核酸检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸检测方法，包括以下步骤：确定待测目标序列及其待测靶序列；根据目标序列设计合成锁式探针；制备滚环扩增引物；制备交联探针；进行连接反应，以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；滚环扩增完成后，用交联探针检测滚环扩增产物，若荧光信号显著增强，说明含有目标靶序列。在待测目标存在的条件，锁式探针+滚环扩增反应扩增出可被交联探针技术检测的DNA，如果不存在待测目标，交联探针技术检测不到长链产物。滚环扩增可将一个单位的待测序列扩增得到成百上千单位的重复序列，交联探针检测技术又可以从1个单位的重复序列出发得到成百上千倍的信号扩增，本发明的方法灵敏性大大增强。
【专利说明】核酸检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸分析检测方法，具体涉及一种可在恒温条件下利用多种酶检测核酸序列的方法。
【背景技术】
[0002]核酸序列检测在现代生物学和医学中占有的极其重要的地位，这一领域自上世纪90年代以来呈几何级数快速增长，并且极可能在以后的几十年里持续发展。例如，在病人的组织样本中检测致病细菌或病毒，以及在特定癌变相关基因序列，对疾病的诊断、治疗和康复提供信息和决策依据。
[0003]有研究表明，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)和短基因片段的插入/缺失与癌症的发病及药物代谢相关。另有研究表明，某些RNA在肿瘤发展的过程中起到关键作用。人类微小RNA(HiiciX)RNA, miRNA)基因通常位于癌症相关的基因附近,某些miRNA在癌症病人样本中的表达比在正常组织中要少。比如，miRNA的异常表达可见于慢性淋巴细胞白血病、大肠癌、伯基特淋巴瘤、肺癌、大细胞淋巴瘤、恶性胶质瘤和B细胞淋巴瘤等癌变组织细胞中。因此，为了理解miRNA的表达模式，研究人员需要分析miRNA的有力工具。而对未纯化、未富集的细胞、生物液体甚至活组织中的核酸序列进行检测的实验需求对检测技术的发展不断提出新的挑战，但这些需求也促进了 DNA/RNA检测技术的不断发展。
[0004]聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)可用于将少数拷贝的祀基因在较短时间内指数扩增到可以检测的浓度，但由于在PCR循环中需要加热以熔化DNA双链，这就使得PCR不适用于那些需要在活细胞中进行核酸检测的场合。即使是体外核酸检测应用，对热循环仪和熟练掌握PCR的技术人员的需求可能会使得资源贫乏的基层单位对核酸检测望而却步。
[0005]所以通过非PCR或者非连接酶链反应(ligase chain reaction, LCR)进行核酸检测成为近十年来热门的研究领域。恒温核酸扩增检测技术，尤其是那些可以在细胞存活温度(30°C~37°C )下运行的技术手段，有助于了解活细胞中基因的瞬时表达。
[0006]滚环扩增(rollingcircle amplification, RCA)是 20 世纪 90 年代报道的一种恒温核酸扩增检测技术。在该技术中，DNA聚合酶利用环形模板，扩增出含大量重复片段的长链核酸产物。RCA与锁式探针(padlock probe)耦合可以用来实现目标核酸序列的检测。锁式探针是一段较长的单链核苷酸序列，在3’和5’端分别有一段与靶标核酸序列互补配对，与目标核酸杂交后连接酶(Iigase)可以将探针磷酸化的5’端与3’端连接，从而环化锁式探针，为RCA提供环形模板。之后DNA聚合酶在有引物存在的情况下即可开始扩增，扩增的产物可以通过各式各样的方法被检测。滚环扩增是恒温扩增DNA或RNA靶序列的有效手段，但扩增是线性的，其敏感性还有待进一步提高。
[0007]关于滚环扩增检测核酸的方法，中国专利文献CN 102827929 A (申请号201210271932.0)公开了一种核酸检测方法，先根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物，将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；滚环扩增完成后，以滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。上述核酸检测方法步骤较为繁琐，需要在操作中加热反应体系，而且对磁珠富集的产物进行肉眼观察，检测结果受主观影响较大，重复性难以保证。
[0008]最近,利用核酸酶(切口酶、限制性内切酶或外切酶)进行DNA或者RNA恒温检测的方法日益增多，涌现出一大批对核酸特异性检测的新技术。交联探针(junctionprobe, JP)是一个新型恒温检测平台，它主要利用的是限制性内切酶(restrictionendonuleases, REAses)和有限互补的一对探针。在不存在检测模板的情况下，因为这对探针互补碱基对数目少，相互间的亲和力较弱，在溶液中主要以单链形式存在。但在检测目标存在时，这一对探针可以与其杂交结合形成“Y”型结构，此时限制性内切酶可以对该结构进行切割，然后荧光信号被释放。JP技术成本较低，操作简便，检测时间短，但是，检测一个序列就要准备一对根据该序列设计的修饰探针，给利用其技术平台大规模开发多品种检测试剂带来了障碍。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供一种可在恒温条件下利用多种酶检测核酸序列的方法。
[0010]实现本发明目的的第一种技术方案是一种核酸检测方法，包括以下步骤:
