小鼠成肌细胞的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开采用机械组织分离，原代培养基培养，在细胞形成40-80％丰度时加分化培养基直至肌管被诱导形成小鼠成肌细胞。采用此方法从每克小鼠肌肉中能分离到约1×108个细胞，其中成肌细胞和卫星细胞的比例达到90％以上。成肌细胞在研究肌管形成及肌肉发育细胞、分子机理方面具有重要作用。
【专利说明】小鼠成肌细胞的制备方法及其应用
发明领域:
[0001]本发明涉及成肌细胞的获得方法，更具体地说，本发明涉及小鼠成肌细胞的制备方法，以及该方法的应用。
[0002]现有技术的描述:
[0003]成肌细胞是一种胚胎祖细胞，它能够分化成为肌肉细胞。当成肌细胞融合在一起时就会形成骨骼肌纤维，因此肌纤维具有多个细胞核，每一个核起源于单个的成肌细胞。成肌细胞融合是骨骼肌特异的(例如二头肌)，而心肌和平滑肌则不是这样。那些没有分化成肌纤维的成肌细胞则去分化为卫星细胞。这些卫星细胞紧贴在肌纤维上，存在于肌纤维膜和肌内膜间。这些连接组织将肌束分成单个的肌纤维(Kuang S，Cell Stem Cell, 2008,2(1):22-31 ；Sacco A, Nature，2008，456 (7221): 502-506)。骨骼成肌细胞长期为研究者提供了一个很好的体外研究肌细胞增殖和分化的工具(Nguyen TH, BMC Cell Biol,2010,11:57)。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复(再生)是非常重要的。培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征，包括增殖，迁移，融合，肌管形成和收缩。生长于含有10%胎牛血清培养基中的肌肉细胞即使汇合了，也继续增殖；而当它们生长于含2-5%马血清的培养基中时，却发生融合并形成肌管。小鼠细胞系C2C12和C2F3是广泛用来研究成肌细胞增殖和分化的细胞系。目前的科研要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细胞。Thomas A.Rando通过几轮的“粘附一脱离”的处理，分离和富集了成肌细胞，丢弃了肌成纤维细 胞(Rando TA, J Cell Biol，1994，125 (6): 1275-1287) Joira A.Lawson 同样也使用差异粘附的步骤，分离和富集鸡的成肌细胞(Lawson MA, Cell Tissues Organs,2000,167(2-3): 130-137)。Yu Zhang报道肌成纤维细胞可以保护成肌细胞，以免发生内在的伴随有分化的凋亡(Zhang Y, Dev Growth Differ，2010，52 (8): 725-733)。
[0004]在研究中发现，采用Rando描述的方法来分离和分化新生小鼠的成肌细胞非常困难，成功率低。随着实验步骤的增加，得到的成肌细胞越来越少，过程中丢失了很多成肌细胞和卫星细胞，卫星细胞是成肌细胞分化所必需的，并且是成肌细胞的来源；少数存活下来的成肌细胞生长及其缓慢，非常容易发生凋亡。
[0005]发明技术内容:
[0006]本发明的第一个目的是提供一种小鼠成肌细胞的制备方法，采用该方法，可方便快捷地获得大量的小鼠成肌细胞，成活率高，生长旺盛，可以很好地用于分化成肌管的研究，其细胞学特征和分子表达的变化稳定。
[0007]本发明的第二个目的是提供所获取的成肌细胞在研究肌管形成及肌肉发育细胞、分子机理方面的应用。
[0008]本发明公开了一种小鼠成肌细胞的制备方法，该方法包括下列步骤:
[0009]A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1:2加入分散剂，在37°C颠倒摇动5-10min, 1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片；
[0010]B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂，在37°C上下颠倒摇动5-10min成浆糊状，按体积比1:10加入血清以终止酶消化；[0011 ] C)过滤80 μ m无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm离心5min,去上清，
得沉淀；
[0012]D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在37°C，5%C02的培养箱中培养；
[0013]E)当成肌细胞生长到40-80%丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成；
