海马的鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。本发明要解决的技术问题，是提供一种海马的鉴定方法。本发明海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：a、提取海马总DNA；b、PCR扩增：对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；c、PCR产物测序；d、序列比对，确定海马种类。本发明海马的鉴定方法不受形态特征的限制，能在缺少形态特征而无法利用传统形态分类法进行海马物种的鉴别，同时具有准确性高等优点，为我国海马的系统学和海马资源研究提供科学依据，为海马资源的生物多样性用和资源保护提供可靠依据。
【专利说明】海马的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]目前，中药材主要有以下几种常用鉴定手段:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等，而这些鉴定方法存在一定的缺陷:(I)中药材的表型可塑性和遗传可变性容易导致鉴定结果错误；(2)受生物性别和发育阶段的限制；(3)无法准确鉴定许多群体中存在的隐存分类单元；(4)现代互式鉴定系统要求较高的专业技术知识和经验，化学方法多不能用于物种鉴别。同时我国关于海马的系统学和形态学研究几乎为零。《中国鱼类系统检索》中根据较为简单的形态特征对我国海马属的6个种进行了分类，不能称为我国海马形态鉴定的重要依据；2010年《中国药典》对所收载的5个种进行了形态学描述，除H.kelloggi的描述较为详细外，其他4个均较为简略，不能有效的进行准确鉴别；《中国动物志》.海龙科也尚未出版，不能对我国海马属的动物准确物种鉴定有指导作用。
[0003]综上，由于传统形态学易受个体外观形态和鉴定者主观意识的影响的局限性，因此选择稳定性高、通用性强、高效快捷的海马的鉴定方法对市售海马商品种进行准确鉴定和分类研究，根据研究结果完善和修订市售海马药材的传统形态鉴定，从而改善海马药材混乱的销售现状，加 强海马药材的质量控制，提高海马的临床疗效和临床用药安全，具有积极意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题，是提供一种海马的鉴定方法。
[0005]本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤:
[0006]a、提取海马总DNA ；
[0007]b、PCR扩增:对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；
[0008]C、PCR产物测序；
[0009]d、序列比对，确定海马种类。
[0010]其中，COI指的是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I，以COI这个特定的片段为DNA条形编码的基础，用于物种鉴定，又称为DNA条形码技术。
[0011]进一步的，提取海马总DNA的方法可以采用常用的DNA提取方法，如改良CTAB法、高盐法、SDS法、蛋白酶K法(酹一氯仿抽提法)和试剂盒法等，但为了提高提取效果，本发明优选采用试剂盒法提取海马总DNA。
[0012]进一步的，引物的扩增效率是评价COI基因是否能够成为DNA条形码标准基因的重要依据，本发明海马的鉴定方法，所述b步骤中PCR扩增的引物为FishFl、FishF2、FishRl和 FishR2 ;其中，FishFl 序列如 Seq ID N0.1 所示，即 FishFl:5’ -TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’ ；FishF2 序列如 Seq ID N0.2 所示，即 FishF2:5’ -TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’ ；FishRl 序列如 Seq ID N0.3 所示，即 FishRl:5’ -TAGACTTCTGGGTGGCCAMGAATCA-3’ ；FishR2 序列如 Seq ID N0.4 所示，即 FishR2:5’ -ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
[0013]进一步的，为了提高PCR扩增效率和增强PCR扩增效果，本发明海马的鉴定方法中 PCR 扩增体系为 25 μ 1，其中，2XPCRMixMasterl2.5ul, FishFl lul，FishF2 lul，FishRllul, FishR2 lul，海马总 DNA2ul, ddH20 补足至 25ul。
[0014]进一步的，为了获得高浓度的扩增产物，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增反应程序为:95°C预变性 2min ；94°C 0.5min ；50°C 0.5min ；72°C Imin ;共 35 个循环；72°C延伸IOmin0
[0015]进一步的，为了检测海马总DNA满足PCR扩增的要求，在a、b步骤之间，优选对海马总DNA采用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。
[0016]同样地，为了检测PCR产物浓度是否满足测序要求，在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0 %的琼脂糖凝胶在恒压150V、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min。
