生产生物化学产品的方法

专利名称：生产生物化学产品的方法
本案为DennisD.Pietronigro，JohnL.Sternick，RobertJ.Ruemer及MaryLouMattes所发明，发明名称为检测生物化学物种的方法及装置，于1987年10月9日提出申请的共同拥有且共同待审的第107，251号申请案的部分继续。
本发明涉及于极微小体积反应小室内制造化学产品，特别是生物化学产品，尤其是活体状态细胞的新颖方法。本发明也可用来对大量特定化学产品样品就其对于大量化学产品或化学产品浓度的差异反应进行快速且有效的比较。本发明又一用途是研究与细胞膜或细胞膜内进行细胞活动相关的细胞性质。
有多种方法可用于在多个反应器内制造包括生物化学产品在内的化学产品。但很少有反应器能够使产物位于反应器内时可方便地检测出少量产物，且大部分已知反应器均相当复杂，其他一些则与已知的化学反应器无所差异，某些方法使用了包裹反应物的手段。
Symthe等人在美国第3，479，141号专利申请中描述了一种串连小室加工装置(但我们相信它未曾用来加工活的，生长与分裂中的细胞或将非生长细胞维持于良好的机械条件下来进行过程评价，或仅加工可利用气体转移的化学样品)。该案中不含无忍受力的交叉污染物的有待分析的化学样品顺着导管而运输。该专利案中并未提到其中所述的装置可用作化学反应器或用作透气性反应器装置。后来，一篇公开文献(“高速化学分析的胶囊化学技术”，Cassaday等人，临床化学，第31卷，第9期，1985年，1453页)揭示了使用融合技术合并邻近不同反应物样品而将该装置作为反应器。该文献也提到了对已知的样品污染无耐受力的分析技术。Cassaday等人的文献中引用了大量参考文献，其中包括1.SmithJ，SvenjakD，TurellJ，VlastelicaD.“随机增加”采样的创新技术，临床化学28，1867-1872(1982)。
2.SteindelS，SchoudtP.，随机增加流体技术的评价，临床研究室自动化杂志3，319-326(1983)。
3.BrombergIL，PollardA，ChengJ，RomaschinA，TechniconRA-1000随机增加分析仪的评价，临床化学30，281-283(1984)。
4.SchwartzMK，StatlandBE，CoughlinJ等人，随机增加分析仪“RA-1000”的化学与临床评价，临床化学30，364-368(1984)。
5.SnyderLR.AdlerHL.，在连续-流体分析中以分流通过玻璃管非理想模式。分析化学48，1022-1027(1976)。
6.SnyderLR.在连续流体分析中样品分散的预测与控制，自动化分析的进展，ECBarton等人编辑，Mediad公司，塔利镇，纽约1977年，76-81页。
7.ChaneyAL.流体机械学用于连续流体系统的用途，临床化学1的自动化，NBScova等人编辑，Mediad公司，白平原镇，纽约1968年，115-117页。
所有这些公开文献均列于本文的参考文献。
与上述反应器类别相当无关地，有相当数量的已知技术是有关制备有用量的例如单克隆抗体的产物的生物化学反应，例如，参考“单克隆抗体原理与实际”J.W.Goding所著一书(第二版，学术出版社，奥兰多市，佛罗里达州，1986年)。
上述对本发明背景的论述对了解本发明来说是必须的。但并不意味申请人相信引述的参考文献中所揭示的任何技术，或单独或合并的论述使得人们易知可利用这些技术来解决申请人所面对的问题。
如下所述，申请人将利用可鉴别产品制造上有用的细胞的快速手段来加速生物化学产品的生产。
本发明的一个目的是提供一种新颖方法，可用于由于某种原因而必须在一系列小室内进行利用气体的生物化学反应，且随后小室可于检测装置下移动，或至少相对移动。
本发明的另一个目的是提供一种快速制备样品的方法，以便于在活细胞及有机体共存之下检测专一配体-抗配体反应。
