一种用于运动性心脏意外筛查的snp复合检测体系的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，利用美国贝克曼超高通量SNP分型检测平台（BeckmanGenomeLabSNPstreamUHTGenotypingSystem）进行早期筛查遗传性心血管疾病，属于生物检测【技术领域】。本发明包括多重PCR引物和SNP标签引物设计、多重PCR扩增体系体系与程序、SNP延伸反应液、SNP延伸反应程序。本发明根据国内外运动性心脏意外基因最新研究，建立了5种遗传性心血管疾病、13个相关基因、37个突变位点的快速、准确、高通量检测方法，弥补了常规赛前心血管系统体检指标不够完善和敏感低的缺点，在运动性心脏意外的早期诊断、筛查、预防等方面具有很好的应用前景。
【专利说明】一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系
[0001]
【技术领域】： 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及肥厚性心肌病（HCM)、致心律失常性右室发育不 良（AVRD)、遗传性LQT综合症（LQT)、短QT综合症（SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动 过速（CPVT) 5种遗传性心血管疾病早期筛查诊断方法，可用于上述5种疾病、13个相关基 因、37个突变位点的快速、准确、高通量检测。
【背景技术】
[0002] 运动性心脏意外作为体育运动人群在运动中发生的心血管事件，严重威胁着人类 的生命，越来越引起世人的关注和研究的兴趣。近年体坛不断传来的优秀运动员猝死事件， 更是撼人心弦。尽管运动性心脏意外与其他疾病相比，发生率并不高，但因其直接危及"健 康人"的生命，给人们的印象和震撼很深。遗憾的是即使进行了赛前健康检查和心血管结构 和功能评估，由于现有方法学的限制，也不能正确地排查出一些存有潜在运动性猝死隐患 的运动员，一些体检正常的运动员也有发生猝死的现象。最近，Maron等人的调查进一步证 实这一问题，其调研的115名猝死的运动员都经过了赛前健康检查，仅有4名运动员（占总 人数的3% )被怀疑有心脏病，可见，目前即使对运动员进行常规赛前健康检查，现有的心 血管系统的筛检指标仍然不够完善和敏感，很多潜在的心血管系统隐患问题仍不能得到早 期诊断。遗传流行病学研究表明，运动性心脏意外具有较高的遗传度。许多心脏猝死与某些 基因多态性相关，比如α 2肾上腺素能受体B亚型（a 2B-ADR)、血管紧张素转换酶（ACE)、 离子通道基因（HERG)及内皮素-l(ET-l)等基因。因此，有必要建立一种新型敏感的运动 性心脏意外早期诊断方法，以期达到筛选高风险个体，以达到预测、预防运动性心脏意外， 保护高危人群的作用。
[0003] 贝克曼超高通量SNP基因分型平台（Beckman GenomeLabSNPstream UHT Genotyping System)是一套自动化的多重SNP分析系统，在特制3別孔板的每个微孔中可 分析12个或48个SNP位点。该系统已广大应用于遗传图谱标记的绘制、疾病诊断和疾病 易感基因的鉴别、药物代谢和药物遗传学、法医鉴定和个体识别等遗传相关研究和应用领 域。其特点是：准确--采用贝克曼独家专利的单碱基引物延伸SNP(SNP-it)检测技术， 准确率高达99%以上，通过集成的综合软件使质控和数据统计一体化，全程100%质量控 制；快速--灵活的多路线技术与先进的自动化操作保证每天可以处理4, 6〇〇-3, 000, 000 个基因型；高转化率--般认为约有50%的基因或者序列并不适合基于荧光定量PCR的 方法，但该方法转化率高达85%，可以弥补这一缺陷；超低样本量--每个基因型检测仅需 0. 04ng 的 DNA。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能够快速、准确、高通量筛查运动性心脏意外的SNP 复合检测体系。涉及肥厚性心肌病（HCM)、致心律失常性右室发育不良（AVRD)、遗传性LQT 综合症（LQT)、短QT综合症（SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速（CPVT) 5种遗传性 心血管疾病早期筛查诊断方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 1、运动性心脏意外相关的基因 SNP标记数据库的建立 (1)通过综合分析国内外运动性心脏意外相关研究，筛选出7种主要与运动性心脏意 外相关遗传疾病：肥厚性心肌病、致心律失常性右室发育不良、扩张型心肌病、马方综合症、 遗传性LQT综合症、短QT综合症、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速。 ^005] (2)通过选择基因型和表型关系密切，缺乏早期诊断技术的遗传疾病作为基因 芯片设计候选疾病，共筛出5种疾病：肥厚性心肌病（HCM)、致心律失常性右室发育不良 (AVRD)、遗传性LQT综合症（LQT)、短QT综合症（SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过 速（CPVT)。
[00^6]、（3)综合国内外运动性心脏意外相关遗传性疾病的基因研究文献，并通过生物信 息学方法^美国国家生物技术信息中心（NCBI)的核酸序列数据库（GenBank)和最新的人 类孟德尔遗传病数据库（ 0MIM)中寻找出与运动性心脏意外密切相关的13个基因及其37 个突变位点，建立了运动性心脏意外相关基因标记数据库。 _7]表1运动性心脏意外SNP基因标记数据库
【权利要求】
1. 一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于，包括37个SNP位 点、多重PCR引物组、SNP标签引物组， 所述多重PCR引物组中包括与所述37个SNP位点--对应的37对扩增引物，每对多 重PCR引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷 酸序列； 所述SNP标签引物组中包括与所述37个SNP位点--对应到37条SNP标签引物； 所述 37 个 SNP 位点包括：CASQ2 (LEU167HIS)、CASQ2 (ASP307HIS)、DSG2 (ARG45GLN)、 DSG2 (ARG48HIS), DSG2 (VAL55MET), DSG2 (CYS506TYR), DSG2 (GLY811CYS), KCNE1 (SER74LEU), KCNQ1 (GLY189ARG), KCNQ1 (VAL307LEU), KCNQ1 (ALA341VAL), KCNQ1 (GLY589ASP), MYH7 (MET349THR), MYH7 (ARG663CYS), PKP2 (N852FSX930), RYR2 (PR02328SER)、RYR2 (ASN2386ILE)、RYR2 (VAL4653PHE)、RYR2 (ALA4860GLY)、TGFB3 (-36G-A，5-PRME UTR)、rs28934270、rsl6991652、rs74315447、rs74315448、rsl6991654、 KCNQ1 (LEU191PR0), KCNQ1 (PHE275SER), KCNQ1 (SER277LEU), TNNT2 (ILE79ASN), TNNT2 (ARG92GLN)、TNNI3 (LYS206GLN)、rs77615401、RYR2 (SER2246LEU)、RYR2 (ARG2474SER)、 RYR2 (ASN4104LYS)、RYR2 (ARG4497CYS)、rs72546668。
2. 根据权利要求1所述的用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于， 所述的扩增引物组为序列表中SEQ IN No. 1至SEQ IN No. 74的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于， 所述的SNP引物组为序列表中SEQ IN No. 75至SEQ IN No. 111的核苷酸序列。
【文档编号】C12Q1/68GK104232773SQ201410476562
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】高晓嶙 申请人:国家体育总局体育科学研究所