[0017]进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
[0018]本发明有益效果:
[0019](I)不受形态 特征的限制，能在缺少形态特征而无法利用传统形态分类法的情况下进行海马物种的鉴别；
[0020](2)不受个体性别和发育阶段的限制，本发明海马的鉴定方法可排除物种的表型可塑性和遗传可变性等影响因素，在DNA分子水平上提供一种可靠的分类依据；
[0021](3)不受研究者的专业水平限制，未掌握形态分类学知识的研究者应用本方法也可对海马物种进行鉴定；
[0022](4)为我国海马的系统学和海马资源研究提供科学依据，为海马资源的生物多样性用和资源保护提供可靠依据；
[0023](5)可以改善市售海马混乱的流通现状、加强海马药材质量标准的控制、加速海马药材质量标准的建立，同时提高了海马的临床用药安全。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1:不同DNA提取方法DNA提取效果对比图；
[0025]其中，M-DL2000，1-试剂盒法，2_改良的CTAB法，3-SDS法，4-蛋白酶K法，5-高
盐法；
[0026]图2:试剂盒法DNA提取效果图；
[0027]其中，M-DL2000,1-H.trimaculatus, 2-H.kelloggi, 3-H.histrix, 4-H.comes,5-H.1ngens ；
[0028]图3蛋白酶K法DNA提取效果图；
[0029]其中，M-DL2000，1-H.trimaculatus, 2-H.kelloggi，3_Η.histrix, 4-H.comes，5-H.1ngens ；
[0030]图4:所有样品的DNA提取图；
[0031]其中，M-DL2000；1-H.trimaculatus, 2-H.kelloggi, 3-H.histrix, 4-H.comes,5-H.1ngens ；6-H.Jayakaris，7_H.reidi, 8-H.erectus, 9-H.spinosissimus，10—H.fuscus，11-H.algiricus，12-H.angustus，13-H.barbouri，14-H.kuda，15-H.brewicep ；
[0032]图5:不同引物PCR扩增效果凝胶电泳图；
[0033]其中，M-DL2000，1_空白对照，2和4_第二组引物，3和5_第一组引物；
[0034]图6:温度梯度考察凝胶电泳图；
[0035]其中，M-DL2000,1-45°C，2-45.7 °C，3-46.7 °C，4-48.1 °C，5-50.2 °C，6-51.6 °C，7-52.6 °C，8-53 °C，9-空白对照；
[0036]图7:市售海马商品药材PCR扩增结果图；
[0037]其中，M-DL2000,1和 2-H.fuscus, 3 和 4-H.1ngens, 5 和 6-H.spinosissimus, 7和 8-H.kuda,9 和 10-H.erectus,11 和 12-H.brewiceps,13 和 14-H.angustus,15 和 16-H.barbouri,17 和 18-H.comes,19 和 20-H.reidi ；
[0038]图8:市售海马商品药材PCR扩增结果图；
[0039]其中，M-DL2000，21和 22—H.histrix, 23 和 24-H.algiricus, 25 和 26-H.Jayakaris,27 和 28-H.trimaculatus,29 和 3O-H.kelloggi ；
[0040]图9:9种市售海马商品种线粒体COI基因NJ树；
[0041]图10:9种市售海马商品种线粒体COI基因NJ树；
[0042]图11:海马药材情况图；
[0043]其中:①-S01，②-S02，③-S03;
[0044]图12:DNA提取结果图；
[0045]其中，M-DL2000，1-S01，2-S02，3-S03；
[0046]图13:PCR扩增结果图；
[0047]其中，M-DL2000，1-S01，2-S02，3-S03，4_空白对照。
【具体实施方式】
[0048]本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤:
[0049]a、提取海马总DNA ；
[0050]b、PCR扩增:对海马总DNA进行PCR扩增，得COI基因序列；
[0051]C、PCR产物测序；
[0052]d、序列比对，确定海马种类。
[0053]其中，COI指的是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I，以COI这个特定的片段为DNA条形编码的基础，用于物种鉴定，又称为DNA条形码技术。
[0054]进一步的，提取海马总DNA的方法可以采用常用的DNA提取方法，如改良CTAB法、高盐法、SDS法、蛋白酶K法(酹一氯仿抽提法)和试剂盒法等，但为了提高提取效果，本发明优选采用试剂盒法提取海马总DNA。
[0055] 进一步的，引物的扩增效率是评价COI基因是否能够成为DNA条形码标准基因的重要依据，本发明海马的鉴定方法，所述b步骤中PCR扩增的引物为FishFl、FishF2、FishRl和 FishR2 ;其中，FishFl 序列如 Seq ID N0.1 所示，即 FishFl:5’ -TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’ ；FishF2 序列如 Seq ID N0.2 所示，即 FishF2:5’ -TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’ ；FishRl 序列如 Seq ID N0.3 所示，即 FishRl:5’ -TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’ ；FishR2 序列如 Seq ID N0.4 所示，即 FishR2:5’ -ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。