①确定待测目标序列及其待测靶序列。
[0011]②根据目标序列设计合成锁式探针。
[0012]③制备滚环扩增引物。
[0013]④制备交联探针。
[0014]⑤进行连接反应，将待测目标序列与锁式探针，缓冲液组成的混合液被加热到85~95°C后冷却到室温，然后加入连接酶，与连接酶混合后在20~37°C孵育0.5~4小时，加热使连接酶变性失活。
[0015]⑥以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增。
[0016]⑦滚环扩增完成后，用交联探针检测滚环扩增产物，检测时，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。
[0017]上述步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10~15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10~15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18~25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22~24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。
[0018]上述步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。
[0019]上述步骤④的交联探针包括探针A和探针B。[0020]其中探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8~12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8~12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3’末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧。
[0021]探针B由三部分组成，其3’端一段12~15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12~15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。
[0022]实现本发明目的的第而种技术方案是一种核酸检测方法，包括以下步骤:
①确定待测目标序列及其待测靶序列。
[0023]②根据目标序列设计合成锁式探针。
[0024]③制备滚环扩增引物。
[0025]④制备交联探针。 [0026]⑤将含有锁式探针、滚环扩增引物、交联探针A、交联探针B、缓冲液、连接酶、聚合酶、核酸酶与待测片段的混合液在20°C~37 °C孵育4~21小时后监测荧光信号值，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。
[0027]上述步骤⑤中所述的缓冲液提供连接酶、聚合酶和核酸酶同时发挥活性的环境；连接酶连接DNA链3’端羟基和5’磷酸基团为磷酸二酯键，聚合酶以环状DNA为模板延伸引物，复制核酸序列，核酸酶为识别位点是特定序列双链DNA的内切酶。
[0028]上述步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10~15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10~15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18~25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22~24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。
[0029]上述步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。
[0030]上述步骤④的交联探针包括探针A和探针B。
[0031]探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8~12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8~12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3’末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧；
探针B由三部分组成，其3’端一段12~15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12~15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。
本发明具有积极的效果:(I)本发明的核酸检测方法首先通过锁式探针+滚环扩增在靶序列存在的情况下实现对其片段的扩增，然后利用交联探针技术检测经扩增片段的特定序列，将滚环扩增与交联探针检测技术相结合，同时发挥两种技术的优点，为核酸检测提供了一种高敏感、操作便捷、检测时间短的平台，检测成本较低，可以在更广的范围内得到推广。