[0014]其中，分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶，余量为PBS，pH=7.5-7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和链霉素，2.5-5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成；分化培养基由94-97%DMEM，2-5%马血清，1%青霉素与链霉素组成。
[0015]本发明还公开了一种优选的制备方法，该方法包括下列步骤:
[0016]A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿肌肉按体积比1:2加入分散剂，在37°C颠倒摇动IOmin, 1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片；
[0017]B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂，在37°C上下颠倒摇动IOmin成浆糊状，按体积比1:10加入血清以终止酶消化；
[0018]C)过滤80 μ m无菌尼龙网，去除大的组织碎片滤液1000rpm离心5min,去上清；
[0019]D)沉淀置胶原 蛋白包被的培养皿中，并加原代成肌细胞生长培养基，在37°C，5%C02的培养箱中培养；
[0020]E)当成肌细胞生长到80%丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成；
[0021]其中，分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶，余量为PBS，pH=7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和链霉素，和5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成；分化培养基为100%马血清。
[0022]本发明所公开的方法适用于从正常野生型小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠中分离和分化成肌细胞。
[0023]本发明还公开了小鼠成肌细胞的制备方法在MAMLl转基因小鼠腿部成肌细胞分化成肌管方面的应用。
[0024]本发明中所使用的新生小鼠为出生2天以内的小鼠。从I克小鼠肌肉中大约能够分离到I X IO8个成肌细胞或卫星细胞。本发明中所使用的bFGF，其浓度不能低于2.5ng/mL。在15mL离心管中使用胶原酶和分散酶消化肌肉碎片时应严密封好管口，防治液体漏出。
[0025]细胞丰度超过80%后，成肌细胞分化能力减弱，丰度超过95%后，细胞基本上不能形成肌管。细胞丰度低于40%时，细胞数量偏少，也不利于分化。
[0026]分化培养基中不能使用胎牛血清、小牛血清和牛血清，它们都不能很好地诱导成肌细胞的分化。
[0027]分化所使用的马血清浓度不能低于2%，否则成肌细胞生长不好，甚至会发生凋亡。其浓度也不能高于5%，否则诱导肌管形成的能力降低。
[0028]马血清能够诱导成肌细胞分化并形成肌管。实验中发现圆而小的卫星细胞对新生小鼠成肌细胞分化和形成肌管是必需的，如图3，4和5所示。如果没有卫星细胞，成肌细胞将继续增殖并转化为成纤维细胞，它们不会分化和形成肌管。在正确的条件下，几乎90%培养的成肌细胞能够分化并形成肌管如图5所示。如图4所示，在将生长培养基换成含有2-5%马血清的分化培养基一天后，野生型小鼠成肌细胞在培养皿中只形成几个小的肌管，但是MAMLl转基因小鼠的成肌细胞却能形成更多的肌管。两天后，有MAMLl转基因成肌细胞形成的肌管变得更长和更粗壮了。三天后，其中有些肌管延伸得特别长。四天后，由野生型成肌细胞形成的肌管开始萎缩降解，那些由MAMLl转基因成肌细胞形成的肌管也开始萎缩，但是较为温和，并且它们能够持续维持存在超过五天，然后才降解。
[0029]在Rando (1994)的实验方案中，他们将小鼠组织碎片经过几次传代，以除去快速贴壁的成纤维细胞，而富集缓慢贴壁的成肌细胞。他们从培养皿的侧边很强地敲击桌角，以脱落成肌细胞，而成纤维细胞仍然粘贴在平皿上。但采用这个方法后，收获到越来越少的细胞。虽然这些类似成肌细胞的短而小的细胞能够存活2周，最后都发生凋亡了，不会象Rando所描述的那样形成克隆。我们在改变了胎牛血清从10%到20%，CO2从5%到10%，或bFGF从lng/ml到10ng/ml的浓度，改变了传代方式_从敲桌角到酶消化，改变了平皿包被蛋白-从胶原蛋白到层粘蛋白之后，这种成肌类似细胞仍然最终凋亡了。
[0030]通过本发明技术可以得到较纯的小鼠成肌细胞，包括大量的能够发育成为成肌细胞的卫星细胞，呈现为圆球形；以及大量的成肌细胞，呈现为短梭形。肌球蛋白Myosin和MyoD是成肌细胞区别于成纤维细胞特征性表达的蛋白，我们以此来鉴定成肌细胞，如图1和图6所示。在图1中，发绿色荧光的细胞是高表达MyoD蛋白的小鼠成肌细胞及卫星细胞，成肌细胞的祖先细胞。实验中使用抗鼠MyoD的一抗及FITC标记的二抗。在图6中，将来自野生型WT和MAMLl转基因型TG小鼠的成肌细胞诱导分化三天，然后收集成肌细胞和肌管，制备总蛋白，并用Western blot和抗体进行肌球蛋白检测，Internal loading是选定的内参。