[0056]进一步的，为了提高PCR扩增效率和增强PCR扩增效果，本发明海马的鉴定方法中 PCR 扩增体系为 25 μ 1，其中，2XPCRMixMasterl2.5ul, FishFl lul，FishF2 Iul，FishRlIul，FishR2 Iul，海马总 DNA2ul, ddH20 补足至 25ul。
[0057]进一步的，为了获得高浓度的扩增产物，本发明海马的鉴定方法中PCR扩增反应程序为:95°C预变性 2min ；94°C 0.5min ；50°C 0.5min ；72°C Imin ;共 35 个循环；72°C延伸IOmin0
[0058]进一步的，为了检测海马总DNA满足PCR扩增的要求，在a、b步骤之间，优选对海马总DNA采用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min，在全自动凝胶成像仪中对胶板进行拍照。 [0059]同样地，为了检测PCR产物浓度是否满足测序要求，在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0 %的琼脂糖凝胶在恒压150V、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min。
[0060]进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
[0061]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0062]实施例1
[0063]进一步的，将PCR扩增得到的序列与基因库中的海马序列进行比对，以此鉴定海马的物种。
[0064]本实施例中海马药材为干品，购于成都市荷花池中药材专业市场、河北安国中药材专业市场、安徽亳州中药材专业市场(以下简写为荷花池、安国、亳州)，具体情况如表1 ;取样依据是海马的表型特征，海马分类主要参考Lourie等的海马分类和鉴别方法(LourieS A, Vincent ACJ, Hall H J.Seahorses: an identification guide to the world’s speciesand their conservation [M].Project Seahorse, 1999 ；Foster S J, Cooper EffT, Vincent AC J.A guide to the identification of seahorses [M].Project Seahorse and TRAFFIC NorthAmerica, 2004)。
[0065]表1本实验所用的海马样本种类、采集地及拉丁名
[0066]
【权利要求】
1.海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: a、提取海马总DNA； b、PCR扩增:对海马总DNA进行PCR扩增，扩增产物为COI基因序列； c、PCR产物测序； d、序列比对，确定海马种类。
2.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于:所述a步骤采用试剂盒法提取海马总DNA。
3.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于:所述b步骤中PCR扩增的引物为 FishFl、FishF2、FishRl 和 FishR2 ;其中，FishFl 序列如 Seq ID N0.1 所示，FishF2 序列如Seq ID N0.2所示，FishRl序列如Seq ID N0.3所示，FishR2序列如Seq ID N0.4所示。
4.根据权利要求3所述的海马的鉴定方法，其特征在于:所述PCR扩增体系为25μ 1，其中，2XPCRMixMasterl2.5ul, FishFl lul, FishF2 lul, FishRl lul, FishR2 lul，海马总DNA 2ul, ddH20 补足至 25ul。
5. 根据权利要求4所述的海马的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为:95°C预变性 2min ；94°C 0.5min ；50°C 0.5min ；72°C Imin ;共 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
6.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于:在a、b步骤之间，还对海马总DNA进行电泳检测，其采用浓度为1.0 %的琼脂糖凝胶在恒压150v、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min。
7.根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于:在b、c步骤之间，还对PCR产物进行电泳检测，其采用浓度为1.0 %的琼脂糖凝胶在恒压150V、电流400mA的条件下进行电泳，电泳时间为10~20min。
【文档编号】C12Q1/68GK104017899SQ201410294756
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】国锦琳, 温珑莲, 侯飞侠, 万德光, 彭成 申请人:成都中医药大学