一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用。该方法主要是利用S1核酸酶能够特异性降解单链DNA的性质检测目的基因的转录方向；以待检基因链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用设计的基因上游引物F或下游引物R进行PCR，根据PCR产物电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链。该方法可用于分析DNA向mRNA转录过程中是单向转录还是双向转录；对于单向转录的DNA片段，能够进一步确定DNA转录的模板链是DNA的正链还是负链。另外，本方法可在12h左右完成检测，具有操作简单、速度快、成本低的显著特点，开发成检测试剂盒，可在科学研究、新基因功能研究中广泛推广应用。
【专利说明】一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】。更具体地，涉及一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]在分子生物学领域，基因转录是以DNA的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下合成RNA的过程。DNA双链中以哪一条链为模板进行转录依不同的基因或DNA片段而不同。而近些年研究发现有些基因的DNA区域两条链均可以转录。以DNA单独的一条链为模板进行转录即为单向转录，转录得到的cDNA为单链；而存在DNA区域两条链均可以转录的基因转录方式，我们称之为双向转录，转录得到的cDNA为双链。在高通量测序的时代，已经发现大量基因或DNA片段存在反义链转录本，并且很多基因是双向转录。
[0003]真核基因的转录调控对基因的表达乃至机体的发育有着举足轻重的作用，因此建立一种系统检测基因转录方向和模板的通用方法有助于推动已知基因转录调控功能的挖掘；对于新基因，能够分析其转录方向和转录模板链。截至目前，关于基因单、双向转录情况的研究仅见Fadia (2007)对比分析了不同商品化的试剂盒在不同条件下反转录的特异性，仅此I篇报道。
[0004]目前，检测基因转录方向的方法主要有northern blot、高通量测序等，但是，northern blot步骤繁琐,整个实验流程需要2天时间才能完成，并且如果以检测基因转录方向及模板为目的的话，就杂交所用的单链探针的合成、标记这一项成本就非常高。高通量测序也可以检测基因转录方向，但是，高通量测序是组学的研究方法，研究对象是整个转录组或基因组,成本很高,并且至少I个月的时间才能完成。如此费时、成本高的高通量测序非常不适合于研究单个基因或少数几个基因转录方向和模板。因此，寻找一种操作简单、速度快、成本低的检测DNA转录模板和转录方向的方法，对于基因分子功能科学研究、新基因功能研究，具有很大的实用价值和意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有检测基因转录方向及模板技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、速度快、成本低的DNA转录方向和转录模板的系统检测方法。
[0006]本发明的目的是提供一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法。
[0007]本发明另一目的是提供上述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法的应用。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下:
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤SI的RNA反转录为cDNA；
S3.设计待检基因的引物F和引物R，确定适宜的退火温度和反应体系；所述引物F和引物R分别为待检基因DNA双链两端的一段序列，可用于PCR扩增出待检基因序列。[0009]S4.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物F和引物R进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链；所述SI核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶,可市购,如TaKaRa出品的SI核酸酶。
[0010]S5.如果待检基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下:
S51.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物F或引物R进行链特异RT-PCR (链特异反转录聚合酶链反应)，得到反转录产物cDNA ；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物F或引物R，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链。
[0011]其中，步骤S4所述根据电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为单链，即待检基因为单向转录；如果电泳结果显示有待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为双链，即待检基因为双向转录。
[0012]步骤S53所述根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物F反转录的cDNA具有PCR产物，而引物R无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物R反转录的cDNA具有PCR产物，而引物F无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的正链。
[0013]本发明还提供上述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法的应用。利用所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法制备的试剂盒也应在本发明的保护范围之内。
[0014]本发明还提供了基因β -actin转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下:
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤SI的RNA反转录为cDNA；
S3.设计β-actin基因的引物β-actinFl和β-actinRl,确定适宜的退火温度和反应体系；
S4.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物β -actinFl和β -actinRl进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β -actin基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果β-actin基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如
下:
S51.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物β-actinFl或β-actinRl进行链特异RT-PCR (链特异反转录聚合酶链反应)，得到反转录产物cDNA ；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinFl或β -actinRl，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物β -actinFl的序列如SEQ ID N0.1所示，β -actinRl的序列如SEQ IDN0.2所示。
