一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于病毒体外检测【技术领域】，具体为一种HBVDNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。本发明提供检测试剂盒，包括PCR反应引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.3与探针SEQIDNo.2；SEQIDNo.4、SEQIDNo.6与探SEQIDNo.5；SEQIDNo.7、SEQIDNo.9与探针SEQIDNo.8；作为内参反应引物：SEQIDNo.10、SEQIDNo.12与探针SEQIDNo.11，以及竞争性探针：SEQIDNo.13～SEQIDNo.16。使用时提取人血浆样本DNA，采用复合荧光多重PCR技术在数字PCR芯片微孔中对靶DNA进行扩增；显示蓝色荧光的微孔数即为总反应体系中HBVDNA定量结果。本发明用于HBV定量检测，快速、简便、灵敏度高、特异性强，适于大规模推广应用。
【专利说明】-种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒体外检测【技术领域】，具体涉及一种JffiV DNA数字PCR定量检测试 剂盒及其应用。 技术背景
[0002] 慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB)是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)在人肝细胞中慢性感染所致的一种肝脏炎症疾病，其持续进展可导致肝硬化、 肝功能衰竭及肝癌。据估计，全世界目前有HBV携带者约3. 5亿人，每年约有100万人死于 HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中华医学会肝病分会和中国医学会感 染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我国现有的慢性HBV感染者约 9300万，其中CHB患者超过2000万。
[0003] 对于CHB，无论是中国版的还是欧洲肝病协会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》均 指出，抗病毒治疗是最重要的治疗措施。在CHB的抗病毒治疗中，核苷(酸）类似物(包括拉 米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺夫韦酯等）以其口服方便、抗病毒疗效确切 成为CHB患者中应用最为广泛的一类药物，其中恩替卡韦及替诺福韦酯为国内外指南推荐 的一线用药。
[0004] 无论是采用核苷(酸）类似物还是干扰素等进行抗HBV治疗，其抗病毒疗效监测均 需要对CHB患者外周血中的病毒载量进行检测，即HBV DNA定量检测。在国内外相关的治疗 指南中均指出，无论是采用何种抗HBV治疗方案，均需要采用HBV DNA定量检测的方法对抗 HBV疗效进行评估，理想状态下，需将CHB患者外周血中的HBV DNA控制在现有检测手段检 测不到的水平。当前，国内外进行HBV DNA定量检测采用的方法均为实时荧光PCR方法。国 际公认的HBV DNA定量检测方法是罗氏公司生产的、在国际上具有参比价值的Roche COBAS TaqMan HBV Test检测试剂盒。依据这一定量方法，美国肝病协会指出，在抗HBV治疗中， HBV DNA定量水平应尽可能小于或等于10 IU/ml，欧洲肝病研究协会则指出，将HBV DNA定 量水平控制在10-15 IU/ml可有效防止疾病复发。在我国CFDA于2013年5月发布的《乙 型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则》中则建议HBV DNA定量检 测试剂的最低检出限应小于或等于30 IU/ml。
[0005] 然而，我国CFDA早期批准的HBV DNA定量检测试剂，其灵敏度均在500 IU/ml以 上，难以达到慢性乙型肝炎临床诊疗和我国法规的最新要求。2009年有学者以Roche试剂 盒为参照，对我国已批准上市的几种HBV DNA定量检测试剂进行了评估，结果表明，5种试 剂盒在IXlO4 -IX IO8 IU/ml范围内，各种试剂盒的符合率较高。2013年中国食品药品 检定研究院的学者以Roche HBV DNA定量检测试剂为参照，对一检测灵敏度为500 IU/ml 的国产HBV DNA定量检测试剂的质量进行了评估，在193份HBsAg阳性的样本中，Roche试 剂盒检出HBV DNA的样本占到了 95%，而国产试剂则仅为70% ;而在122份HBsAg阴性的样 本中，Roche试剂检出约31%的样本HBV DNA呈阳性，其中包括6份"两对半"结果均呈阴性 的样本，而国产试剂在这122份样本中未检出1例呈HBV DNA呈阳性。这样的结果显示国 产试剂盒质量有待进一步提高，最为重要的是要提高国产试剂盒对HBV DNA的检测灵敏度。
