克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，通过序列的合成、克隆载体、目的片段和载体的连接、质粒转化以及重组质粒的提取、冻干保存等步骤制得克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，本发明制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为克里米亚-刚果出血热病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对克里米亚-刚果出血热病毒的快速准确检测提供了标准样品。
【专利说明】克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方 法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 克里米亚-刚果出血热是欧、亚、非三大洲都有分布的蜱媒自然疫源性病毒疾 病。人群普遍易感，感染发病以青壮年为多，但也有2. 5?3岁婴幼儿被感染。临床表现与 其他型出血热相似,惟肾脏的损伤较为轻微。患者入院时多呈重症,病死率高达50%。本病 因在克里米亚和刚果相继发现而得名。在国内首先发现于新疆巴楚，故我国又称新疆出血 热。
[0003] 目前，克里米亚-刚果出血热病毒的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散 技术、分子生物学等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以 其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学 检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检 验流程时限缩短，难以保证实验室的质量控制。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明研制一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样 品，可用于特征序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。
[0005] 本发明所述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要 包括如下步骤： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一个T7启动 子； 2) 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化； 3) 目的片段和载体的连接反应； 4) 通过感受态细菌转化质粒； 5) 重组质粒提取； 6) 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测； 7) 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度， 然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于_80°C冰箱保存。
[0006] 上述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中 还包括重组质粒的鉴定：即从步骤4)得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养 基中培养，提取质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。
[0007] 上述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中 还包括核酸序列测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行 同源性分析。
[0008] 本发明所获得的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，即为含有 Sequence NO. 1的核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。
[0009] 进一步地，上述步骤2)所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入 PUC19质粒中；酶切鉴定选择feoR 1和油<31作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37°C，反应 l-2h，反应体系为 DNA 16 μ L，IOX buffer 2 μ L，feoRI 1 μ L，ZhI 1 μ L ;酶切产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。
[0010] 进一步地，上述步骤3)所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为 16°C，反应16h，反应体系为：步骤2)得到的纯化产物1 μ L，合成序列X μ L :其与载体的 摩尔比为 3?20 :1，T4 Ligase 1 μ L，IOX Ligase solution 1 μ L，加去离子水补齐至 10 μ L。
[0011] 进一步地,上述步骤4)所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加 到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3)得到的连接反应液，加到含DH5 α感受态细菌的 管中，轻混匀，冰上静置30min，42°C热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB 培养基，37 °C，225rpm，培养Ih得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37 °C 倒置培养16h。
[0012] 本发明是基于病毒的RNA序列与cDNA序列互补的原理基础之上，利用DNA合成 技术合成病毒的特征核酸序列，将其克隆入质粒载体中，制备出一种包含病毒特征序列信 息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定 性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为克里米亚-刚果出血热病毒检 测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控 制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对克里米亚-刚果出血热病毒的快速 准确检测提供了标准样品。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1质粒酶切电泳图，图2重组质粒测序图，图3序列比对报告。
【具体实施方式】
[0014] 实验材料：pUC19质粒、琼脂糖、限制性内切酶feoR I和油al、T4 Ligase试剂 盒、胶纯化试剂盒、DH5a菌株、LB培养基购于大连宝生物工程有限公司，Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System 购自 promega 公司。
[0015] 实施例1 :标准样品的制备 1.合成序列：利用软件Clone Manager 7.0从GenBank上下载公开发布的序列，进行 同源性分析和引物匹配，分析确定拟合成的病毒序列：CC TAT ATA CGA GTG TGC TTG GGC TAG CTC CAC TGG CAT TGT TM GM GGG GCT GGA GTG GTT CGA AM AM TGC AGG AAC CAT TM ATC TTG GGA TGA GAG TTA CAC TGA GCT GM AGT TGA AGT TCC CM AAT AGA ACA ACT TTC CM CTA CCA ACA GGC TGC TCT CM GTG GAG GM AGA CAT AGG CTT CCG TGT CAA TGC AM CAC GGC AGC TTT AAG TM CM GGT CCT TGC AGA ATA CM AGT TCC TGG CGA AAT TGT GAT GTC TGT CM AGA GAT GTT GTC AGA TAT GAT TAG AAG GAG GM CCT GAT TCT CAA CAG AGG TGG TGA TGA AM CCC ACG CGG CCC AGT CAG CCG TGA GCA TGT GGA GTG GTG TAG GGA ATT TAT CAA AGG CAA GTA CAT MT GGC TTT TM CCC ACC TTG GGG GGA CAT CM CM GTC AGG CCG TTC AGG AAT AGC ACT CGT TGC MC AGG CCT TGC CAA GCT TGC AGA GAC TGA，序 列合成委托公司完成；为便于将病毒核酸序列体外转录成RNA，在每段序列前增加一个T7 启动子，序列 20bp :TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ; 2. 将合成序列平端克隆入pUC19质粒并通过酶切鉴定及胶纯化：将序列克隆入pUC19 质粒中，经序列酶切位点分析,选择AcoR I和油<31作为质粒载体的克隆位点进行酶切，如 图1所示，37°C，反应l_2h，反应体系如下：
【权利要求】
1. 克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一个17启动 子； 2) 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化； 3) 目的片段和载体的连接反应； 4) 通过感受态细菌转化质粒； 5) 重组质粒提取； 6) 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测； 7) 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度， 然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于_80°C冰箱保存。
2. 根据权利要求1所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方 法，其特征在于，所述步骤还包括重组质粒的鉴定：从步骤4)得到的菌液中取1-3个菌落， 接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 筛选阳性克隆。
3. 根据权利要求2所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方 法，其特征在于，所述步骤还包括核酸序列测定及序列对比分析：将经PCR鉴定为阳性重组 质粒的细菌测序并进行同源性分析。
4. 由权利要求1所述方法制备的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品， 即含有Sequence NO. 1的核苷酸序列的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，其特征 在于，所述重组载体为质粒。
6. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤2)所述克隆和纯化 的具体步骤为：将序列平端克隆入PUC19质粒中；酶切鉴定选择feoR 1和油<31作为质粒载 体的克隆位点进行酶切，37°C，反应l_2h，反应体系为DNA 16iiL，10X buffer 2iiL，feoR I 1 y L，油al 1 y L ;酶切产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。
7. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤3)所述目的片段和 载体的连接反应具体步骤为：条件为16°C，反应16h，反应体系为：步骤2)得到的纯化产物1 yL，合成序列 X iiL:其与载体的摩尔比为 3?20:1，T4 Ligase liiL，10X Ligase solution 1 U L，加去离子水补齐至10 ii L。
8. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤4)所述感受态细菌 转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3)得到的 连接反应液，加到含DH5 a感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42°C热激90s，不要 摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37°C，225rpm，培养lh得转化液；取转化 液涂布于含氨节的LB固体培养基上，37°C倒置培养16h。
【文档编号】C12Q1/70GK104404168SQ201410598599
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】李云峰, 薛芳, 崔丽伟, 于畅 申请人:薛芳