从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，包括以下步骤：获取PBS、白细胞和部分血液的混合液；弃去血浆，向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液；将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，收集第二层细胞放入磷酸缓冲液中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀,然后重复洗涤,最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞；将所分离的外周血单个核细胞培养于37℃，5％CO2培养箱，过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞。本发明提供的从去白细胞滤器中分离淋巴细胞的方法，不仅可以避免淋巴细胞的浪费，而且对红细胞，血小板等其它成分不会造成影响，用此分离方法得到的淋巴细胞数量可达1×106，存活率大于90％。
【专利说明】从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淋巴细胞的分离方法，特别涉及从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法。
【背景技术】
[0002]T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。细胞毒T细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞。少数成熟T细胞的TCR分子是由Y链和δ链组成的异二聚体分子，它可直接识别抗原(多肽、类脂分子)，TCR Y δ主要存在于小肠粘膜上皮和表皮，而外周血中仅占成熟T细胞的0.5% —10%。TCRy δ识别病原体表面抗原分子后，增殖分化为效应细胞发挥杀伤作用，同时它对被病毒感染的细胞和肿瘤细胞具有杀伤活性。
[0003]临床用血时为了防止由于输入白细胞引起的输血反应，要求在制作成分血之前进行去白细胞操作。目前，国内外使用的方法大多是使用去白细胞滤器去除血液中的白细胞，使用这种方法可以使99%的白细胞残留在去白 细胞滤器中，其中淋巴细胞占很大一部分比例，这就会造成淋巴细胞的浪费。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供避免淋巴细胞的浪费且对红细胞，血小板等其它成分不会造成影响的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，用此方法可分离出较高数量和存活率的淋巴细胞。
[0005]本发明提供了一种从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，包括以下步骤:
[0006]步骤一:取去白细胞滤器，过滤全血后，白细胞残留在滤器中；
[0007]步骤二:使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液；
[0008]步骤三:将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆；
[0009]步骤四:向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液；
[0010]步骤五:将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀，然后重复洗涤，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞；
[0011]步骤六:将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C，5% CO2培养箱，过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞。[0012]所述磷酸缓冲液为含有135mM NaCl、4.7mM KClUOmM Na2HPO4,2mM NaH2PO4 且 pH值为7.4的水溶液。
[0013]所述步骤一中去白细胞滤器的规格为2单位400ml，全血为400ml，所述步骤二中的磷酸缓冲液为40-80ml。
[0014]所述步骤三中的离心速率为2000-2500转/分，离心时间为20分钟。
[0015]所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25_40ml。
[0016]所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077，细胞液和细胞分离液的体积比为1.5:1-2:1，混合后离心的速率为2000-2500转/分，尚心时间为15-20分钟。
[0017]所述步骤五中收集第二层细胞是放入含20_40ml的磷酸缓冲液的试管中，与磷酸缓冲液混匀离心速率为2000-2500转/分，离心时间为10-15分钟，然后以同样转速和时间
重复洗涤两次。
[0018]所述步骤六中所用 的培养液为购自天津市灏洋生物制品科技有限公司、产品编号为CIK2013的45毫升人淋巴细胞专用培养基。
[0019]本发明提供的从去白细胞滤器中分离淋巴细胞的方法，不仅可以避免淋巴细胞的浪费，而且对红细胞，血小板等其它成分不会造成影响，用此分离方法得到的淋巴细胞数量可达IX IO6,存活率大于90%。
【具体实施方式】
[0020]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]以下IXPBS(磷酸缓冲液)为含有 135mM NaCl, 4.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mMNaH2PO4且pH值为7.4的水溶液。
[0022]实施例1
[0023]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法:
[0024]1、淋巴细胞的分离
[0025]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0026]2)使用60毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0027]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以1500转/分离心20分钟弃去血浆。
[0028]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入30毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0029]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0030]6)以2000转/分离心20分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2000转/分离心10分钟，弃去上清留沉淀，然后以20ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞。[0031]7)将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C，5% CO2培养箱，培养液为30毫升人淋巴细胞专用培养基(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为CIK2013)。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0032]2、淋巴细胞数量和活性鉴定
[0033]使用血球计数板统计去除贴壁细胞后刚刚转移至新培养瓶的悬浮淋巴细胞的数量，使用常规的台盼蓝染色法统计淋巴细胞存活率。
[0034]实验结果表明，从一个2单位去白细胞滤器中可以分离出1.09X IO6个淋巴细胞，细胞存活率为94.8%。
[0035]实施例2
[0036]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法:
[0037]1、淋巴细胞的分离
[0038]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0039]2)使用50毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合 液。
[0040]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2000转/分离心15分钟弃去血浆。
[0041]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入30毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0042]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=1.5:1(体积比)。
