一种改变植物花型的双35s过表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用，该载体为含有两个花椰菜花叶病毒的组成型启动子(35S)和C功能基因OsMADS58的植物表达载体，从水稻花中扩增出OsMADS58基因，用双35S启动子控制它在拟南芥中过量表达，可以改变拟南芥花器官的结构。本发明的载体可用于改变植物花型，在培育形状独特的转基因花卉方面具有很好的应用前景。
【专利说明】一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]花型是花卉作物重要的观赏性状，通过分子生物学手段鉴定出控制花发育的基因并通过改变其表达方式，可有目的地改变花型，将对花卉业产生重大影响。对模式植物拟南芥和金鱼草突变体的遗传分析和同源异形化现象的研究表明，编码转录因子的一组同源异形基因控制着花的发育。这些基因被相应地分为A，B和C类，并随之提出花器官发育的ABC基因模型。在经典的ABC模型中，认为花器官是由A，B和C三类基因共同作用的结果，以拟南芥为例，A类基因(APETALA1，AP1-APETALA2, 4--)单独决定萼片，A类基因和B类基因(APETALA3, AP3., P ISTILLATA, PI)共同决定花瓣，B类基因和C类基因(AGAMOUS, AG)共同决定雄蕊，C类基因单独决定心皮，同时，C基因还参与分生组织决定性的调控。这三类基因利用单独或重叠的基因表达区域对花发育过程进行调控，形成相应的花器官。随着研究的进展，ABC模型逐渐发展为ABCDE模型，D类基因SEEDSTICKiSTlO^yih能与C基因部分重叠，影响胚珠的发育。E基因SEPALLATA卜SEPALLATA4 {SE卟SEP4、在全局上对花瓣、雄蕊和雌蕊进行调控。通过改变同源异形基因的表达方式，按人们需要设计新的花型已成为可能。如利用转基因技术抑制基因的表达，其雄蕊被花瓣取代，心皮被新的花替代，形成重瓣花，为创造观赏价值较高的重瓣花展示了美好的前景。将矮牵牛同源异型基因FBP2与35S启动子相连，构建表达载体/--?导入烟草，导致烟草雄蕊上产生花瓣。将英国梧桐的花器官决定基因类基因)转化烟草后，花瓣的形态发生了很大变化。0sMADS58属于水稻C功能基因，通过分析0sMADS58的RNAi植株发现其雄蕊会部分转化成衆片，产生包含衆片、雄蕊`和类似心皮在内的一系列花器官反复发生。鉴于0sMADS58在花发育中的重要作用，推测通过提高该基因的表达水平可改变植物的花型。启动子在决定基因表达方面起关键作用，选择合适的启动子是增强外源基因表达首先要考虑的问题。35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的组成型启动子，相关研究表明2X35S启动子的强度要远远高于单35S。为更大限度地提高的表达水平来改变花型，利用2X35S启动子来调控0sMADS58的超量表达具有一定的实践意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用，该载体含有来自水稻C功能基因《5私似?5?基因的上游连有2 X 35S组成型启动子。所述0sMADS58的 cDNA 来源于水稻 QOryza sativa)，GenBank 登录号为 AB232157。
[0004]本发明的另一目的是将该载体应用在植物特别是花卉中改变花型。
[0005]上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为含双35S的pHB。
[0006]本发明的上述植物表达载体为pHB-2 X H0sMADS58，由下述方法构建而成:(1)根据NCBI上水稻0sMADS58的公布的序列(登录号为AB232157)，设计引物为: 上游引物:5' -GGATCCATGCACATATACAAAGAGCAGGA-3'
下游引物:5' -TCTAGATTATCTTTCATCTGACATAAAGG-3'
上游引物添加I位点，下游引物添加油al位点，以水稻第一链cDNA为模板扩增，获得0s_S58基因的全长cDNA ；
(2)回收并纯化0sMADS58全长cDNA片段，并将其连接到pMD_18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-flsii似
(3)构建植物表达载体pHB-2X 353---觀《货，使用BamHl和油a I酶切pMD18-flsii似和PHB，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得Asii似的植物表达载体pHB-2 X 激-0sMADS58。
[0007]本发明使用植物表达载体，该表达载体含有两个串联的组成型35S启动子，构建的植物表达载体中含有基因，以便在转基因植物中超量表达0sMADS58,由于该基因在水稻花发育中起作用，过量表达该基因可改变花的结构，在实践中有一定的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为本发明中0sMADS58基因扩增后的电泳示意图；
图2为本发明中质粒饱BamHl和油<31双酶切电泳检测图；
图3为本发明中质粒pHB-2 X饱BamHl和油<31双酶切电泳检测图；
图4为转基因拟南芥的PCR鉴定图；
图5为转基因拟南芥的花，其中A为野生型，B-D为不同类型的转基因的花。
【具体实施方式】
[0009]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0010]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0011] 实施例1:双35S过表达载体pHB-2 X H0sMADS58的构建
(1)引物设计:根据NCBI数据库中水稻中的基因(登录号:AB232157)序列和表达载体PHB多克隆酶切位点，设计一对特异性引物:
0sMADS58-b9:5/ -GGATCCATGCACATATACAAAGAGCAGGA-3'
0sMADS58~?>9:5/ -TCTAGATTATCTTTCATCTGACATAAAGG-3'
引物含有限制性内切酶及?# I识别位点，含有限制性内切酶油<31识别位点。
[0012](2)总RNA的提取将水稻花从植株分离后，迅速放入液氮研磨至粉状，将研磨好的材料转入eppendorf管中，加入I mL Trizol,震荡混匀，加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，12000rpm, 4°C离心IOmin,小心吸取上清，加入等体积的异丙醇，室温沉淀20min, 12000rpm,4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。将样品置于冰上，晾干后加入20 μ L DEPC水溶解沉淀，溶解的RNA置于-70°C保存备用。