[0031]在本发明中，分散剂配制方法是:称量0.2克胶原酶和0.05克分散酶，充分溶解于100毫升磷酸缓冲液PBS中，使用无菌滤膜过滤，滤液保存在4°C。
[0032]在本发明中，原代成肌细胞生长培养基的配制方法是:在80毫升的FlO培养基中加入I毫升的青霉素与链霉素的混合液，再加入称量和稀释的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，终浓度达到5.0ng/mL，加入19-20毫升的胎牛血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在
4。。。
[0033]在本发明中，分化培养基的配制方法是:将94毫升的DMEM培养基与I毫升的青霉素和链霉素混合液混匀，加入5毫升的马血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在4°C。
[0034]除非特别定义，本发明中所使用的术语和简写具有通常的意义。例如，“mm”指毫米，“min”指分钟，“mL”指毫升，“ V ”指摄氏度，“ng”指纳克，“F10培养基”指Ham’ sF-1ONutrient Medium,“DMEM，，指 Dulbecco，s Modified Eagle Medium,“rpm”指转 / 分钟。
[0035]本发明与现有技术相比，有如下优点:
[0036]1.能够分离到较多、较纯的小鼠成肌细胞和卫星细胞。从每克小鼠肌肉中能分离到约IXlO8个细胞，其中成肌细胞和卫星细胞的比例达到90%以上。
[0037]2.分离到的细胞生长旺盛 ，能够在马血清的诱导下分化形成大量典型的肌管，数量是其它方法形成肌管的10倍以上。
[0038]3.操作更加简单，时间更短，细胞质量更好。成肌细胞的分离与获取只需要1.5-2小时，只需要使用常规仪器设备，90%以上培养的细胞能够分化形成肌管。[0039]4.在成肌细胞分离和分化过程中能够检测到特征蛋白的表达变化，符合文献报道。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是成肌细胞中特征蛋白MyoD的表达情况图。
[0041]图2是MAMLl基因在转基因小鼠中的表达图。
[0042]图3是几次传代后成肌细胞的分化成肌管的图。
[0043]图4是二次传代后成肌细胞分化和肌管形成图。
[0044]图5是不传代直接将成肌细胞进行分化的图。
[0045]图6是肌球蛋白在分化的成肌细胞中表达图。
【具体实施方式】
[0046]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0047]实施例1.试剂配方和配制方法:
[0048]分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶，余量为PBS，pH=7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和链霉素，5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成；分化培养基由94%DMEM，5%马血清，也可采用100%马血清作分化培养基。FlO和DMEM都是商品化的培养基，研究者可从市场购买。
[0049]分散剂配制方法是:称量0.2克胶原酶和0.05克分散酶，充分溶解于100毫升磷酸缓冲液PBS中，使用无菌滤膜过滤，滤液保存在4°C。
[0050]原代成肌细胞生长培养基的配制方法是:在80毫升的FlO培养基中加入I毫升的青霉素与链霉素的混合液，再加入称量和稀释的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，终浓度达到2.5-5.0ng/mL，加入19-20毫升的胎牛血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在4°C。
[0051]分化培养基的配制方法是:将94毫升的DMEM培养基与I毫升的青霉素和链霉素混合液混匀，加入5毫升的马血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在4°C ;或直接采用100%马血清作分化培养基。
[0052]本发明中所使用的bFGF,其浓度不能低于2.5ng/mL。
[0053] 实施例2.小鼠成肌细胞的分离:
[0054]在冰上将出生2天以内小鼠新鲜的四肢肌肉剪碎。肌肉碎片转移进无菌的1.5mLEppendorf管中，加入0.5mL0.2%胶原酶collagenase与0.05%分散酶dispase混合液，继续剪碎几分钟。在37°C上下颠倒摇动5-10min，1000rpm离心5分钟，去上清。组织碎片转入加有2mL collagenase/dispase混合液的15mL离心管中，封口。在37°C上下颠倒摇动10-20min。组织碎片消化成浆糊状。转入15mL离心管中，使用微量进样器吸取组织碎片朝管壁吹打几次，以破碎团块。在37°C再次上下颠倒摇动5-10min。将上清液转移入15mL管中，加入ImL血清以终止酶的消化。将组织碎片过滤80 μ m无菌尼龙网，以除去大的组织碎片。再次转移至另一个15mL管中，1000rpm离心5min,除去上清,使用2-4mL FlO原代成肌细胞生长培养基重悬沉淀，将分离到的细胞放置于35-60mm胶原蛋白包被的培养皿中，于37°C，5%C02的培养箱中培养。[0055]本发明中所使用的新生小鼠为出生2天以内的小鼠。从I克小鼠肌肉中大约能够分离到I X IO8个成肌细胞或卫星细胞。本发明中所使用的bFGF，其浓度不能低于2.5ng/mL。在15mL离心管中使用胶原酶和分散酶消化肌肉碎片时应严密封好管口，防治液体漏出。
[0056]通过本发明技术可以得到较纯的小鼠成肌细胞，包括大量的能够发育成为成肌细胞的卫星细胞-显微镜下呈现为圆球形细胞，以及大量的成肌细胞-显微镜下呈现为短梭形。肌球蛋白Myosin和MyoD是成肌细胞区别于成纤维细胞特征性表达的蛋白，我们以此来鉴定成肌细胞，如图1和图6所示。在图1中，发绿色荧光的细胞是高表达MyoD蛋白的小鼠成肌细胞及卫星细胞一成肌细胞的祖先细胞。实验中使用抗鼠MyoD的一抗及FITC标记的二抗。在图6中，将来自野生型-WT和MAMLl转基因型-TG小鼠的成肌细胞诱导分化三天，然后收集成肌细胞和肌管，制备总蛋白，并用Western blot和抗体进行肌球蛋白检测，Internal loading是选定的内参。
[0057]实施例3.小鼠成肌细胞的维持和保存:
[0058]分离到的小鼠成肌细胞可以直接加90%胎牛血清和10%二甲基亚砜DMSO组成的细胞冻存液冻存细胞在液氮中，也可以直接进行肌管分化。待成肌细胞丰度达到70%时进行诱导分化。
[0059]细胞丰度超过80%后，成肌细胞分化能力减弱，丰度超过95%后，细胞基本上不能形成肌管。细胞丰度低于40%时，细胞数量偏少，也不利于分化。
[0060]实施例4小鼠成肌细胞的分化: [0061]4.1当成肌细胞生长到40%丰度时，将生长培养基换成由95-98%DMEM，2-5%马血清，1%青霉素和链霉素组成的分化培养基。每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成。一般，诱导分化24小时后就有小的肌管形成，大约90%以上培养的细胞能够分化成肌管。
[0062]4.2当成肌细胞生长到80%丰度时，将生长培养基换成100%马血清组成的分化培养基。每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成。一般，诱导分化24小时后就有小的肌管形成，大约90%以上培养的细胞能够分化成肌管。
[0063]马血清能够诱导成肌细胞分化并形成肌管。实验中发现圆而小的卫星细胞对新生小鼠成肌细胞分化和形成肌管是必需的，如图3，4和5所示。如果没有卫星细胞，成肌细胞将继续增殖并转化为成纤维细胞，它们不会分化和形成肌管。在正确的条件下，几乎90%培养的成肌细胞能够分化并形成肌管如图5所示。如图4所示，在将生长培养基换成含有2-5%马血清的分化培养基一天后，野生型小鼠成肌细胞在培养皿中只形成几个小的肌管，但是MAMLl转基因小鼠的成肌细胞却能形成更多的肌管。两天后，有MAMLl转基因成肌细胞形成的肌管变得更长和更粗壮了。三天后，其中有些肌管延伸得特别长。四天后，由野生型成肌细胞形成的肌管开始萎缩降解，那些由MAMLl转基因成肌细胞形成的肌管也开始萎缩，但是较为温和，并且它们能够持续维持存在超过五天，然后才降解。
[0064]成肌细胞的分化对肌肉的形成是非常重要的。虽然已有文献报道分离，培养和分化小鼠和鸡的成肌细胞，但是其中的方法很难遵循，不能获得我们所想要的理想实验结果。如果只有几个成肌细胞，即使它们在含有2-5%马血清的分化培养基中也不会形成肌管。成肌细胞增殖非常快，可以很高丰度存在，但这阻碍了成肌细胞形成肌管。特别是，在经过几轮传代和长时间培养后，成肌细胞会丧失在体外形成肌管的能力。成纤维细胞对成肌细胞分化是有帮助的，而卫星细胞可以转变为分化能力很好的成肌细胞。
[0065]实施例5MAML1转基因小鼠腿部肌肉成肌细胞经马血清诱导形成肌管
[0066]5.1实验动物，抗体和其它试剂
[0067]野生型和MAMLl转基因的C57BL/6小鼠系由本研究室饲养。抗肌动蛋白(β-actin)抗体、抗肌球蛋白(Myosin)抗体和马血清购自Sigma公司。FlO培养基、bFGF、蛋白酶K和RNase H购自Invitrogen公司。DMEM购自Cellgro公司，而胎牛血清,青霉素和链霉素购自HyClone公司，胶原酶(collagenase)、分散酶(dispase)和层粘蛋白(Iaminin)购自Gibco公司，胶原(collagen)购自Upstate公司。
