一组特异识别β-银环蛇毒素的核酸适配体及用途
【专利摘要】本发明提供了一组特异性识别β-银环蛇毒素的核酸适配体及用途。本发明提供的核酸适配体，是序列表中的SEQ?ID?NO.1～4所示的任一单链DNA序列，所述核酸适配体和β-银环蛇毒素具有较高的亲和力和特异性，在β-银环蛇毒素的检测和银环蛇咬伤的诊断中具有广泛的应用前景。
【专利说明】—组特异识别β-银环蛇毒素的核酸适配体及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物毒素【技术领域】，具体是指利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与银环蛇毒素高特异性结合的核酸适配体，为该核酸适配体在β-银环蛇毒素的检测和银环蛇咬伤的诊断中提供科学依据和理论基础。
【背景技术】
[0002]β -银环蛇毒素来源于银环蛇(Bungarus multicinctus)蛇毒中，是一种突触前多肽神经毒，表现出Ca2+依赖性磷脂酶A2 (Phospholipase A2, PLA2)活性，是银环蛇毒的最主要的毒性成分，LD50 (1.p.小鼠)为0.019 μ g/g。分子量(Mr)为20500，由两条链所构成，即A链和B链，并通过一对链间二硫键连接起来。分子量较大的A链(Mr=13500)含120个氨基酸，具有13个半胱氨酸，其一级结构十分类似于从蛇毒和哺乳动物胰腺中鉴定的PLA2,具有比较弱的活性。分子量较小的B链(Mr=7000)由60个氨基酸组成，与蛋白激酶抑制物有一些序列同源性，作为β -银环蛇毒素对特定靶向细胞膜的识别亚基，在神经-肌肉接头突触前膜中的一些成分间相互作用上有着重要功能。当亚基间二硫键断裂时，或PLA2活性中心被共价修饰时，都可导致β -银环蛇毒素的神经毒性和PLA2活性的丧失。
[0003]蛇咬伤是热带、亚热带农村地区一个影响健康的重要问题，每年仅在亚洲，由蛇咬伤致死的人数就达5万人。银环蛇咬伤在我国占各类毒蛇咬伤的8.12%，居第5位，而死亡人数居首位。目前我国还没有一种快速、有效的蛇伤临床诊断试剂和方法，蛇伤诊断主要依靠病史和临床表现。由于被不同种类的毒蛇咬伤具有相似的症状，在病史不详的情况下，临床医生很难从患者的临床表现来判断倒底是被哪种毒蛇咬伤。
[0004]在蛇毒的实验室鉴定技术中，免疫检测是其中最主要的技术手段。现有的免疫诊断技术大多是利用多克隆抗体检测毒素，由于不同蛇毒多抗之间存在交叉反应，因此特异性较差。制备单个蛇毒成分的单克隆抗体可以大大提高检测的特异性，但单抗本身也存在一些缺陷。单抗相对于多抗的亲和力要弱，对酶标板的吸附性不够好，同时在进行酶或生物素标记的操作中稳定性也较差。
[0005]核酸适配体是能够与祀分子特异性结合的寡核苷酸序列(RNA或ssDNA)。1990年，Gold和Ellington两个研究小组几乎同时建立了一种制备特异性寡核苷酸分子的技术，并把该技术定义为 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指数富集式配体系统进化)，可制备具有一定三维结构、能与靶分子通过立体构象之间的适应性互补(并非碱基配对)而高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子-适配体(aptamer)。SELEX技术的出现源于人们对核酸与蛋白相互作用研究的深入。单链核酸能通过链内某些互补碱基间的配对、静电作用、氢键作用等形成一些稳定的三维空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等。通过这些结构，单链核酸能够与蛋白质或其他分子形成具有高特异性结合力的稳定复合物。单链核酸还可以通过范德华力、氢键作用、静电作用和形状匹配等各种相互作用与靶分子产生高特异性的结合力。与抗体一样，核酸适配体与靶标结合同样具有高亲和力和特异性，因此，核酸适配体亦被称为“化学抗体”。