[0032]在待测目标存在的条件，锁式探针+滚环扩增反应扩增出可被交联探针技术检测的含大量重复片段线型长链DNA，如果不存在待测目标，锁式探针不能被环化，交联探针技术检测不到长链产物。理论上，滚环扩增可将一个单位的待测序列扩增得到成百上千单位的重复序列，交联探针检测技术又可以从I个单位的重复序列出发得到成百上千倍的信号扩增，最后扩增的结果是两次扩增倍数的乘积。所以，本发明的方法比单独使用其中一种方法要灵敏得多。
[0033](2)本发明的核酸检测方法先确定待测DNA片段的目标序列，设计并制备对应的锁式探针，利用锁式探针和通用引物进行滚环扩增，扩增产物可以在核酸酶和通用交联探针存在的情况下，以荧光信号增强的形式被检测，全部实验可都在一个温度下进行，这样就实现了恒温核酸扩增检测。
[0034]长久以来，PCR—直是分子诊断中应用得最广泛的技术，但是需要进行热循环反复升降温。本发明的反应全程可在一个温度(例如37°C)下进行，不需要聚合酶链式反应中热循环，因此可被应用于活组织核酸检测。
[0035](3)本发明的核酸检测方法除待测样品以外的反应体系可集中到一起，可在单管中检测待测样品，检测操作简单。
[0036](4)本发明在制备交联探针时可以使用通用设计，即不同的靶序列可以利用相同的交联探针。交联探针是修饰探针，合成修饰探针的价格较为昂贵，但是使用通用设计可以大规模的合成修饰探针以降低成本，不同的靶序列的检测只需要针对其设计不同的锁式探针即可，而锁式探针无需修饰，价格便宜得多。因此本发明的检测方法成本低，为产业化生产提供了有利条件。此外，滚环扩增引物也可以使用通用设计。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为本发明的核酸检测方法的原理图；其中图1 (a)为锁式探针-滚环扩增步骤原理图，锁式探针在模板存在的条件下被连接酶连接成为环形DNA，聚合酶在引物与环形DNA杂交后延长扩增，其产物可被交联探针检测；图1 (b)为交联探针检测原理图，一对交联探针与待测序列杂交形成的” Y”型三聚体可以被限制性内切酶切割，切割产物不稳定，三聚体形态分离，新的探针可再次参与形成三聚体，每一次循环中荧光信号不断增强，从而达到信号扩增的目的。
[0038]图2为实施例1不同浓度的靶序列的荧光信号值检测结果。
[0039]图3为实施例2不同浓度的靶序列的荧光信号值检测结果。
[0040]图4为应用例I的荧光信号值检测结果。
[0041]图5为应用例2的荧光信号值检测结果。
[0042]图6为应用例3的荧光信号值检测结果。
[0043]图7为序列的标记示意图，其中图7 (a)为实施例1的锁式探针的5’末端被磷酸化的示意图；图7 (b)为实施例1的交联探针A的标记示意图；图7 (c)为实施例1的交联探针B的酶切位的磷酸二酯键被单硫代磷酸酯键取代示意图；图7 (d)为应用例I的锁式探针的5’末端被磷酸化的示意图；图7 Ce)为应用例I的交联探针A的标记示意图；图7 (f)为应用例I的交联探针B的酶切位的磷酸二酯键被单硫代磷酸酯键取代示意图；图7(g)为应用例2的锁式探针的5’末端被磷酸化的示意图；图7 (h)为应用例3的锁式探针的5’末端被磷酸化的示意图。
【具体实施方式】
[0044]以下结合实施例，对本发明的【具体实施方式】详述如下:
(实施例1)
本实施例的核酸检测方法包括以下步骤:
①确定待测目标序列。目标序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸，目标序列可以是RNA、cDNA、基因组DNA、来自致病微生物或病毒的DNA或者经化学试剂、各种酶类以及物理暴露处理过的DNA。目标序 列可以以单链DNA或RNA的形式存在，也可以以解离的互补链的形式存在。
[0045]本例中的目标序列是长度为40个核苷酸的合成DNA单链(DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 1)，其中，5’和3’端各有5个T碱基，中间是30个碱基核苷酸的待测靶序列，可以与锁式探针杂交。
[0046]②根据目标序列设计合成锁式探针。
[0047]锁式探针的设计原则是:见图7 (a)，5’末端被磷酸化的锁式探针在这端有一段10~15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10~15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，锁式探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度为20个碱基；“引物杂交”区域可以设计成通用序列，检测不同靶序列时无需更改；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22~24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。
[0048]本实施例的锁式探针5’末端有一段15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，探针3’端有一段15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，“信号产生”区域包括23个碱基。本实施例的锁式探针的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 2。本实施例的锁式探针的“引物杂交”区域的序列可以作为通用序列使用。
[0049]③制备滚环扩增引物。滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补，本实施例的滚环扩增引物的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 3。将本实施例的滚环扩增引物作为通用引物。