[0068]5.2基因鉴定
[0069]剪取0.5cm的4周龄或新生的野生型或MAMLl转基因小鼠尾巴，放入含有0.3mLDNA 消化缓冲液(50mM Tris-HCl ρΗ8.0, IOOmM EDTA ρΗ8.0, IOOmM NaCl 和 1%SDS)和 2 μ L蛋白酶K (20mg/mL,终浓度为0.5mg/mL)的Eppendorf管中，用封口膜封住，在50_55°C孵育过夜。然后在细胞裂解物中加入1.5μ L RNase H (0.5mg/mL，不含有DNA酶)，上下颠倒离心管5次，高速离心几秒，然后放在37°C孵育15-60min。采用常规的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)方法提取基因组DNA，测量DNA浓度后使用PCR来鉴定MAMLl基因的表达。小鼠Maml I基因的PCR上游引物序列为5 ’ GCCACTCCCGCCACCAAA AAC3 ’，下游引物序列为5’ TTTCCGACCTCATTCTTTACA3’。人MAMLl基因的PCR上游引物(外显子2)序列为5’CGAGCAGAACTCCCTGTTTC3’，下游引物(外显子 4)序列为 5’ CCC TGT GAA CTG TCC AACCT3’。基因型鉴定PCR循环是:I个循环(96°C lmin,62°C lmin,72°C 45sec)加35个循环(94°C 50sec,62°C lmin，72°C 45sec) ;72°C延长5min，终产物放置室温。扩增条带大小为MAMLl，415bp ;Mamll，534bp。
[0070]如图2所不，Mamll表不小鼠mastermind-likel基因，MAMLl表不人类mastermind-likel基因，-表示阴性对照，+表示阳性对照，M是一个IOObp DNA marker。人类MAMLl基因插入了转基因小鼠1，2，4，5和6的基因组中，相应的PCR产物大小为415bp。内源性的小鼠MamlI基因的PCR产物大小为534bp。小鼠3是个野生型，没有插入人类MAMLl基因。人类MAMLl基因的mRNA序列有95%和小鼠的Mamll基因同源。
[0071]5.3分离和培养新生小鼠成肌细胞
[0072]将新生小鼠进行CO2和乙醇处理，去头，剪取尾巴用于基因型鉴定。使用无菌的剪刀取下四肢，放入冰冻的HBBS或PBS缓冲液中。用无菌的镊子将肌肉与皮肤和骨骼分离，更换一次HBBS或PBS缓冲液。在冰上将肌肉剪碎。肌肉碎片转移进无菌的1.5mL Eppendorf管中，加入0.5mL0.2%colIagenase与0.05%dispase混合液，继续剪碎几分钟。在37。。上下颠倒摇动5min进行酶的消化，1000rpm离心5分钟,去上清。组织碎片转入加有2mLcollagenase/dispase混合液的15mL离心管中，封口。在37°C上下颠倒摇动10_20min。组织碎片消化成浆糊状后使用微量进样器吸取组织碎片朝管壁吹打几次，以破碎团块。在37°C再次上下颠倒摇动5- 10min。将上清液转移入15mL管中，加入ImL血清以终止酶的消化。将组织碎片过滤无菌的SOym尼龙网，以除去大的组织碎片。再次将滤液(含细胞)转移至另一个15mL管中，1000rpm离心5min。除去上清，使用2_4mL FlO原代成肌细胞生长培养基重悬沉淀，将成肌细胞接种于直径35-60mm，胶原蛋白包被的培养皿中，于37°C，5%C02的培养箱中培养。
[0073]5.4成肌细胞分化
[0074]当成肌细胞生长到80%丰度时，将生长培养基换成由95_98%DMEM，2-5%马血清，1%青霉素和链霉素组成的分化培养基。每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成。
[0075]分离小鼠骨骼肌成肌细胞并传代超过5次后，在2%马血清中将其诱导分化三天，那么结果如图3所示，只能形成少量的肌管，图中标尺线表示40微米。
[0076]如果将野生型(WT)和MAMLl转基因型(TG)成肌细胞两次传代(少于4次)后，将生长培养基换成分化培养基后诱导成肌细胞分化五天，结果如图4所示，会形成更多的肌管，图中标尺线表示40微米。
[0077]如果从新生小鼠分离和培养骨骼肌成肌细胞后，直接将细胞在2%马血清中诱导分化三天而不传代，几乎每一个成肌细胞和卫星细胞都可以分化并形成肌管，并且所形成的肌管的数量是前面两种方法的10倍以上，结果如图5所示。WT表示野生型，TG表示MAMLl转基因型，图中标尺线表示40微米。[0078]5.5Western blot