[0006]由于核酸适配体只是一段小的单链DNA或RNA，相对于抗体具有很多天然的优势。例如，核酸适体易于合成及能应用常规的化学方法进行修饰、长期的稳定性(如能长期维持可逆的变性和复性)、无毒性或免疫原性。从工程学的角度来看，与体内生物抗体产生过程不同，体外核酸适体的化学合成批次间的差异很小。所有这些因素都促进了核酸适配体广泛地应用于医学与生命科学等领域的研究和疾病的诊断与治疗中。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种能够与β -银环蛇毒素特异性结合的核酸适配体。
[0008]本发明的另一个目的在于提供上述核酸适配体在银环蛇毒素和银环蛇咬伤的检测中的应用。
[0009]所述特异性结合β-银环蛇毒素的适配体及其片段，选自SEQ ID Ν0.1~4所示的序列中的一个或者多个，在结构上均符合下述通式所示的结构特征，5' -AGC AGC ACA GAGGTC AGA TG - Nx-CCT ATG CGT GCT ACC GTG ΑΑ-3'(通式 I)。通式中 N 代表碱基 A、G、C、T中的任一个，Nx代表随机片段长度为40、39或51个碱基。上述序列均以单链形式存在。
[0010]SEQ ID N0.1~4所示的序列，可以进行修饰或改造，得到所述核酸适配体的衍生物。所述的修饰或改造方式选自以下方式中的一种或几种:
[0011]I)将所述核酸 适配体删除部分或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0012]2)将所述核酸适配体进行全硫化、端基封闭或PEG修饰，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0013]3)将所述核酸适配体连接或标记其它功能基团或分子，例如巯基、氨基、放射性同位素、荧光素、生物素、毒素或酶等，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0014]所述β -银环蛇毒素核酸适配体的筛选方法是将指数富集配体系统进化技术(SPSELEX筛选)应用于β -银环蛇毒素核酸适配体的筛选，所述SELEX筛选的具体步骤包括:
[0015]I)合成用于筛选β -银环蛇毒素核酸适配体的随机单链DNA文库，并设计合成相应的引物；
[0016]2)将β -银环蛇毒素包被于96孔酶标板，并与所述随机单链DNA文库孵育，分离和β -银环蛇毒素结合的DNA ；
[0017]3)将分离的DNA进行PCR扩增，扩增产物用λ核酸外切酶酶切，得到次一级单链DNA库，并用于下一轮SELEX筛选，直至获得相应的核酸适配体。
[0018]在步骤I)中，所述随机单链DNA文库的两端为20个碱基的固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N40-CCT ATG CGT GCT ACC GTGkk-3'。
[0019]在步骤I)中，所述引物为:
[0020]引物1:5'-荧光素-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3'；
[0021]引物2:5/ -磷酸基团-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3'；[0022]引物3:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3/ ；
[0023]引物4:5' -TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3/。
[0024]和现有抗体技术相比，本发明的优点在于:筛选所获得的核酸适配体相对于传统抗体，具有更简便的筛选条件，无毒性，分子量小，易于化学修饰和标记，合成成本较抗体制备低、周期短。本发明提供的核酸适配体和银环蛇毒素的结合亲和力高，Kd值达到ηΜ级，并且只特异性识别银环蛇毒素和含有银环蛇毒素的银环蛇毒，对其它同源毒素或蛇毒，如α-银环蛇毒素、金环蛇毒、五步蛇毒、蝰蛇毒、眼镜蛇毒等没有识别功能。上述优点使所述核酸适配体成为β-银环蛇毒素检测和银环蛇咬伤诊断的有力工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1.第 I 轮筛选的 pilot PCR0 1:20bp DNA ladder ;2_9:12-26 个循环的 PCR 产物。