[0050]④制备交联探针。一对交联探针用于检测滚环扩增产物，其设计原则是，一对交联探针分别为探针A和探针B。
[0051]探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8~12 (本实施例中为11)个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的11个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段(本实施例中为7个碱基长的一段)与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位。
[0052]见图7 (b )，探针A的5 ’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶Bspl43I的识别位点GATC，且其3’末端标记有淬灭基团Dabcyl，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧。探针A的DNA序列5’到3，见序列表中的SEQ ID NO 4。
[0053]见图7 (C)，探针B由三部分组成，其3’端一段12~15 (本实施例中为12)个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分，可用来加快限制性内切酶的反应速率，本实施例的悬垂部分设计为茎环结构，环状由4个A碱基组成，茎杆部分由6个碱基对组成，中间的4个碱基对为限制性内切酶识别位点GATC，但酶切位(tGATC)的磷酸二酯键被单硫代磷酸酯键取代，可以避免被酶切。此悬垂设计可加快检测时荧光增强速率。探针B的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 5。
[0054]⑤进行连接反应。连接反应连接锁式探针成为环形模板。将20、100、500pM的靶序列核酸片段，分别与 I μ M锁式探针，IOmM MgCl2, 50mM Tris - HCl (ρΗ7.5，25°C )，ImM ATP，IOmM 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT), IOU/ μ L购自美国新格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs Inc.，NEB)的T4 DNA连接酶组成体积为20 μ L的反应体系；加入连接酶前，混合液被加热到95°C后冷却到室温，然后与连接酶混合后在37°C孵育2小时。在65°C条件下加热反应体系10分钟以终止连接反应，得到3份连接反应产物。
[0055]⑥进行滚环扩增(RCA )反应。
[0056]取步骤⑤得到的3份连接反应产物各5 μ L，分别加入到终体积20 μ L的反应混合液中，得到3份反应体系。反应混合液中除连接反应产物还包括2.5μ M引物，50mM Tris -HCl (ρΗ7.5，25°C )，IOmM MgCl2, IOmM (NH4) 2S04,4mM DTT 和 0.2 μ g/ μ L BSA 和 2 μ M dNTP。
[0057]将反应体系分别加热到95°C并冷却至室温，加入0.25U/yL Φ29?ΝΑ聚合酶(ΝΕΒ)，在37°C下孵育19个小时。然后将反应体系在65°C加热10分钟以终止反应。3份反应产物分别用购自GE Healthcare的葡萄糖凝胶G_50 (Sephadex G-50)离心纯化柱纯化。
[0058]⑦交联探针检测滚环扩增产物。
[0059]取9 μ L步骤⑥离心纯化得到的溶液加入到终体积为60 μ L的交联探针反应检测液中，混合液除9 μ L离心纯化得到的溶液还包括探针A和探针B各200nM，33mM Tris - Ac(ρΗ7.9，37°C )，IOmM MgOAc2,66mM KOAc，0.02% Triton X-100 和 0.1 μ g/ μ L BSA。
[0060]将反应体系加热到95°C并冷却至室温，记录初始荧光值后加入0.083U/ μ L购自赛默飞世尔(Thermo Scientific)的Bspl43I，在37°C下孵育20分钟，记录荧光终值(荧光仪为江苏无锡欧普兰科技有限公司生产的0P-161型，激发波长470nm，发射波长525nm)。终点值减去初始值之差即为荧光信号的增强值。20pM、100pM和500pM不同浓度的靶序列的交联探针检测滚环扩增产物的检测步骤相同。
[0061]除了从连接反应-滚环扩增得到的样本，本实例中还加入I个参照品，该参照品用IOOnM合成模板(DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 6)代替RCA产物，其他反应条件一致进行交联探针检测。
[0062]本实施例检测20pM、100pM和500pM的靶序列得到了不同的荧光信号增强值，检测结果见图2，仅仅使用JP检测(即没有之前的RCA)，IOOnM浓度的模板得到的检测信号与本实施例RCA-JP法100 pM浓度模板的信号相当。所以，我们可以认为RCA将检测灵敏度提高了 1000倍左右。[0063]判断是否存在待测目标序列时，在未加入核酸酶Bspl43I孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶Bspl43I孵育后记录荧光值作为终点值,若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。所述阴性对照品是指不含有待测目标序列的样品，其检测方法与待测目标序列完全相同。