本发明的又一个目的是，提供制备培养样品的手段，以便快速检测与收集分泌出来的细胞，例如融合瘤细胞，及其他存在于该样品内具有特定特性的生物细胞及有机体。
本发明的还有一个目的是提供一种上述的新颖方法，可能进行功能性气体转移进或出反应小室。
本发明的另一个目的是提供一种用于浓缩由细胞所分泌出来且呈相当浓缩形式的生长因子的装置。
本发明的又一个目的是提供一种用于制造有用数量的融合瘤细胞及由这些细胞所分泌的抗体的改良方法。
本发明的又一个目的是达到上述目的，同时使每个样品长期维持合适的条件。
本发明的还有一个目的是提供一种允许加工培养由细胞快速产生的相当浓度的生物组合物的方法。
本发明的一个重要的目的是提供一种有助于研究生物化学实体，包括，例如，研案内部细胞活性及研究细胞膜本身及其上特定位置的性质的装置和方法。
本发明的其他目的对于本领域的技术人士而言，当阅读了揭示内容后将变得很明显。
上述目的大体上可通过下述方法而达到。
对于进行本发明的方法有用的装置的基本类型在Smythe等人的美国第3，479.141号专利案中已描述了，该案列入本文以供参考，因为其中对于化学组合物反应小室可被分离且顺着试管移动的方式作了概述。Smythe等人在其中发明背景一节中谈到使用其装置来运送一系列样品至试验装置中，但未曾提出有关气体运输的重要性或利用该运输以完成本文所述方法的设备。
本发明方法所用的装置的管状导管部分是模仿Smythe等人的装置，但在很多生物过程中必须采用的下列原理未曾由Smythe等人所认识或利用。
1)载体流体，它覆盖了管形导管壁，同时在反应小室周围形成了具有较好透气性的壁，因此可作为将位于载有样品的反应小室之间的中间介质流体提供气体交换或转移入反应小室内用的方法，该中间介质流体在本文中有时称为“分离流体”，通常为空气或由添加补充气体，例如5%CO2所修饰的空气。
2)管壁足够薄以至可将可加速加工的气体转移通过其间，因此免除了所有气体必须顺着容纳小室的试管内长度方向转移的需要。
3)导管壁可较佳地充分半透明来允许对反应混合物进行光学检查。
4)在许多生物化学操作中，例如将生成特定分泌产物，以及对于是否存在有适当分泌细胞有疑问时，业已发现提供一种极小的反应小室是极为需要的，这种小室可更快速且有效地鉴别是否存在有所需的分泌产物，因而，可判别是否存在有适合在小室内进一步接受培养的细胞。业已发现这种反应小室可小至1微升的几分之一;尽管本发明可操作大得很多的样品。
本文中所用的“液体”是用来说明虽然具有粘性，但可顺着管形反应器移动，且基本上不受损害的任何物质。很多种胶体均为合适的“液体”，适合于用作承载细胞的培养组合物，如实施本发明时，其中最初种子培养要经过包裹的微胶囊。
本发明的大多数用途中，本发明的装置，以及与加工流体接触的辅助装置，必须经过灭菌以确保细胞承载培养等的安全环境。
虽然载体流体可以是含氟化学产品等物质，但有助于小室移动的物质也可使用。例如，当使用独立凝胶型壁来形成小室时，可使用水溶液，这种凝胶型壁包括可将流体包于其中的藻(朊)酸钠等物质。
此外，必须理解，本揭示内容讨论了利用氧气的方法，然而，我们希期本发明也包括无氧方法，在该种情况下，分离流体必须为适当的非氧化性流体，例如氮气。选用合适的气体环境来环绕加工小室可避免有任何氧气传送到小室内。
通常，本发明的构思是基于可于特定反应小室内极为快速地测知是否存在有合适的分泌细胞。这可使用大量极小的小室与快速评价，例如在检测装置中，每小时相对移种过数百个小室而达到。如此，即使使用极小，甚至次微升小室，在特定小室内即使合适的抗体的生产机率降低，甚至降至极小，但我们仍然能够获得很快速的检测速度，不会有很大量不感兴趣的反应液体组分，及在最适当的环境条件下可维持一定量样品(通过超过1000，典型地超过5000，且经常超过20000)共同结合而获得一种初步检测及生产所需生物化学产物的最适当方法。
陈述这种优点是另一种方式为，虽然分泌产物在特定小室内产生很少，但当在小室内产生时，可以较早地被检测出来，因为它将以更高，更容易检测的浓度而存在。
