获得的重组质粒，转化BCG感受态以获得所述重组卡介苗。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，双酶切使用的酶是EcoRI和Sal I。
4.如权利要求2所述的制 备方法，其特征在于，使用的载体是pMV261。
【文档编号】C12N1/21GK103589676SQ201310564900
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】王洪海, 徐颖, 杨恩卓, 李光华, 宋娜 申请人:复旦大学