[0026]图2.Mfold软件预测的适配体β B-1、β Β_19、β Β-32和β Β-20的二级结构。
[0027]图3.SELEX筛选每一轮单链DNA库和β -银环蛇毒素的结合率。
[0028]图4.荧光各向异性法测定适配体β Β-1、β Β-20和β -银环蛇毒素结合的解离常数Kd值。
[0029]图5.硝化纤维膜过滤法测定适配体β B-1和银环蛇毒、金环蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼镜蛇毒和蝰蛇毒的结合率。1:银环蛇毒；2:金环蛇毒；3:尖吻蝮蛇毒；4:蝰蛇毒；5:眼镜蛇毒。
[0030]图6.用适配体β B-1通过ELISA方法鉴定银环蛇毒和`β -银环蛇毒素。1.β -银环蛇毒素；2.BSA ；3.酪蛋白；4.α -银环蛇毒素；5.银环蛇毒；6.眼镜蛇毒；7.金环蛇毒；
8.尖吻蝮蛇毒；9.蝰蛇毒；10.对照。
【具体实施方式】
[0031]以下实施例用于阐述说明本发明，但不应理解为对本发明保护范围的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]实施例1特异性结合β -银环蛇毒素的核酸适配体的筛选
[0033]1.构建随机单链DNA文库及引物:设计两端为20个碱基的固定序列，中间为40个碱基随机序列的随机单链DNA文库，即:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N40-CCT ATGCGT GCT ACC GTG ΑΑ-3'。其中N代表碱基A、G、C、T中的任一个，MO代表随机片段长度为 40 个碱基。引物 1:5'-荧光素-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3'，引物 2:5' -TTCACG GTA GCA CGC ATA GG-磷酸基团-3'。文库及引物均由上海生工生物技术有限公司合成。将随机文库用结合缓冲液(20mM HEPES, pH7.4;150mM NaCl; 5mM KCl; 2mM MgCl2 ;2mMCaCl2)、引物用ddH20配制成100 μ M贮存液-20°C贮存备用。
[0034]2.SELEX筛选:将β -银环蛇毒素用碳酸盐缓冲液(CBS，pH9.6)配制成10 μ g/mL浓度，取100 μ L包被96孔板，4°C过夜。倒掉上清，加入100 μ L结合缓冲液(含lmg/mL BSA，从第5轮起封闭时用lmg/mL酪蛋白替换BSA)封闭2h。倒掉上清，用200 μ L结合缓冲液(含0.05%tween20)清洗6次。ssDNA文库(溶于结合缓冲液，含0.05%tween20)置于PCR仪中，90°C lOmin，取出后迅速置于冰上lOmin，然后置于室温lOmin。取100 μ L加入到96孔板中，室温孵育lh。ssDNA文库的浓度从第I轮的10 μ M逐渐减少到第10轮的0.03 μ Μ。倒掉上清，用200 μ L结合缓冲液(含0.05%tween20)清洗6次，然后用ddH20洗3次，最后加入IOOyL ddH20，置于95°C，10min，取出上清洗脱液，作为模板进行PCR反应。
[0035]每一轮筛选的过程中，先取少量洗脱液进行pilot PCR确定扩增的最佳循环数。PCR反应体系为:50 μ L Premix Taq solution (宝生物，大连)，4 μ L洗脱液，I μ LlO μ M引物 1，I μ LlO μ M 引物 2，44 μ L ddH20。PCR 反应条件为:94°C变性 5min ;94°C变性 0.5min，56°C退火0.5min，72°C延伸0.5min，26个循环；最后72°C延伸lOmin。从第12个循环起，每隔2个循环从PCR管中取出IOyL PCR产物。PCR完成后，将不同循环数的产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带，最佳循环数为不产生短链或长链副产物的最大循环数。确定最佳循环数后，在最佳循环数下进行PCR反应，反应体系和条件同上，共进行8管反应，总体积为800yL。PCR产物用λ核酸外切酶进行酶切，水解掉标记磷酸基团的反义链，得到标记荧光素的正义链。经乙醇沉淀纯化后，获得的ssDNA用于下一轮的SELEX筛选。