此外，由于使用大量小室，故最初对小室播种的细胞数目是很低的，典型地低于或等于1个分泌细胞/小室，而不象已有技术常用的10或10个以上细胞/小室。此处的优点为所需要的细胞立刻被克隆而无需进行多个费时的亚克隆步骤。
当反应小室是在本文所述的大小及类别的聚合物试管内生成时，有待试验的生物培养物小室的体积可因为使用载体流体，例如硅酮油或全氟化碳而减少。尺寸小于1微升，实际为约0.2微升或更小。典型地，载体流体的粘度为约25厘沲，且可以商品名GaldenD-25从Ausimont公司(Montedison子公司)及多个其他供应商处而得到。最好选用反应流体以避免任何小室内的蛋白质酶基粘着到管壁上，这一点对于其中必须将气泡移动通过试管的情况而言尤为重要。
还发现载体流体可作为“阻塞”试管表面的手段，试管中含有反应小室且包围于全氟化碳液体覆盖膜内。这种阻塞中也常用1%的BSA溶液。其他物质也可以使用，但必须不干扰气体转移(当需要这种转移时)。“阻塞”一词代表在顺着试管的反应小室内提供覆盖膜来避免对物质的交互作用及过度粘着。
分离流体与反应器小室间的载体流体层的特征在于其中有溶解的空气。常见的溶解度为20-50ml空气/100ml载体流体。
本发明的一个主要优点为小室内的反应组合物可透过反应器试管的透明或半透明壁而进行光学检测，例如原地测量表面萤光，而此时反应物仍然保留在可产生有待检测物质的培养基内。
典型的情况下，反应小室必须被约束在化学惰性管内，较佳地为全氟化碳管(由18号FEP(氟-乙烯聚合物)管所制成，亦即内径0.042英寸及壁厚0.012英寸)。一种这样的试管以Zeus商品名，由Zeus工业产品公司，拉里登市，新泽西州出售。下文所列举的试管的内径约0.03-0.04英寸，及壁厚约0.01-0.02英寸。所用的任何试管必须为可灭菌的，无毒，不被水湿润，且可能(长期反应时)具有足够透气性而可用来在试管的内侧与富含CO2的空气外侧间至少转移CO2及O2。不可湿润的特性可由适当阻塞所提供。
不必使用单晶，无孔隙的试管材料。也使用多孔管，但规定仅在其适当地含有载体流体且不会污染样品时才可使用。污染是否为需要考虑的因素是与特定污染物通过载体流体的活动性及，当然，与小室，加工期间的参数，特别为时间有关。典型条件下，试管材料对氧的透过性为700cc/100平方英寸-24小时-密耳厚度及对CO2为1670cc/100平方英寸-24时小时-密耳厚度，所有测量均于25℃及大气压下进行。
必须了解，管材料的透气性要求将随下列因素而有较大的差异，例如反应器小室大小，其中所进行的生物化学反应速度，反应物浓度等。某些情况下，可反应多日而不会有气体转移，但发现用于许多目的时，试管材料为每100平方英寸面积每密耳管厚度每24小时可通过约500cc氧气及每100平方英寸面积每密耳管厚度每24小时可通过1500ccCO2，这种测量是于温度(23℃)及压力14.7磅/平方英寸的标准条件下进行的，载体液体透过性通过是以液体中的“空气溶解度”来论述的。Fluorinert FC-71可将约20ml空气溶解于100ml液体中(温压标准条件)。具有这种特性的材料显然完全适合用于本发明;其他材料可溶解更多空气且对气体极为具有透过性;一般而言，当用薄覆盖膜来阻塞试管且作为载体流体时，在100ml液体中约10ml空气的“透过度”适合于大多数令人感兴趣的生物化学反应。
这种透过性在典型例中将可使得细胞生长与分裂持续多日，甚至多周。其中一个典型例子为当反应器维持于37℃在5%CO2/95%空气的环境中经历约1周时，2.5微升反应器小室内最初所含的10个融合瘤细胞(举例)将可于37℃维持且分裂，经历1周时间。
必须注意，小室形状必须为球形，或甚至更佳者为顺着来自检测装置的较佳光束方向，亦即沿试管轴垂直的方向略为延长。这种形状及取向是需要的，因为它可使样品沿着光束方向浓度更高，从而采用诸如该领域已知的表面反射光不检测技术来检测。这种条件对于极小的小室，例如体积小于1微升，特别是小于0.5微升，且有待检测的物料首先以极小量出现时特别佳。