[0043]6)以2500转/分离心15分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含25ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2500转/分离心15分钟，弃去上清留沉淀，然后以20ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞。
[0044]7)将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C, 5% CO2培养箱,培养液为35毫升人淋巴细胞专用培养基(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为CIK2013)。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0045]2、淋巴细胞数量和活性鉴定
[0046]使用血球计数板统计去除贴壁细胞后刚刚转移至新培养瓶的悬浮淋巴细胞的数量，使用常规的台盼蓝染色法统计淋巴细胞存活率。
[0047]实验结果表明，从一个2单位去白细胞滤器中可以分离出8.6X IO5个淋巴细胞，细胞存活率为95.6%。
[0048]实施例3
[0049]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法:
[0050]1、淋巴细胞的分离
[0051]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。[0052]2)使用80毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0053]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2000转/分离心20分钟弃去血浆。
[0054]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入40毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0055]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0056]6)以2000转/分离心15分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含40ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2000转/分离心15分钟，弃去上清留沉淀，然后以40ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞。
[0057]7)将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C, 5% CO2培养箱,培养液为40毫升人淋巴细胞专用培养基(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为CIK2013)。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0058]2、淋巴细胞数量和活性鉴定
[0059]使用血球计数板统计去除贴壁细胞后刚刚转移至新培养瓶的悬浮淋巴细胞的数量，使用常规的台盼蓝染色法统计淋巴细胞存活率。
[0060]实验结果表明，从一个2单位去白细胞滤器中可以分离出9.1 X IO5个淋巴细胞，细胞存活率为97.2%。
[0061]实施例4
[0062]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法:
[0063]1、淋巴细胞的分离
[0064]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0065]2)使用40毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0066]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2500转/分离心15分钟弃去血浆。
[0067]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入25毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0068]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0069]6)以2500转/分离心20分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含45ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2500转/分离心10分钟，弃去上清留沉淀，然后以45ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞。
[0070] 7)将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C, 5% CO2培养箱,培养液为45毫升人淋巴细胞专用培养基(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为CIK2013)。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0071]2、淋巴细胞数量和活性鉴定
[0072]使用血球计数板统计去除贴壁细胞后刚刚转移至新培养瓶的悬浮淋巴细胞的数量，使用常规的台盼蓝染色法统计淋巴细胞存活率。
[0073]实验结果表明，从一个2单位去白细胞滤器中可以分离出1.21 X IO6个淋巴细胞，细胞存活率 为96.3%。
【权利要求】
1.一种从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:取去白细胞滤器，过滤全血后，白细胞残留在滤器中； 步骤二:使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器，获得磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液； 步骤三:将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆； 步骤四:向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液； 步骤五:将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀，然后重复洗涤，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞； 步骤六:将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C，5% CO2培养箱，过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为含有 135mM NaCl,4.7mM KClUOmM Na2HPO4,2mM NaH2PO4 且 pH 值为 7.4 的水溶液。
3.根据权利要求2所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤一中去白细胞滤器 的规格为2单位400ml，全血为400ml，所述步骤二中的磷酸缓冲液为 40-80ml。
4.根据权利要求3所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤三中的离心速率为2000-2500转/分，离心时间为20分钟。
5.根据权利要求4所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25-40ml。
6.根据权利要求5所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077，细胞液和细胞分离液的体积比为1.5:1-2:1，混合后离心的速率为2000-2500转/分，离心时间为15-20分钟。
7.根据权利要求6所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤五中收集第二层细胞是放入含20-40ml的磷酸缓冲液的试管中，与磷酸缓冲液混匀离心速率为2000-2500转/分，离心时间为10-15分钟，然后以同样转速和时间重复洗涤两次。
8.根据权利要求7所述的从去白细胞滤器里分离淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤六中所用的培养液为购自天津市灏洋生物制品科技有限公司、产品编号为CIK2013的45毫升人淋巴细胞专用培养基。
【文档编号】C12N5/0783GK103981145SQ201410232725
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】蒋宇扬, 陈妍 申请人:深圳市坤健创新药物研究院, 清华大学深圳研究生院