[0036]3.克隆和测序:经过10轮筛选，用不标记荧光素和磷酸基团的引物PCR扩增洗脱液，PCR产物连接到克隆载体PMD19-T，克隆送上海生工生物技术有限公司进行测序，获得4条适配体序列。结果如SEQ ID N0.1~4所示，分别命名为β B-1、β Β-19、β Β-32和βΒ-20。用Mfold软件(httD://mfold.rit.albany.edu)对适配体的二级结构进行预测，4条适配体的二级结构如图1所示。每条适配子中的茎环结构和发卡结构可能是适配体和β-银环蛇毒素的结合部位。
[0037]实施例2以消化纤维膜法测定每一轮核酸适配体库和β -银环蛇毒素的结合力
[0038]硝化纤维膜(HAWP02500nitrocellulosefilters, Millipore, 0.22 μ m)用
0.5MK0H溶液浸泡30min后，用ddH20充分清洗，然后用置于结合缓冲液中，摇动40min，置于新的结合缓冲液中，4°C保存。荧光素标记的各轮ssDNA库配制成I μ M浓度，取10 μ L加入到ImL结合缓冲液中，置于90°C lOmin，然后置于冰上lOmin，室温放置lOmin。加入Img/mL β -银环蛇毒素4 μ L，室温孵育lh，对照不加β -银环蛇毒素，然后过滤膜，用ImL结合缓冲液冲洗滤膜。合并滤液，用Perkin Elmer LS55荧光分光光度计测定滤液的荧光强度。测定参数为:上样量=2mL, excitation wavelength=492nm, emission waveIength=5I8nm,integration time=10sec, inlet and outlet slit width=10nm。对照的突光强度减去样品的荧光强度则为结合到β_银环蛇毒素上的ssDNA的荧光强度。结合的荧光强度与对照的荧光强度的比值即为每一轮核酸适配体库和β -银环蛇毒素的结合率。结果如图2所示，可以看到，随着筛选轮数的增加，适配体和银环蛇毒素的结合率逐渐增加。至第10轮时结合率不再增加，表明适配体已经高度富集，筛选结束。
[0039]实施例3以荧光各向异性法测定核酸适配体的解离常数Kd值
[0040]人工合成荧光标记的适配体βΒ-1、β Β-19、β Β-32和β Β-20,分别取4 μ L适配体(ΙμΜ)加入到2mL结合缓冲液中，测定荧光各向异性值。然后用不同浓度的β -银环蛇毒素进行滴定，测定每一个浓度下的荧光各向异性值。测定参数同实施例2。用β_银环蛇毒素的浓度做为横坐标，荧光各向异性值的增量作为纵坐标，用SigmaPlotl0.0软件做非线性回归，分析适配体的解离常数(Kd)值。
[0041]适配体βΒ-l和βΒ-20的Kd值均低于ΙΟΟηΜ，分别65.9ηΜ和83.8ηΜ，测定结果如图3所示。β Β-19的Kd值为540 ηΜ，而β Β-32的Kd值为1200ηΜ。适配体β B-1和β Β-20与β-银环蛇毒素具有更高的亲和力，显示其在β-银环蛇毒素检测中的应用价值。
[0042]实施例4以硝化纤维膜法鉴别不同蛇毒
[0043]银环蛇毒、金环蛇毒、尖吻蝮蛇毒、蝰蛇毒和眼镜蛇毒分别用结合缓冲液配制成10mg/mL浓度，12000rpm离心5min,取上清。取I μ M突光素标记的适配体β B-1或βΒ-206μ?，加入到ImL结合缓冲液中，置于90°C lOmin，然后置于冰上lOmin，室温放置IOmin0然后分别加入各种蛇毒2 μ L，室温孵育lh，对照不加蛇毒。过滤膜，并用ImL结合缓冲液冲洗滤膜。合并滤液，测定滤液的荧光强度。测定参数同实施例2。对照的荧光强度减去样品的荧光强度则为结合到各种蛇毒上的适配体的荧光强度，结合的荧光强度与对照的荧光强度的比值即为核酸适配体和各种蛇毒的结合率。测定结果如图4所示。适配体β B-1或β Β-20和银环蛇毒的结合率均大于80%，而和金环蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼镜蛇毒和蝰蛇毒的结合率均低于10%，表明适配体βΒ-l和βΒ-20只特异性的识别银环蛇毒。因此，利用SELEX技术筛选的和β-银环蛇毒素高亲和力、高特异性结合的适配体在蛇咬伤的诊断中有非常广泛的应用前景。
