褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母Y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途

本发明属于水果采后病害生物防治，具体涉及褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途。

背景技术：

1、苹果，学名malus domestica borkh，是蔷薇科苹果亚科苹果属植物，富含矿物质、维生素、多酚、黄酮类和微量元素等，是一种营养价值很高的水果，受到消费者的广泛喜爱。然而苹果在采后、储运、加工、销售过程中由于不当操作极易受到机械损伤，从而导致其受到病原菌的侵染，导致苹果的腐烂，由此造成了巨大的经济损失。

2、苹果采后常见的病害主要有灰葡萄孢(botrytis cinerea)引起的灰霉病和扩展青霉(penicillium expansum)引起的青霉病。其中青霉病是苹果采后贮藏期间最常见的病害，造成了苹果产业巨大的经济损失，其不仅会造成苹果果实的腐烂，而且分泌产生的次级代谢产物展青霉素(patulin，pat)有致畸、致癌和致突变性，严重威胁人类健康。因此，采取有效、环保的方法控制苹果在采后贮藏运输期间的腐烂，加快我国水果产业快速良好的发展，具有较大的社会效益和经济价值。

3、目前针对苹果采后病害的控制方法主要包括物理法、化学法、和生物防治法。化学法因其低廉、高效、方便使用的特点成为目前最常用的方法。苯菌灵、乙磷铝、二氧化硫、噻菌灵、咪唑等都是常见的化学杀菌剂，然而随着人们安全意识的提高，化学杀菌剂由于安全性差、污染环境等问题逐渐被淘汰。物理法主要包括低温贮藏、气调贮藏、热处理、辐射等。物理法相比于化学法无化学品残留，无污染，对人体无害，但其设备成本高、工业化难度大，处理不当还可能会导致水果感官品质下降。因此新型绿色、环保的生物防治逐渐成为当下研究的热点。生物防治法是利用拮抗微生物来控制水果的采后病害，拮抗酵母以其来源广泛、对营养条件要求低、生长迅速、安全性高等优势，在水果采后病害生物防治方面应用广泛。但相较于传统化学杀菌剂，拮抗酵母的防治效率较低，如何提升其生防效力是亟需解决的问题。

4、褐藻寡糖(alginate oligosaccharide，aos)，粉末状，能溶于水，稳定性强，是一种由褐藻胶裂解反应得到的功能性寡糖，可降血糖、降血脂、抗炎症、诱导动植物提高抗病能力，且环境相容性好、安全性高，广泛应用于在医药、食品、农业等行业。但目前将褐藻寡糖用于诱导拮抗酵母防治苹果青霉病的相关研究还鲜有报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明旨在解决上述问题之一；目的是利用褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3(debaryomyces hansenii y3)提高其对苹果采后病害的生防效力，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。

2、为了实现以上目的，本发明的具体步骤如下：

3、汉逊德巴利酵母的拮抗效力较强，对人体安全无害。该汉逊德巴利酵母y3的保藏信息具体如下：保藏号为cctcc no:m 2021610；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期：2021年5月26日。

4、褐藻寡糖是一种由褐藻胶裂解反应得到的功能性寡糖，环保无害，应用广泛；经研究证明，褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3可显著提高其对苹果采后病害的生防效力，降低苹果采后的自然腐烂率的同时对苹果品质无不良影响，可达到水果贮藏保鲜的目的，实现了意想不到的突出效果。

5、本发明同时提供了褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，具体步骤如下：

6、将汉逊德巴利酵母y3接种于nydb培养基中进行活化培养，得到活化培养液；然后再取nydb培养，添加褐藻寡糖得到混合培养液，所述褐藻寡糖在混合培养液中的质量浓度为0.05％-2％；最后将活化培养液接种于混合培养液中进行诱导培养，培养后经离心得到菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌水洗涤数次后，稀释制备成1×108cells/ml的酵母菌悬液；在苹果表面用无菌打孔器进行打孔，然后在每孔分别注入一定体积的酵母菌悬液，一段时间后再于每孔接种与酵母菌悬液等体积的扩展青霉孢子悬浮液，其浓度为1×105spores/ml，实现对扩展青霉引起病害的有效防治；

7、或者不对苹果进行处理，保持苹果的自然状况放入塑料筐中，将诱导培养后稀释制备的酵母菌悬液均匀喷洒于苹果表面，待苹果自然风干后放入保鲜袋中，再置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，于室温下存放，即可实现对苹果采后病害的防治及贮藏保鲜的用途。

8、其中，所述褐藻寡糖在混合培养液中的质量浓度为0.25％-0.5％。

9、其中，所述的nydb培养基(以1l计)为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000ml，ph自然，115℃灭菌20min。

10、其中，所述活化培养接种于混合培养液的接种体积比为2:100。

11、其中，所述活化培养和诱导培养的条件为：温度28℃，转速180～200rpm，时间20～24h。

12、其中，所述离心的条件为：离心力为7000g，时间5～10min。

13、其中，所述打孔的孔直径5mm，深度4mm；所述一段时间为2h。

14、其中，所述在孔中注入酵母菌悬液和扩展青霉孢子悬浮液的体积均为30μl。

15、本发明的优点：

16、(1)本发明所使用的汉逊德巴利酵母y3为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体无害。

17、(2)本发明使用褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3，与传统的nydb培养基相比，可以显著提高汉逊德巴利酵母y3的拮抗活性，从而降低苹果采后的自然腐烂率，进而达到苹果贮藏保鲜的目的，取得显著的效果。

18、(3)本发明所使用的褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3对采后苹果主要品质指标，如失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸、维生素c以及褐变度与对照组相比，无任何不良显著影响。

19、(4)本发明所使用的褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3能够显著抑制扩展青霉孢子的萌发和生长，使用褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3既可以代替化学杀菌剂防治苹果采后病害，避免化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害，也可减少使用物理杀菌贮藏所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。

技术特征：

1.褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述褐藻寡糖在混合培养液中的质量浓度为0.25％-0.5％。

3.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述的nydb培养基的组分为，以1l计：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000ml，ph自然，115℃灭菌20min。

4.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，其中，所述活化培养接种于混合培养液的接种体积比为2:100。

5.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述活化培养和诱导培养的条件均为：温度28℃，转速180～200rpm，时间20～24h。

6.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述离心的条件为：离心力为7000g，时间5～10min。

7.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述打孔的孔直径5mm，深度4mm；所述一段时间为2h。

8.根据权利要求1所述褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母y3用于苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途，其特征在于，所述在孔中注入酵母菌悬液和扩展青霉孢子悬浮液的体积均为30μl。

技术总结
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及褐藻寡糖诱导培养汉逊德巴利酵母Y3对苹果采后病害防治及贮藏保鲜的用途；步骤为：将酵母活化培养后，接种到添加有褐藻寡糖的NYDB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体，用无菌生理盐水稀释为1×10<supgt;8</supgt;cells/mL的菌悬液；在苹果表面打孔后注入菌悬液，2h后注入等体积的扩展青霉孢子悬浮液，实现对扩展青霉的有效控制；或者直接将菌悬液均匀喷洒在苹果表面，自然晾干，即可实现苹果采后病害的防治和贮藏保鲜的用途；本发明可以有效控制苹果采后由扩展青霉引起的病害和自然腐烂，同时对苹果采后主要品质指标无不良显著影响，操作方便且安全环保，具有显著的经济效益和社会效益。

技术研发人员：张红印,席溢男,杨其亚
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13