反应小室于管形反应器内合并，这是该领域已知的一个特性，它使得反应物共同生成一个单一的反应小室，特别可用于本发明的生物化学方法中。即使当各小室最初含有从同一培养基所取得且显然具有相同的最初组成的反应混合物时也是如此。然而，事实上，当使用超小室时，通常在一个小室内有一种类型的细胞不会出现在邻近小室内;如此，在下列条件下，其中(1)具有所需要特性的抗体出现在一个最初小室(如此表明至少存在一个所需要的分泌的细胞，但更可能有这种所需要的细胞的繁殖);及其中(2)邻近小室并未指出存在有该细胞时，可将邻近小室合并来对具有适当分泌的细胞的反应器小室内的物质提供附加营养。当然，在许多用途中，例如在克隆用途中，邻近小室必须不含干扰性细胞物质。
此外，可使用合并小室来添加附加化学试剂，例如，会影响细胞生长，分裂或具有细胞生物化学性质的那些。若干化学试剂为生长抑制剂，生长因子，及对细胞表面受体具有特异性的药物或化学产品。同时，也可将其他类型细胞加入含有第一类型细胞的培养基中来研究细胞毒性或其他效应，例如一种类型的细胞受到第二种类型的细胞存在时，对其生长及分化的影响。
当进行该方法用于玻璃管内生长多克隆(或单克隆)分泌的融合瘤细胞时，细胞产率极低。这种条件可使用经过调整的培养基而略为改善。然而，当使用透气管及载体流体时，即使使用未经调整的培养基也至少可达到更大幅度的细胞生长。
必须了解，装置的透气特性在本文所述的短期使用方法中可能不必要;事实上，甚至玻璃也可用作试管，在无需补充气体或依赖气体通过反应器轴向转移但不具有前述的问题的情况下可使用。
“调整介质”一词代表已经被用于在初步方法中生长细胞，特别为融合瘤或骨髓瘤细胞的培养基。然后将该培养基离心而从其中除去固体物质。然后它可用作“经调整的”培养基。由于在最初过程中调整的结果，细胞含有一种或多种附加生长促进因子，例如B-细胞生长因子。显然，可使用经过调整的培养基，但使用未经调整的培养基并获得极为良好的结果是该方法的一个特殊优点。
用来生产多克隆或单克隆抗体的典型培养基制备时间为10-30日。与检测设备，及特定培养基是否有导致小室粘连的倾向有关，较佳的是将小室顺着试管移动，但其时间相当短，例如至多约20小时等，当然，在较佳实例中，需要将小室维持稳定经历一持续时间，例如数小时或更多时，即使只需要缩短试管长度时也是如此。
小室内含蛋白质物质，若静止不动经历一段时间，容易粘着于试管上，而无论是否存在有载体流体皆如此。有多种溶液可免除这种不便，其中之一是维持细胞如上述而移动，但有短时间停止。另一种是选用相当轻质的载体流体，例如填有微汽球例如如玻璃微汽球，且较好为次微米大小的载体流体。这样可形成低载体流体有效密度的方法。这种微汽球当包含于培养基小室内时，也可用作玻璃珠来形成漂浮片。
通过将管形反应器安装于以每分钟一转的缓慢速度或甚至更慢的速度旋转的表面上，则可使载体流体的选择范围更宽，只要重力不会使得分离培养基相对于反应小室漂上来或沉下去即可。
本发明方法特别适用于在试管内加工活的分裂中的细胞。但是，加工在试管内不会繁殖的白血球，原发肝细胞等细胞也是本发明的一个优点，因为其机械作用温和，因此在检测之前可于在加工期间保存该细胞;举例来说，人们希望研究温度，时间，气压等函数对于这种细胞的若干特性的影响。这种情况下，本发明的装置对于在各个不同小室内，加工处理大量细胞样品特别有价值。
同时，本发明也可用于其中需要试验在小室内的反应物对气体环境的反应的多种反应中;如此，例如，可研究氧气对自由基团的影响，例如亚德里亚霉素(adriamycin)基团对四唑盐的电子转移的影响。同时，我们也希望研究就气体介质或热环境而言，线粒体(mytochondrin)内的电子运输。这种情况下，当通过试管及通过检测器之下被运送时，分析样品可以被加工。于其中进行反应的气体环境可随时改变，可利用任何适当的检测或分析来对该现象进行研究。