[0064]在待测目标存在的条件，锁式探针+滚环扩增反应扩增出可被交联探针技术检测的含大量重复片段线型长链DNA，如果不存在待测目标，锁式探针不能被环化，交联探针技术检测不到长链产物。理论上，滚环扩增可将一个单位的待测序列扩增得到成百上千单位的重复序列，交联探针检测技术又可以从I个单位的重复序列出发得到成百上千倍的信号扩增，最后扩增的结果是两次扩增倍数的乘积。所以，本发明的方法比单独使用其中一种方法要灵敏得多。
[0065](实施例2)
本实施例的核酸检测方法与实施例1的不同之处在于:本实施例将连接反应、滚环扩增(RCA)反应和交联探针检测滚环扩增产物在一个步骤中完成。
[0066]在按照实施例1的步骤①至步骤④完成目标序列的确定、锁式探针的设计合成、滚环扩增引物的制备以及交联探针的制备后，将含有锁式探针、滚环扩增引物、交联探针A、交联探针B、缓冲液、连接酶、聚合酶、核酸酶与待测片段的混合液在20°C~37°C孵育4~21小时后监测荧光信号值作为终点值，将其减去未加入核酸酶孵育之前记录的初始荧光值，若前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。所述阴性对照品是指不含有待测目标序列的样品。
[0067]上述缓冲液能够提供连接酶、聚合酶和核酸酶同时发挥活性的环境，包括适宜的PH值，阳离子和其他分子；连接酶连接DNA链3’端羟基和5’磷酸基团为磷酸二酯键，聚合酶能够以环状DNA为模板延伸引物，复制核酸序列，核酸酶为识别位点是特定序列双链DNA的内切酶。
[0068]本实施例中在按照实施例1的步骤①至步骤④完成目标序列的确定、锁式探针的设计合成、滚环扩增引物的制备以及交联探针的制备后，将含有500nM锁式探针(SEQ IDNO 2)，I μ M 滚环扩增引物(SEQ ID NO 3)，探针 A (SEQ ID NO 4)和探针 B (SEQ ID NO 5)各600nM, (TlOOpM 靶序列核酸片段(SEQ ID NO l),50mM Tris-HCl (ρΗ7.5,25°C), IOmM MgCl2,5mM (NH4)2SO4, 7mM DTT, 0.1 μ g/ μ L BSA, ImM dATP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM TTP, IOU/μ LT4 DNA 连接酶，0.167U/y L Φ29 DNA聚合酶，0.083U/μ L Bspl43I 的混合液共 60 μ L在37 °C孵育21小时，记录孵育后终点荧光值，将其减去未加入核酸酶孵育之前记录的初始荧光值，将两者之差作为纵坐标，结果如图3所示。
[0069]本实施例检测了浓度为0pm、10pm、20pm、50pm、IOOpm的祀序列核酸片段，每个浓度的祀序列核酸片段分别按照上述步骤完成检测，浓度为10pm、20pm、50pm、IOOpm的革巴序列核酸片段的终点值与初始值前后差值均大于阴性对照品(图3中浓度为O)的差值的3倍以上，说明含有目标靶序列。本实施例说明整合后的实验流程也能成功检测待测靶序列。本实施例反应全程可在一个温度37°C下进行，不需要聚合酶链式反应中热循环，因此可被应用于活组织核酸检测。
[0070] 本实施例说明本发明的核酸检测方法除待测样品以外的反应体系可集中到一起，可在单管中检测样品，检测操作简单。在待测目标存在的条件，锁式探针+滚环扩增反应扩增出可被交联探针技术检测的含大量重复片段线型长链DNA，能够检测到荧光信号；如果不存在待测目标，锁式探针不能被环化，交联探针技术检测不到长链产物。
[0071](应用例I)
本应用例用滚环扩增-交联探针联用技术恒温检测人乳头瘤病毒临床样本。
[0072]人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)是一种可以感染人类的DNA病毒,有一百多种亚型。许多人携带有不同亚型的HPV病毒，在大多数情况下，这些普通的病毒并不会致病。但其中有些亚型会导致生殖器疣，其中，HPV16型病毒已被证实与子宫颈癌和口腔癌有紧密联系。在美国，仅仅2013年一年，因为子宫颈癌和口腔癌分别造成的死亡人数约为4000和8000。目前，对于这些病毒没有直接的治疗手段，但用宫颈组织涂片对宫颈细胞进行早期检测很有必要，例如，HPV16U8或45阳性的子宫颈异常细胞与宫颈癌高度相关，对感染情况的了解便于医生对子宫病患者进行病情跟踪和管理。另外，从流行病学的角度也有必要对HPV患者进行早期诊断，可防止病人的伴侣接触和感染这些病毒。迄今为止，市场上已经出现了各类商品试剂盒用于检测HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等亚型。这些商品试剂盒大多基于聚合酶法，虽然灵敏，但是需要使用专业热循环PCR仪器，在医疗资源匮乏的地区不那么容易实现。即便具备仪器和熟练的技术人员进行PCR反应，相关检测机构还需要配备能够调节空气流动方向的实验室以避免气溶胶污染，昂贵而不方便。所以，我们致力于利用RCA-JP法检测HPV，不需要PCR，在恒温下就能检测病原体。
[0073]人乳头瘤病毒临床样本的检测包括以下步骤:
①确定待 测DNA片段。HPV的LI区域是相对保守的区域，其中，大多数不同亚型的HPV在LI区域的6582~6646碱基一段有较为显著的不同，所以，常见亚型HPV16的LI区域(GenBank数据库编号K02718) 6600~6629的这一段被选为检测的靶序列。