[0013](3)cDNA 合成
以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA，具体步骤为:取0.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入总RNA 11 μ I (约I μ g)、01igo (dT)l μ I ;65°C处理5 min后，转至冰上5min ；向 eppendorf 管中加入 2XM-MLV 缓冲液 5 μ IUOmM dNTP I μ 1、RNase 抑制剂 I μ 1，37°C处理5min ;然后向eppendorf管中加入I μ I反转录酶；42°C处理60 min ;94°C处理5 min使反转录酶失活，获得cDNA。
[0014](4)扩增 0sMADS58 片段
以cDNA为模板、使用引物0sMADS58-b'和OsMADSSSS'进行PCR扩增0sMADS58片段，PCR 的 25 μ I 体系为:K0D 缓冲液(10X) 2.5 μ 1、KOD 0.5 μ 1、cDNA 模板 I μ 1、IOmM dNTP0.5μ1、10μΜ 0sMADS58~^ ' 引物 1μ1、10μΜ 0sMADS58~?>' 引物 I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，35 个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，68°C延伸 60s，68°C反应lOmin。PCR经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，其长度与预期大小(819bp) —致(见图1)。
[0015](5) 0sMADS58 片段的回收 对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0016](6) 0sMADS58 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14μ 1、10* Taq DNA聚合酶缓冲液 2μ l、10mM dNTP 2 μ l.Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C 处理 45 min;先加(λ 18 mL 无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀60 min, 12000rpm,4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0017](7) 0sMADS58片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到PMD18-T载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:0sMADS58 片段的 cDNA 5 μ 1、pMD18_T 载体 0.5 μ 1、10 X T4 DNA 连接酶缓冲液 I μ 1，Τ4DNA连接酶1μ 1，加无菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C连接4-6h。将100 μ I感受态肠杆菌万.co7i DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5 min;加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2 μ I, BamH I 0.5 μ I, Xba I 0.5 μ IUOXbuffer(K) I μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒可酶切出预期大小(819bp)的片段(见图2)，将酶切正确的重组质粒pMD\S~0sMDS58进行测序验证插入基因的正确性。
[0018](8)过量表达载体的构建
使用BamH I和Xba I对质粒pMD18T_flsii似和载体PHB进行双酶切，分别获得5’端带有/和3’端带有油<3 I的0sMADS58片段和PHB载体，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h ;将100 μ I感受态肠杆菌疋coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液体培养基，37°C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37°C、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pHB-2 X娜-0sMADS58,具体方法为:向
0.5 ml 的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y 1)2 μ I,BamH / 0.5 μ I,Xba I 0.5 μ 1、IOXbuffer (K)I μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒可酶切出预期大小(819bp)的片段(见图3)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证，最后获得过表达载体 pHB-2 X H0sMADS58。
[0019]实施例2 ^m-0sMADS58 转农杆菌 GV3101 (I)农杆菌感受态细胞制备
挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28°C摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28°C继续培养约6-7h至0D600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min ;5000 rpm，4°C离心5min，弃上清，将菌体悬于10 ml 0.15 M NaCl中；5000rpm, 4°C离心5min,弃上清,菌体用I ml 20 mM CaCl2,4°C )轻轻悬浮,每管200μ1分装，或加入终浓度为20%的无菌甘油，-70°C保存。
[0020](2)农杆菌的转化及鉴定