当然，试管通常是包围在其中含有适合研究的环境的外壳内，因而提供了一种可于试管内获得适当热环境或化学环境的方式。
有多种方法，其中当试管内负载有小室之后，则无需顺着试管移动。这样，可能希望将不同的生长因子加入不同的细胞小室(选择其中有同种细胞)以便评价对细胞行为的影响。这只是一种分析方法，其中管形导管(小室仍然放置于其中)可被废除，因为相当常见，一旦进行分析之后，则无需保留分析材料供进一步使用。事实上，本发明的一大优点是于任何细胞族群进行特定方法之期间将其维持于相容之环境中。
其他类型研究细胞的方法中有细胞毒性检定法，其中不同种及/或不同数量的药物(或毒素)可放置于试管内的不同小室内，且经过一段适当时间之后，可研究不同细胞的影响。使用本发明也有助于确定人体白血球抗原(HLA)-的类型。将具有不同HLA亚型的各种活性抗血清放置于不同小室内(其中含有相同细胞)。在小室内杀死细胞代表所评价的细胞是对于小室内所含的特定抗血清敏感的。可利用萤光手段或该领域已知的任何其他检测手段来测定细胞的死亡。
例如对是否存在有特定药物而评价时，测定细胞死亡的一种方法是利用一种称为二乙酸羧基萤光(CFD)的物质。仅有活细胞可切断二乙酸根而发出萤光。如此，可用CFD将肿瘤细胞进行标记，然后加工，且播种于具有感兴趣药物的培养基内。所有细胞将显示萤光，但仅有被杀死的细胞允许萤光标记从细胞中露出来，在培养基内变稀，且丧失萤光特性，如此可藉萤光装置检测活细胞。
利用本发明有助于进行细胞内研究，例如，当我们希望测量细胞内的pH，或游离钙，或特定酶时。pH的测量可使用适宜的pH感性染料，例如萤光物料BCEF(圣地牙哥Calbio化学公司提供)，于细胞内进行，且经历一段适当时间后，将细胞放置于有待评价的物理或化学条件下，可以光学方式评价染料的数量或色料来指示pH。相似地，可使用FURA-2(奥勒冈州，接头城，分子探针公司所提供)作标记来研究细胞内环境的游离钙。
Ortho诊断剂公司所提供的细胞表面标记也可用来研究细胞膜参数。
必须指出上述分析技术不仅代表本发明的一部分，因为这种技术在已有技术中已为人们所知，实例中说明了本发明的装置与方法可优异地利用的类型，甚至当事实上无需真正回收或收获细胞产物时也如此。
可测定细胞酶状态，例如酸性β-半乳糖苷酶可使用产生萤光的基质萤光素二-β-d-半乳糖哌喃糖苷(细胞学测量，第7期，483-486页，1986年)来测定。
当然，并非根据本发明的纯生物化学方法也可进行多种其他费时且无法预测的方法。例如，可小心监视所产生的缓慢形成的无机或有机晶体的生长，或其他化学物质的产生。各小室的化学组成可略有不同，因此，例如，可发现各种催化剂含量的影响。当反应小室极小时，透明壁将可原地进行大多数光学测量，这是本方法的一个特殊优点。发粘或小室“跳跃”现象通常不存在于这类应用中，因为其不含蛋白质物质。装置的透气性有助于对任一种反应选用环境或研究在一系列气体环境下的反应。
简而言之，本发明方法是以产生抗体配合基来指示反应小室内存在有所分泌的细胞而加以说明，如此涉及使用单一反配合基，亦即特别可用来检测该种将产生的抗体的配合基者。
本发明中描述了本发明的较佳实施例，且提出了其多种变化例及修改例，但必须理解，这些范例并非将本发明局限于此，在本发明的范围内可作出其他变化及修改。本文所提出的实例的目的是使得该领域的技术人员能更好地理解本发明及其原理，且可通过对多种不同形式，这些形式分别可能适合于各特例来修改及具体表现本发明。


图1为示意图，显示了在塑胶管(图7中显示得最清楚)内分隔在小室内的含有混成瘤细胞组成的液态生物培养物。
图2列举了当所说的细胞表现出抗体后，如图1中所示的相同培养物。
图3指出了抗体及萤光探针二者与磁珠结合后的同一培养物。
图4、5及6显示了位于小室侧方被拉入不透明贴布内的磁性物质。
图7列举了可供操作一系列生物化学组成的典型试管加工装置的示意图。