[0074]②设计、制备探针和引物。根据实施例1所述的探针和引物设计的原则，设计新的锁式探针(DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ IDNO 7，5’末端被磷酸化见图7d)、引物(DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 3)和交联探针(探针A的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 8，探针B的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 9)。其中交联探针A的标记示意图见图7 (e)，交联探针B的酶切位的磷酸二酯键被单硫代磷酸酯键取代示意图见图7 (f)。本实施例的交联探针可作为通用探针使用。
[0075]③样本前处理。HPV16临床阳性、HPV55临床阳性和HPV临床阴性宫颈擦拭子样本均来源于江苏常州科莱医学检验所并经广州中山大学达安基因股份有限公司产品人乳头瘤病毒反相点杂交基因分型检验试剂盒验证。HPV16、HPV55和HPV阴性宫颈擦拭子样本各自的处理方法相同，将ImL生理盐水浸泡宫颈擦拭子，简单离心，并取IOyL溶液加入终体积为20 μ L缓冲液中在37°C下孵育I小时进行限制性内切酶消化，缓冲液组成成分为IOmMTris-HCl (pH7.5，25°C )，IOmM MgCl2, ImM DTT,购自包生物工程(大连)有限公司(Takara)的限制性内切SacI (酶切位点GAGCT T C)和BstXI (酶切位点CCANNNNNT NTGG)各0.5U/ μ L。因为RCA恒温核酸检测技术单链核酸模板，但是基因组DNA是双螺旋结构。为了解决基因组DNA双链结构带来的问题，使探针能够与单链形式的核酸片段互补配对，加入两种限制性内切酶SacI和BstXI裂解基因组DNA，因为限制性内切酶可将基因组内切酶消化为短片段，从而使双链分离变得容易。
[0076]④恒温检测HPV。含有500ηΜ新设计的锁式探针(SEQ ID NO 7)，I μ M引物(SEQ IDNO 3)，探针A(SEQ ID NO 8)和探针B (SEQ ID NO 9)各600nM，6 μ L步骤③的前处理液，50mMTris-HCl (ρΗ7.5，25 °C )，IOmM MgCl2, 5mM (NH4) 2S04, 7mM DTT, 0.1 μ g/ μ LBSA, ImM dATP,0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM TTP, IOU/ μ L T4 DNA 连接酶，0.167U/ μ I Φ 29 DNA 聚合酶，0.083U/yL Bspl43I的混合液共60 μ L在37 °C孵育21小时，并监测不同孵育时间的各份样本的荧光信号值；本步骤平行地恒温检测了 HPV16临床阳性、HPV55临床阳性和HPV临床阴性宫颈擦拭子样本前处理液和阴性参照样本，每个样本分别按照上述步骤完成检测，除去背景信号的结果如图4所示。
[0077]结果表明，用针对HPV16的探针，在恒温的条件下，成功检测出了临床样本，而且，HPV55阳性和HPV阴性的临床宫颈擦拭子样本在同样的实验条件下，得到的结果与背景值相当。这说明，滚环扩增-交联探针联能够准确且特异地检测HPV16临床样本。
[0078](应用例2)
本应用例用滚环扩增-交联探针联用技术恒温检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌样本。
[0079]金黄色葡萄球菌iStaphyloccocus aureus,以下简称金葡菌)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属{Staphylococcus')。治疗普通金葡菌感染可选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素或先锋霉素VI等。但是，自1961年英国的Jevons首次发现了耐甲氧西林金葡菌 imethici 11 in-resistant Staphylococcus aureus,下简称 MRSA)以来,具有多重耐药性的MRSA不断出现，大部分传统的抗生素已经不适用于MRSA感染。MRSA感染给患者带来了沉重的心理和经济负担，严重感染甚至能导致死亡。
[0080]葡萄球菌对甲氧西林的耐药性主受其染色体上mecA基因调节，被称为SCCmec6。mec基因编码一种变异青霉素结合蛋白(PBP2a)。天然的五种PBP (1，2，3，3’和4)参与合成细菌细胞壁，由于它们与内酰胺类抗生素有很高的亲和力，能共价结合于内酰胺类药物的活动位点上，失去其活性导致细菌死亡。PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不被内酰胺类抗生素结合。在此类抗生素存在的情况下，细胞壁仍能组装细胞壁而正常生长，表现出耐药性。
[0081]常规实验室检测药敏金葡菌主要通过培养、鉴定和药敏实验来进行。金葡菌在血琼脂上能形成金色或白色菌落，菌株产生的过氧化氢酶能把过氧化氢转化为水和氧气。过氧化氢酶实验能将葡萄球菌与肠球菌和链球菌区分开。常规检测中也使用商业化的乳胶凝集测试。这些测试的检测目标为荚膜多糖或其他特定抗原，虽然结果较为准确，但不能将金葡菌与其他葡萄球菌菌株区分开。生化试剂盒及自动化系统也是一种选择，其性能表现也不错，但是操作耗时，造价昂贵，只能在大中型机构应用。
[0082]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测包括以下步骤:
①确定待测DNA片段。选择金黄色葡萄球菌mecA基因(GenBank数据库编号FJ810876.1) 522~546 —段为靶序列。
[0083]②设计、制备探针和引物。根据实施例1所述的探针和滚环扩增引物设计的原则，设计新的锁式探针(DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 10，5’末端被磷酸化见图7g)，滚环扩增引物和交联探针用通用型设计，无需重新设计制备。滚环扩增引物的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 3 ;交联探针A的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO8，交联探针B的DNA序列5’到3’见序列表中的SEQ ID NO 9。
[0084]③样本前处理。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌样本1-3均来源于江苏常州中医院。挑取细菌单克隆于20 μ L生理盐水中在95°C孵育10分钟。
[0085]④恒温检测金黄色葡萄球菌耐甲氧西林基因。含有500nM新设计的锁式探针(SEQ ID NO 10)，I μΜ 引物(SEQ ID NO 3)，探针 A (SEQ ID NO 8)和探针 B (SEQ ID NO 9)各600ηΜ, 6 μ L 步骤③的前处理液，50mM Tris-HCl (ρΗ7.5，25°C )，IOmM MgCl2, 5mM (NH4) 2S04,7mM DTT, 0.1 μ g/ μ L BSA, ImM dATP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM TTP, IOU/ μ L T4 DNA 连接酶，0.167U/y ?Φ29 DNA 聚合酶，0.083U/μ L Bspl43I 的混合液共 60 μ L 在 37 °C孵育 21小时，记录孵育后终点荧光值，将其减去未加入核酸酶孵育之前记录的初始荧光值，将两者之差作为纵坐标；本步骤检测了 3组步骤③的前处理液，分别为样本1、样本2和样本3，结果如图5所示。
[0086]结果表明，在恒温的条件下，滚环扩增-交联探针联用技术成功检测了金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林基因。
[0087](应用例3)
本应用例用滚环扩增-交联探针联用技术检测EGFR外显子21 L858R (T-G)突变。
[0088]EGFR是原癌基因c_erbBl的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括 HERl (erbBl，EGFR)、HER2 (erbB2，NEU)、HER3 (erbB3)及 HER4 (erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。
[0089]EGFR广泛分布于哺 乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。
[0090]EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗的问世大大改善了转移性结直肠肿瘤疗效，而当人们意识到使用免疫组织化学技术检测EGFR蛋白表达阳性与应用EGFR单抗治疗的疗效并没有相关性，便致力于研究可能的疗效预测标志物。EGFR 19启动子19E746~A750 DEL和Exon 21 L858R T-G突变检测在临床已经广泛开展，作为一线相关肿瘤治疗必检项目。
[0091]EGFR外显子21 L858R (T-G)突变的检测方法包括以下步骤:
①确定待测DNA片段。选择含有EGFR外显子21突变点的一段为靶序列。
[0092]②设计、制备探针和引物。根据实施例1的探针和引物设计的原则，设计能与EGFR野生型DNA杂交的锁式探针SEQ ID NO 11，5’末端被磷酸化见图7h，滚环扩增引物和交联探针用通用型设计，无需重新设计制备。滚环扩增引物和交联探针与应用例2所用的相同。
[0093]③恒温检测EGFR外显子21基因突变。含有500nM新设计的锁式探针(SEQ ID NO11)，I μΜ 引物(SEQ IDNO 3)，探针 A (SEQ ID NO 8)和探针 B (SEQ ID NO 9)各 600nM，50ng样本DNA (野生型和突变型，从临床石蜡样本中提取并经DNA测序确认，检测时分别进行)，50mM Tris-HCl (ρΗ7.5，25 °C )，IOmM MgCl2, 5mM (NH4) 2S04, 7mM DTT, 0.1 μ g/ μ L BSA, ImMdATP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM TTP, IOU/ μ L T4 DNA 连接酶，0.167U/ μ L Φ 29 DNA 聚合酶，0.083U/ μ L Bspl43I的混合液共60 μ I在37°C孵育21小时，记录孵育后终点荧光值，将其减去未加入核酸酶孵育之前记录的初始荧光值，将两者之差作为纵坐标，野生型和突变型的检测结果如图6所示。
[0094]结果表明，在恒温的条件下，滚环扩增-交联探针联用技术可用于检测基因突变。[0095]以上各实施例是对本发明的【具体实施方式】的说明，而非对本发明的限制，有关【技术领域】的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案 均应该归入本发明的专利保护范围。
【权利要求】