[0079]分化后，使用裂解液(20mMTris-Cl，150mM NaCl，10%Glycerol，1%NP_40，0.4%NaF，IOOmM Na3V04，10 μ g/mL pepstatin，10 μ g/mL leupeptin，10 μ g/mL aprotinin，pH7.4)在冰上将成肌细胞进行裂解30min。10，OOOrpm离心10min。50 μ g总蛋白用于SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至polyvinylidene difluoride (PVDF)膜上，使用抗肌球蛋白抗体反应，并用Pierce ECL反应底物显色发光，冲洗X光照片。
[0080]肌球蛋白是肌肉发生的一个标志物。如果将来自野生型(WT)和MAMLl转基因型(TG)小鼠的成肌细胞诱导分化三天，然后收集成肌细胞和肌管，制备总蛋白，并用Westernblot和抗体进行肌球蛋白检测，结果如图6所示。在由野生型和MAMLl转基因小鼠分离的成肌细胞形成的肌管中，MAMLl转基因成肌细胞会表达更多的肌球蛋白。在第一天的肌球蛋白表达量是最多的，之后，蛋白表达量开始下降。这些结果也与表达MAMLl的C2C12细胞系得到的结果一致(Shen H，Genes Dev，2006，20 (6):675-688)。
[0081]上述应用实例结果显示，本发明所得到的小鼠成肌细胞可以形成很好的肌管，达到肌肉细胞发育研究和筛选药物的要求。
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【权利要求】
1.一种小鼠成肌细胞的制备方法，该方法包括下列步骤: A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1:2加入分散剂，在37°C颠倒摇动5-10min, 1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片； B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂，在37°C上下颠倒摇动5-10min成浆糊状，按体积比1:10加入血清以终止酶消化； C)过滤80μ m无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm离心5min,去上清,得沉淀； D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在37°C，5%C02的培养箱中培养； E)当成肌细胞生长到40-80%丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成； 其中，分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶，余量为PBS，pH=7.5-7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和链霉素，2.5-5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成；分化培养基由94-97%DMEM，2-5%马血清，1%青霉素与链霉素组成。
2.根据权利要求1中的获得方法，该方法包括下列步骤: A )将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1: 2加入分散剂，在3 7 °C颠倒摇动5-10min, 1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片； B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂，在37°C上下颠倒摇动5-10min成浆糊状，按体积比1:10加入血清以终止酶消化； C)过滤80μ m无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm离心5min,去上清,得沉淀； D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在37°C，5%C02的培养箱中培养； E)当成肌细胞生长到80%丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成； 其中，分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶，余量为PBS，pH=7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和链霉素，和5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成；分化培养基 100%马血清。 3)权利要求1或2制备的成肌细胞在研究肌管形成及肌肉发育细胞、分子机理方面的应用。
【文档编号】C12N5/073GK103881966SQ201410157261
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】刘文斌, 张晓东, 杜润蕾, 陈艳 申请人:武汉大学