[0015]其中，步骤S4所述根据电泳结果判断β -actin基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无β-actin基因产物,则表明β-actin基因转录后的cDNA为单链，即β-actin基因为单向转录；如果电泳结果显示有β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为双链，即β-actin基因为双向转录。
[0016]步骤S53所述根据电泳结果判断β -actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物β-actinFl反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β -actinRl无扩增产物,表明β -actin基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物β-actinRl反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinFl无扩增产物，表明β -actin基因的转录模板是DNA的正链。
[0017]本发明还提供了基因Tsix转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下:
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤SI的RNA反转录为cDNA；
S3.设计Tsix基因的引物TsixF2和TsixR2，确定适宜的退火温度和反应体系；
S4.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果Tsix基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下:
S51.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2进行链特异RT-PCR (链特异反转录聚合酶链反应)，得到反转录产物cDNA ；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物TsixF2的序列如SEQ ID N0.3所示；TsixR2的序列如SEQ ID N0.4所示。
[0018]步骤S4所述根据电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为单链，即Tsix基因为单向转录；如果电泳结果显示有Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为双链，即Tsix基因为双向转录。
[0019]步骤S53所述根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物TsixF2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixR2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物TsixR2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixF2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的正链。
[0020]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，该方法可用于分析DNA向mRNA转录过程中，确定DNA是单向转录还是双向转录(即转录的cDNA是单链还是双链)，对于单向转录的DNA片段，能够进一步确定DNA转录所用的模板链是DNA正链还是负链。
[0021]另外，本方法具有操作简单、速度快、成本低的显著特点，本领域熟练技术人员可在12h左右完成检测，所用材料和试剂均为本领域常用，容易获得、价格低廉。开发成检测试剂盒可进一步简化操作步骤、缩短操作时间，推广使用，在科学研究、新基因功能研究中具有广泛推广应用的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为公鼠组织提取的总RNA电泳结果。
[0023]图2为母鼠组织提取的总RNA电泳结果。
[0024]图3为基因β -actin引物梯度PCR产物电泳结果。
[0025]图4为基因Tsix引物梯度PCR产物电泳结果。
[0026]图5为经SI核酸酶酶切后的cDNA进行β -actin基因的PCR结果。
[0027]图6为经SI核酸酶酶切后的cDNA进行Tsix基因的PCR结果。
[0028]图7为基因β -actin链特异RT-PCR产物。
[0029]图8为基因Tsix链特异RT-PCR产物。
[0030]图9为NCBI中注释的小鼠β -actin (Actb)转录方向。
[0031]图10为NCBI中注释的小鼠Tsix转录方向。
[0032]图11经SI核酸酶酶切后的cDNA进行GHR基因的PCR结果。
[0033]图12基因GHR链特异RT-PCR产物。
[0034]图13为NCBI中注释的鸡GHR与LRPl的转录方向。
【具体实施方式】
[0035]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0036]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0037]实施例1小鼠β-actin和Tsix基因转录方向分析
1、试验材料和实验方法
(I)试验动物
昆明白小鼠，雌鼠7-8周龄，雄鼠3-6月龄，饲养条件:光照6:00AM-8:00PM，温度20^25 °C,自由采食。
[0038](2)主要器械及仪器
剪刀、镊子、脱脂棉，使用前用RNA酶抑制剂处理；枪头、离心管、PCR管均用DECP水处理过，DECP浓度为0.1%。制冰机、_20°C冰箱、_80°C冰箱、台式离心机、高速冷冻离心机、电泳仪、电子分析天平、PCR仪。
[0039](3)实验试剂
Mix (Transgene)、marker D2000 (Genestar)、反转录试剂盒(Promega)、RNA 酶抑制剂(Thermo)、SI 核酸酶(TaKaRa), Trizol (TaKaRa)、DNase I (Thermo)。
[0040]50XTAE缓冲液=Tris 242g，Na2EDTA_2H20 37.2g于IL烧杯中，向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1 mL冰乙酸，充分溶解；加水至1L。
[0041 ] 1%琼脂糖凝胶:Ig琼脂糖溶于IOOmL 50 X TAE缓冲液，微波炉加热2~3分钟溶化后加入5μLΕΒ。
[0042]0.5Μ EDAT:EDAT 186.1g 溶于 800mL 双蒸水中，用 NaOH 调 pH 值至 8.0，定容至1000mL,高压灭菌。
[0043]IOX凝胶加样缓冲液:30mM EDTA,0.05%溴酚蓝、50%(w/v)蔗糖水溶液，4°C保存。
[0044]2、引物设计
利用软件Vector NTI和primer premier5,设计目的基因β -actin的引物β -actinFl(序列如SEQ ID N0.1所示)和β -actinRl (序列如SEQ ID N0.2所示)；基因Tsix的引物TsixF2 (序列如SEQ ID N0.3所示)和TsixR2 (序列如SEQ ID N0.4所示)，引物信息如表1所示:
表1 Tsix和β -actin引物信息
【权利要求】