1.一种核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤: ①确定待测目标序列及其待测靶序列； ②根据目标序列设计合成锁式探针； ③制备滚环扩增引物； ④制备交联探针； ⑤进行连接反应，将待测目标序列与锁式探针，缓冲液组成的混合液被加热到85~95°C后冷却到室温，然后加入连接酶，与连接酶混合后在20~37°C孵育0.5~4小时，加热使连接酶变性失活； ⑥以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增； ⑦滚环扩增完成后，用交联探针检测滚环扩增产物，检测时，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10~15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10~15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18~25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端 区域，是“信号产生”区域，长度22~24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。
3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。
4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤④的交联探针包括探针A和探针B ； 探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8~12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8~12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3’末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧； 探针B由三部分组成，其3’端一段12~15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12~15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。
5.一种核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤: ①确定待测目标序列及其待测靶序列； ②根据目标序列设计合成锁式探针； ③制备滚环扩增引物； ④制备交联探针； ⑤将含有锁式探针、滚环扩增引物、交联探针A、交联探针B、缓冲液、连接酶、聚合酶、核酸酶与待测片段的混合液在20°C~37 °C孵育4~21小时后监测荧光信号值，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。
6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤⑤中所述的缓冲液提供连接酶、聚合酶和核酸酶同时发挥活性的环境；连接酶连接DNA链3’端羟基和5’磷酸基团为磷酸二酯键，聚合酶以环状DNA为模板延伸引物，复制核酸序列，核酸酶为识别位点是特定序列双链DNA的内切酶。
7.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10~15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10~15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18~25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22~24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。
8.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。
9.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于:步骤④的交联探针包括探针A和探针B ； 探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8~12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8~12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有 限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3’末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧； 探针B由三部分组成，其3’端一段12~15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12~15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。
【文档编号】C12Q1/68GK104017861SQ201410167213
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】晏雷, 赫尔曼辛蒂姆 申请人:常州方圆制药有限公司, 赫尔曼辛蒂姆