[0006] 研究表明，HBV虽然是一种DNA病毒，但由于HBV DNA聚合酶本身无3'到5'端校 正功能，HBV DNA在复制过程中的自发突变率较高。依据HBV DNA序列的相似性，HBV至少 可分为A、B、C、E、F、G、H等7种基因型。中国慢性乙型肝炎患者中，则以C型和B型为主。 在传统的HBV DNA实时荧光PCR检测试剂中，虽然在进行引物设计时，会考虑到不同基因型 HBV间的保守性，但考虑到HBV自身高自发突变率，一套引物与探针对不同的基因型的覆盖 率是有限的，除检测试剂自身的灵敏度外，这可能也是国产HBV DNA实时荧光PCR检测试剂 漏检率高的重要原因之一。要提高对不同基因型HBV的覆盖，一个可行的方案是通过多重 PCR进行检测，即在HBV DNA多个保守区域同时进行检测。由此而带来的另一个问题是，荧 光信号强度与HBV DNA的量间的关系将不可避免地出现异化。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是针对上述对HBV DNA检测灵敏度的更高需求(包括现实需求和 法规要求)，提供一种检测快速、简便，特异性强、灵敏度高的HBV DNA数字PCR定量检测试 剂盒及其应用。
[0008] 根据HBV DNA数字PCR定量检测要求，本发明首先设计HBV DNA特异性引物、检测 探针和竞争性探针，具体如下：
【权利要求】
1. 一种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，其特征在于包括：第一引物容 器、第二引物容器、第三引物容器、第四引物容器；这些容器中具有探针组合物中对应的引 物对和探针： 第一引物容器内具有第一 PCR引物对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列； 第二引物容器内具有第二PCR引物对SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序 列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列； 第三引物容器内具有第三PCR引物对SEQ ID No. 7)和SEQ ID No. 9所示的核苷酸 序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列； 第四引物容器内具有第四PCR引物对SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示的核苷酸 序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列； 其中，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 8 荧光素标记为 FAM，SEQ ID No. 11 突光素标记为VIC。
2. 如权利要求1所述试剂盒在HBV DNA数字PCR定量检测中的应用，其特征在于具体 步骤为： (1) 提取人血浆样本中的DNA，包括HBV DNA与游离的人基因组DNA ; (2) 采用试剂盒中的引物与探针，通过复合荧光多重PCR引物在数字PCR检测芯片微孔 中对靶DNA进行PCR扩增； (3) 检测芯片微孔荧光情况：在检出绿色荧光微孔的情况下，计数蓝色荧光微孔数即为 总反应体系中HBV DNA定量结果。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于当蓝色荧光检测微孔数大于10000时，将上 样模板稀释1〇〇倍后重新进行检测。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为： 2X PCR反应缓冲液，包括了 Taq酶、dNTP、镁离子 7. 25微升 10X HBV DNA检测用引物、探针组合 1. 45微升 去离子水 0. 80微升 模板DNA 5. 00微升 总反应体积 14. 50微升 PCR反应条件为： 96度变性10分钟，然后60度2分钟、98度变性30秒，共39个循环，之后60度保温2 分钟，反应结束后进行FAM和VIC荧光信号检测。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述多重PCR反应体系中，各引物探针的优 选反应浓度依次为： SEQ ID No. 1 300nmol/L SEQ ID No. 2 lOOnmol/L SEQ ID No. 3 300nmol/L SEQ ID No. 4 300nmol/L SEQ ID No. 5 lOOnmol/L SEQ ID No. 6 300nmol/L SEQ ID No. 7 300nmol/L SEQ ID No. 8 lOOnmol/L SEQ ID No. 9 300nmol/L SEQ ID No. 10 350nmol/L SEQ ID No. 11 lOOnmol/L SEQ ID No. 12 350nmol/L SEQ ID No. 13 80nmol/L SEQ ID No. 14 80nmol/L SEQ ID No. 15 80nmol/L SEQ ID No. 16 80nmol/L 。
【文档编号】C12Q1/70GK104450963SQ201410733794
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】赵书民, 赵翊均, 周巍 申请人:上海五色石医学研究有限公司