图8是管形反应器旋转的示意图。
图9是有利的小室形状的示意图，其中在加工期间需要对反应小室进行光学检测时，可在其中最为有利地进行本发明的方法。
如下实施例与图1至图6一起列举了可供检测组织培养基内是否存在有融合瘤细胞所分泌的抗体的原地均相检定法。反应器小室的管性配置类似Smythe等人于美国第3，491，141号专利及在本发明图7中所用的。使用前必须对试管及全氟化碳载体流体进行适当消毒。
实施例1本检定法显示了大小超过100，000道尔顿的抗体的测定。
由图1可见，直径1.75微米且由Seragen公司所提供的聚苯乙烯磁珠20经吸附山羊抗小鼠(GAM)Ig G抗体(得自Zymed公司的重链与轻链类型)而被覆盖。使用牛血清蛋白(BSA)来阻塞磁珠上的任何其他反应性位置。磁珠20可作为将与磁珠结合的探针的酶基，且最终被拉入不透明贴布内。磁珠分散于一系列容纳于试管内的反应器小室例如22内，其中含有组织培养基24;同时也分散于小室22的是所谓的标记化学产品或探针26，它是FITC-标记的山羊抗小鼠多克隆抗体，也是从Zymed公司而得到的，及若干预先选用的融合瘤细胞28(55.2可产生Ig G2a的融合瘤细胞)。使用前，将细胞用Hanks平衡盐溶液约洗4次以去掉任何游离抗体。准备含有非分泌的653小鼠骨髓瘤细胞作阴性对照或Ig G2a小鼠骨髓瘤蛋白质(ICN公司产品)作阳性抗体对照的其他反应器小室。试管52被容纳于其中含有适合维持所需大气压的气体大气压的外壳21内。
图2指出了一种新情况，其中随着时间的增加，抗体30至少从若干细胞28，亦即从分泌细胞中分泌出来。
磁珠20通过它们的山羊抗小鼠抗体覆盖层(可称为MB/GAM)而与新近分泌出的抗体30(可称为Ab)结合，如同“探针”FITC-标记的山羊抗小鼠多克隆抗体26(可称为GAM)一样，所生成的复合体的化学式组成32示于图3中，使用上述术语MB/GAM-Ab-FITC/GAM探针-抗体26由于上方具有小鼠抗体，故与磁珠结合，图3中，“B”为磁珠，分泌抗体与探针的结合“组合物”。
从图4至6可见磁针40(大小约1×1.4×7cm的千高斯磁针)用来将载有磁性粒子的物料拉至小室22周围小面积上，因而可于如图6所见的贴布42中提供基本上不透明的磁珠群。
如该领域已知的，与经过适当配合的刺激光线相应的发射出的萤光量必须与细胞28所分泌的抗体量有直接关系，此抗体连接到MB/GAM与FITC/GAM二者上而生成MB/GAM-Ab-FITC/GAM物质。当然，若有任何未连接于抗体上的磁性物质，也将包含于磁性贴布42内，而不会产生萤光。
图7为典型的依次加工程序的示意图，一般来说，利用一种已知方法，其中有待进行分析的体积约0.3微升的小室22通过利用气泡50所隔开的聚四氟乙烯管52而移动。液体物质为一种全氟化碳液体组合物，且以氟林内FC-77的商品名由3M公司出售，可提供一种加速分离的手段，同时也有助于小室顺着反应管52内壁作润滑性渐进移动。试管52构成可使得足够的营养气体及CO2渗透通过其间的装置。小室间的气体或气泡构成可运送气体通过氟林内载体相60的附加表面，载体相环绕气泡及含生物培养物的小室二者。其临床过程如下各小室内含有典型浓度约为1.12×108个珠/毫升的经过处理的磁珠。磁珠的浓度还可低很多。探针以375ng FITC/GAM/ml的浓度加入。小室内最初放置4至250个融合瘤或非分泌的骨髓瘤细胞。ICN公司所提供的Ig G2a小鼠骨髓瘤蛋白质也可与磁珠及磁性探针结合而用作阳性对照，以37.5ng/ml的浓度放置于另一反应器内。
试管内部最初被覆盖以载体流体，亦即以商品名氟林内FC-71出售的一种经过灭菌的组合物，此种组合物用来湿润试管，具有透气性且必然具有适当透明度而可作光学检定，使用分支管及注射器泵送系统将反应混合物从不同凹槽内抽吸入Teflon试管内，因而于试管内生成反应器小室;也将足量FC-77泵达入试管内，这样，它就形成了环绕生物培养基，亦即反应混合物的小室的障碍物层。如该领域所已知的，将空气引入试管内来隔开邻近小室，然后将试管内的小室放置于37℃及5%CO2-95%空气环境的培养器内，经历24小时。此时将磁珠拉入不透明贴布内且测定贴布萤光来指示是否存在有所需的配合基。