[0044]实施例5用ELISA方法鉴定蛇毒和相关蛋白
[0045]合成5'端标记生物素的适配体βΒ-1。银环蛇毒素、BSA、酪蛋白、α-银环蛇毒素、银环蛇毒、眼镜蛇毒、金环蛇毒、尖吻蝮蛇毒和蝰蛇毒用CBS缓冲液(ρΗ9.6)各自配制成10 μ g/mL,分别取100 μ L包被ELISA板，4°C过夜。弃上清，ELISA板用200 μ L清洗缓冲液(结合缓冲液+0.05%tween20)清洗3次，加入100 μ Llmg/mL BSA封闭，室温，2h。弃上清，ELISA板用200 μ L清洗缓冲液清洗3次，加入100 μ L生物素标记的β B-1 (浓度ΙΟρΜ，溶于结合缓冲液)，室温结合40min。弃上清，ELISA板用200 μ L清洗缓冲液清洗3次，加入100 μ L1: 1000稀释的过氧化物酶标记亲和素(用结合缓冲液稀释)，室温,40min。弃上清，ELISA板用200 μ L清洗缓冲液清洗3次，加入100 μ L新鲜配制的底物(PD溶液，室温避光反应15min，最后加入50 μ L2M H2SO4终止反应，观察每孔的颜色变化。对照包被β _银环蛇毒素，但不加入适配体。结果如图6所示。β-银环蛇毒素和银环蛇毒孔颜色为棕褐色，其中β-银环蛇毒素孔颜色更深，而其它蛋白和蛇毒孔颜色和对照基本相同，没有发生明显的颜色变化。不需要仪器判读，仅从各孔的颜色上就可以明显的从相关蛋白中鉴定出β_银环蛇毒素，从各种蛇毒中鉴定出银环蛇`毒。
[0046]
【权利要求】
1.特异性结合β-银环蛇毒素的核酸适配体，其选自SEQID Ν0.1~4所示的序列中的一个或者多个，分别命名为βΒ-1、βΒ-19、βΒ-32和βΒ_20，其序列如下:
βΒ-l:
agcagcacag aggtcagatg gttttcccct tgtcgctttt ggttcgttct gcctctatct 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa80
βΒ-19:
agcagcacag aggtcagatg tttggtgtgg atcctgaaca tttatattct ttcgtttttt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa80
βB-32:
agcagcacag aggtcagatg gcaatgcacc tttgtctctt atagtttatt ttttgccttc 60
ctatgcgtgc taccgtgaa79
βB-20:
agcagcacag aggtcagatg attagtcatg tttgtttgtc tggctttttg ggtttgtgca 60
gtattatgaa ccctatgcgt gctaccgtga a91
2.权利要求1所述适配体在β-银环蛇毒素检测中的用途。
3.权利要求1所述适配体在蛇咬伤诊断中的用途。`
4.特异性结合银环蛇毒素的核酸适配体，包括对权利要求1所述适配体删除或增加部分核苷酸，并与权利要求1所述适配体具有相同功能的适配体。
5.特异性结合银环蛇毒素的核酸适配体，包括对权利要求1所述适配体连接或标记其它功能基团或分子的适配体，并与权利要求1所述适配体具有相同功能的适配体，所述其它功能基团或分子选自:巯基、氨基、放射性同位素、荧光素、生物素、毒素或酶酶标记。
6.权利要求1所述适配体，其被能够增强其半衰期、提高其稳定性、防止核酸内切酶或者外切酶切割的化合物所修饰。
【文档编号】C12Q1/68GK103820458SQ201410116477
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】叶锋平, 郑颖, 范泉水, 王熙, 米其利, 郭平, 余静, 王杰, 张志晓, 冯子良 申请人:中国人民解放军成都军区疾病预防控制中心