1.一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤如下: S1.提取待检基因总RNA； S2.将步骤SI的RNA反转录为cDNA； S3.设计待检基因的引物F和引物R; S4.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3的引物F和引物R进行PCR，根据PCR产物的电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链； S5.如果待检基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下: S51.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3的引物F或引物R进行链特异RT-PCR，得到反转录产物cDNA ； S52.以产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物F或引物R，进行PCR扩增； S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链； 所述引物F和引物R分别为待检基因DNA双链两端的一段序列，可用于PCR扩增出待检基因序列。
2.根据权利要求1所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤S4所述根据PCR产物的电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为单链，即待检基因为单向转录；如果电泳结果显示有待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为双链，即待检基因为双向转录。
3.根据权利要求1所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤S53所述根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物F反转录的cDNA具有PCR产物，而引物R无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物R反转录的cDNA具有PCR产物，而引物F无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的正链。
4.权利要求1-3任一所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法的应用。
5.权利要求1-3任一所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法在制备DNA转录方向和转录模板检测试剂盒中的应用。
6.基因β-actin转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤如下: S1.提取待检基因总RNA； S2.将步骤SI的RNA反转录为cDNA； S3.设计β-actin 基因的引物 β-actinFl 和 β -actinRl ； S4.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物β -actinFl和β -actinRl进行PCR，根据PCR产物的电泳结果判断β -actin基因转录产物cDNA是单链还是双链； S5.如果β-actin基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下: S51.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物β-actinFl或β-actinRl进行链特异RT-PCR，得到反转录产物cDNA ； S52.以产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinFl或β -actinRl，进行PCR扩增； S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链； 其中，所述引物β -actinFl的序列如SEQ ID N0.1所示，β -actinRl的序列如SEQ IDN0.2所示； 步骤S4所述根据PCR产物的电泳结果判断β -actin基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无β-actin基因产物,则表明β-actin基因转录后的cDNA为单链，即β-actin基因为单向转录；如果电泳结果显示有β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为双链，即β-actin基因为双向转录； 步骤S53所述根据电泳结果判断β -actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物β-actinFl反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β -actinRl无扩增产物,表明β -actin基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物β-actinRl反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinFl无扩增产物，表明β -actin基因的转录模板是DNA的正链。
7.基因Tsix转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤如下: 51.提取待检基因总RNA； 52.将步骤SI的RNA反转录为cDNA； 53.设计Tsix基因的引物TsixF2和TsixR2； 54.利用SI核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2进行PCR，根据PCR产物的电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链； 55.如果Tsix基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下: 551.去除步骤SI的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2进行链特异RT-PCR，得到反转录产物cDNA ； 552.以产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2，进行PCR扩增； 553.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链； 其中，所述引物TsixF2的序列如SEQ ID N0.3所示；TsixR2的序列如SEQ ID N0.4所示； 步骤S4所述根据PCR产物的电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是:如果电泳结果显示无Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为单链，即Tsix基因为单向转录；如果电泳结果显示有Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为双链，即Tsix基因为双向转录； 步骤S53所述根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是:如果电泳结果显示只有引物TsixF2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixR2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物TsixR2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixF2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的正链。
8.权利要求6所述基因β-actin转录方向和转录模板的系统检测方法在制备基因β -actin转录方向和转录模板检测试剂盒中的应用。
9.权利要求7所述基因Tsix转录方向和转录模板的系统检测方法在制备基因Tsix转录方向和转录模板检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104017894SQ201410282616
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】张丽, 张细权, 聂庆华 申请人:华南农业大学