将10μ1质粒DNA加入200μ I农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻3-5min，37°C水浴 5min，加入 I ml YEB 培养基，28°C摇培 3_4h。lOOOOrpm，室温离心 30s,弃上清，加入200 μ I YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28°C培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌(DH5ci )，过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。
[0021]实施例3:含ρΗΒ-fl?紛俗姑游农杆菌GV3101转化拟南芥 (I)拟南芥的种植
①)当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24°C，光照强度80-200 μ mol/M2/S,光照周期为8 h黑暗、16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合而成。
[0022]②将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。
[0023]③将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。
[0024]④土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。
[0025]⑤种子的收集:拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。
[0026](2)拟南芥的转化和转化子的筛选
①制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0D600当在1.2到1.6之间。室温5000 rpm离心10 min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0D600在0.8左右。
[0027]②先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光 照培养。
[0028]③一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。
[0029]④转化子的筛选:种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。
[0030]⑤处理后的种子用Top agar (0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。
[0031]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒温室培养。共筛选出115株转化子，长到合适的大小后移栽到土壤中。
[0032]实施例4:转基因植株的鉴定和分析
(I)拟南芥DNA的提取
将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μ I的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，猛烈摇匀，12000rpm，离心10 min。取上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入_20°C沉淀2hr以上。随后12000 rpm,离心10min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
[0033](2)转基因拟南芥植株的鉴定
以抽提的DNA为模板、使用引物和《5私似?姑-3'进行PCR扩增片段，PCR 的 25 μ I 体系为:PCR 缓冲液(10*) 2.5 μ 1、Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、IOmMdNTP 0.5 μ 1、10 μ M 0sMADS58~^' 引物 I μ 1、10 μ M 0sMADS58~?>' 引物 I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，35个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反应lOmin。经PCR鉴定，115株转化子中108株为阳性植株(见图4)。
[0034](3)转基因拟南芥植株表型分析
通过体式镜SMZ800进行拍照，进行相关表型分析及统计。
[0035]108株阳性植株中，35株有明显的表型，根据表型的强弱，共分为A-C四类(见图5)。A类(12株，34.2%)表现为第二轮的花瓣会向雄蕊转化，第一轮的萼片不太规则:B类(7株，20%)表现为第二轮的花瓣变小，靠花柄处颜色由白色变成淡黄色，第三轮的雄蕊的花丝变短，花药不够成熟，各花器官之间排列的更紧密；C类(16株，45.8%)表现为第二轮的花瓣变小，靠花柄处颜色由白色变成淡黄色。
【权利要求】
1.一种改变植物花型的双35S过表达载体，其特征在于:植物表达载体为pHB-2 X激-0sMADS58,含有C功能基因0sMADS58, flsii似基因的上游连有双35S组成型启动子；所述基因来源于水稻，NCBI登录号为ΑΒ232157。
2.根据权利要求1所述改变植物花型的双35S过表达载体，其特征在于:植物表达载体pHB-2X35S-flsii似由下述方法构建而成: (1)根据NCBI上水稻0sMADS58的公布的序列(登录号为AB232157)，设计引物为: 上游引物:5' -GGATCCATGCACATATACAAAGAGCAGGA-3' 下游引物:5' -TCTAGATTATCTTTCATCTGACATAAAGG-3' 上游引物添加I位点，下游引物添加油al位点，以水稻第一链cDNA为模板扩增，获得0s_S58基因的全长cDNA ； (2)回收并纯化0sMADS58全长cDNA片段，并将其连接到pMD_18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-flsl似； (3)构建植物表达载体pHB-2X 353---觀《货，使用BamHl和油a I酶切pMD18-flsii似和PHB，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得Asii似的植物表达载体pHB-2 X 激-0sMADS58。
3.—种权利要求1所述改变植物花型的双35S过表达载体的应用，其特征在于:所述双35S过表达载体用在花卉中改变植物花型。
【文档编号】C12N15/66GK103710382SQ201410024489
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】胡丽芳, 贺浩华, 刘世强, 朱昌兰, 边建民, 欧阳林娟, 彭小松, 贺晓鹏, 傅军如, 陈小荣 申请人:江西农业大学