必须理解，根据加工机的优先顺序，当检测到小室内存在有适当分泌的细胞的有用生物化学指示时，可立刻接着将小室抽吸到出口而回收所需的小室，且由其中分离出细胞，例如从试管内切出该小室，或使用微注射器抽吸出来，或在适当条件下，使得该小室移动通过试管至出口。此外，可采用该领域已知的程序将邻近的小室融合成为所需的小室。此种取代之道构成了一种可将附加营养带到所需小室内有用化学产品中的手段;必须注意，当进行融合时，也经常可方便地将融合物质移入大直径管内，因此可维持相对于融合得到的较大小室体积来说，较佳的气体转移面积。
所有来自含有分泌的细胞或Ig G2a的凹槽的反应物皆呈阳性萤光，不含分泌的细胞或培养基的小室则呈阴性。
图8显示了反应器管52环绕轴A-A旋转，以避免固体组分在反应小室内过度漂浮或沉降。通常除非反应小室将静置数小时而非通过试管缓慢移动，否则无需进行此种旋转。
图9为示意图，显示了在塑胶管93内由气泡92所分隔开的近球形小室91，试管内具有全氟化碳液体94，有助于小室及气泡的分隔，且有助于气泡的移动，特别是小室顺着试管93而移动。
本发明的贴布抽拉是由一位共同工作者所发现的，特别有价值且可用于即使不含标记的贴布凝聚(例如在前面实例中抽拉入萤光贴布内的一般类型)。可利用目视，通常借助于显微镜，以例如放大100-200倍而无需借助于标记即可检测。此种情况下，以使用磁性粒子来进行为最佳，这是基于两种样品间质地的差异。由于抗体所获得的物质(例如前面实例的MB/GAM-Ab-FITC/GAM)的外观比磁珠尚未与感兴趣物质复合之前更稠密，更结实。其中一例为前例中的BM/GAM状态。此种程序虽然比标记程序不敏感，但最终证实为简化本发明方法的一种较佳方式。
必须理解，下面的权利要求用于覆盖本发明所描述的所有本发明的一般与特定特征，本发明范围内的所有描述均将落入所说的范围内。
权利要求
1.一种在细胞培养基内促进生物化学产物生长与生产的方法，其特征在于该方法包括下列各步骤(a)将一系列细胞培养基样品以隔开的反应小室形式顺着试管放置；(b)使用透气性载体流体处理管壁；(c)使用中间分隔流体来维持所说的反应小室在试管内分隔开；(d)在细胞培养基小室与分隔流体中间形成载体流体的透气性障碍物层；(e)培育该一系列细胞培养基且检查介质来检测是否存在含有所需生物化学产物的经过培育的小室；及(f)至少从若干隔开的反应小室内回收所需的生物化学产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的小室在培育步骤中是顺着试管而移动的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于该培养基及回收的生物化学产物各自包括活体细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于它包括将少于约10微升(体积)的细胞培养基放置于反应小室内的步骤。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于反应器小室的大小，小室的大小及形状，及载体流体的厚度经过选择以在分隔流体与反应器小室间提供足够的O2及CO2气体交换来增加细胞的生长比例。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于该管壁足够薄而可使得气体通过管壁进入管内，且以可有效促进细胞生长的数量透过载体流体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于该液体组合物包括至少一种分泌的细胞及其中所说的回收步骤包括回收分泌的细胞。
8.如权利要求1，2，3，4，5，6或7中所述的方法，其特征在于该方法使用包括未经调整的培养基来进行细胞培养。
9.如权利要求1，2，3，4，5，6或7中所述的方法，其特征在于该反应小室的体积小于1微升。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于该试管是透明的且包括当试管相对于光学评价装置移动时，透过管壁对小室作光学评价的附加步骤。
11.如权利要求1，2，3，7或10所述的方法，其特征在于该反应小室顺着管轴方向并未延长。
12.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于它包括下述步骤于第1反应器小室内检测出指示具有适当融合瘤细胞的抗体，且将第1小室内的物质与不含细胞质的至少另一小室融合来促进该适宜的融合瘤细胞具有改良的附加生成速率及促进该细胞分泌抗体的改良速率。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述小室的最大体积为0.5微升。
14.如权利要求1，2，3，4，5，7，10或13所述的方法，其特征在于有大量小室各自包括从同一来源组合物中取得的液体。
15.一种在细胞培养基内促进生物化学产物生长的方法，其特征在于该方法包括下列各步骤(a)将一系列细胞培养基以分隔开的反应小室形式顺着试管放置;(b)使用载体流体处理管壁作为加速小室顺着试管移动的手段;(c)使用中间分隔流体将试管内的反应小室分隔开;(d)培育试管内的培养基;及(e)在导管末端回收至少若干互相隔开的反应小室内的生物化学产物。
16.一种评价气体及热环境对化学反应影响的方法，其特征在于该方法包括下列各步骤(a)将一系列含有化学反应产物的反应介质放置于透气管中的一系列互相隔开的反应小室内;(b)将该试管依次维持在预先决定了温度及气体组成的多个不同环境内;(c)使用透气性载体流体来处理管壁作为加速小室顺着试管移动的手段;及(d)观察该环境对该化学反应的影响。
17.培育培养物用的装置，其特征在于该装置包括(1)其中维持有可促进细胞生长的气体环境的外壳;(2)于该外壳内的试管，管壁为透气性的，允许气体穿透管壁进入试管内;及(3)顺着管壁的透气性载体流体也形成允许气体渗透通过其间的手段。
18.如权利要求17所述的装置，其特征在于在试管内还包括一系列由透气性载体流体所形成的包围样品的壁。
19.一种促进和分析细胞培养基内变化的方法，其特征在于该方法包括下列各步骤(a)将该培养基顺着试管放置于试管内一系列互相隔开的反应小室内;(b)使用透气性载体流体处理管壁;(c)使用中间分隔流体而保持反应小室在试管内互相隔开;(d)在小室与分隔流体之间形成由载体流体所构成的透气性障碍物层;(e)培育该系列细胞培养基;及(f)检查介质来检测该细胞内的生物化学组分情况。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于所述的小室的大小小于1微升。
21.如权利要求1，2，3，或6所述的装置，其特征在于所述的小室是由聚合材料所形成的，它形成了可包裹小室液体的手段。
全文摘要
本方法利用多个含有培养基的小体积小室，各小室可包围于试管，较好为透明试管内，且于试管内借助于透气性载体流体而隔开，于特定小室内，流体顺着试管移动至检测站；若发现特定小室内的流体含有可供进一步加工的所需组分，则可分离出来进行加工。该方法用于单克隆抗体的生产以及在反应小室需要气体转移的应用中特别有用。然而，本发明也有助于在细胞内研究，诸如pH及钙含量，及细胞膜上各位置。
文档编号C12M1/34GK1048062SQ8910400
公开日1990年12月26日 申请日期1989年6月13日 优先权日1988年2月10日
发明者丹尼斯·D·皮尔特洛尼格, 罗伯特·J·路马, 约翰·L·史坦尼克 申请人:奈吉尼股份有限公司