专利名称：一种利用基因重组技术制造丙酰,乙酰螺旋霉素的方法
技术领域：
本发明涉及基因重组技术获得丙酰螺旋霉素，乙酰螺旋霉素的制造方法。
丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素是一种治疗革兰氏阳性菌感染有效的抗生素。乙酰螺旋霉素是由化学半合成方法制造，现已投入生产，广泛应用于临床。日本专利(52-82790)曾报导用微生物方法转化螺旋霉素为酰化螺旋霉素，我国曾报导利用麦迪霉素产生菌无活性变株对螺旋霉素进行微生物转化获得丙酰螺旋霉素。用化学方法改造螺旋霉素除有环境污染的缺点外，且酰化反应定向差，当进行4″-羟基酰化时，2′-羟基也同时被酰化，以致影响产品的质量。微生物转化则需要先制造螺旋霉素再进行转化，工艺繁琐，且转化率有一定限制(75～80%)。利用基因重组技术制造丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素至今未见文献报导(附情报所文献检索结果)，也没有同样的发明申请过专利(附中国专利局检索结果)。
本发明的目的在于利用基因重组技术获得直接生产丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素的基因工程菌。本方法酰化反应定向性好，可以简化化学方法制造酰化螺旋霉素及微生物转化方法制造丙酰螺旋霉素的生产工艺，并可避免化学法所造成的环境污染，使生产成本降低，获得较大的社会经济效益。
本发明的内容与要点分述如下一、麦迪霉素4″酰基转移酶基因的克隆首先建立了麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(Str.mycarofaciens 1748)的基因文库，将麦迪霉素产生菌的总DNA用Mbol限制性内切酶部分酶切，在蔗糖密度梯度溶液中离心，收集30-40kb的DNA片段，粘粒载体pNJ1用Bgl11酶切，并用碱性磷酸酶处理。在T4连接酶作用下，载体与插入片段相连，用噬菌体包装蛋白在体外包装，继而感染大肠杆菌DH-1，得到1700个左右菌落。提取其中的质粒DNA，并进行酶切分析，确定90%以上为重组DNA，含插入DNA片段30-45kb左右。根据链霉菌染色体分子量估测为10000kb，所建立基因文库可以概括麦迪霉素产生菌基因组的95%以上。
用碳霉素产生菌4″-异戊酰转移酶基因为探针，与麦迪霉素产生菌基因文库进行菌落杂交，得到阳性菌落PCN10F5DNA，Southern分子杂交实验证明，PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb为同源片段。分离PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb片段，并与plJ680(分子量为5.3kb)载体相连，通过DNA转化，从变青链霉菌(Str.lividans)TK24转化子中得到含重组质粒p6F5的克隆。通过酶切分析，确证重组DNA中含BamH1-BamH18.0kb的插入片段，分子量为13.3kb。限制性内切酶酶切图见(图1)。
二、麦迪霉素4″-酰基转移酶基因在螺旋霉素产生菌中的表达首先将螺旋霉素产生菌(Str.spiramyceticus 371)菌种斜面，挖块接种到培养基[蔗糖10.3%，K2SO40.025%，MgCl2·6H2O 1.012%，葡萄糖1.0%，胰胨0.1-0.3%，酪蛋白氨基酸0.05-0.3%，蛋白胨0.2%，酵母浸出物0.2-0.5%，K2PO40.1-0.7% 10ml/L，三羟甲基氨基甲烷0.1-0.3M(PH6-8)100ml/L，微量元素溶液(ZnCl20.04%，Fecl3·6H2O 0.02%，CuCl2·2H2O 0.001%，Mncl2·4H2O 0.001%，NaB407·10H2O 0.001%)2ml/L，NaOH 0.5N-2N 2-10ml/L]中，装量为30-50ml/250ml三角瓶，27-32℃培养2-4天。以2.5-10%接种量转种上述同样培养基中，并加入0.1-1%甘氨酸，在同样条件下培养16-36小时，收集菌体，再用10.3%蔗糖溶液洗涤菌体2-3次，在含溶菌酶0.5-3mg/ml P溶液(三羟甲基氨基甲烷0.25-0.4% PH 8.0 Cacl22H2O 0.25-0.4%，Mgcl26H2O 0.1-0.3%，蔗糖10.3%，葡萄糖1% PH 7.0-8.0)中，28-38℃条件下溶菌15-60分钟，获得原生质体。重组质粒p6F5 DNA在浓度为15-50%的PEG媒介下转化原生质体，获得含重组质粒DNA的克隆菌株。用BamH1-BamH18.0kb DNA片段作为探针，与克隆菌株的总DNA和质粒DNA进行Southern分子杂交，确证含有重组质粒DNA。含重组质粒的螺旋霉素克隆菌株在一定发酵培养条件下，产生对八叠球菌有抗菌活性的物质，对产物的薄层层析证明，其迁移值与标准丙酰螺旋霉素相似(图2)。
三、麦迪霉素4″-酰基转移酶基因在螺旋霉素产生菌中表达产物-丙酰，乙酰螺旋霉素的鉴别从含麦迪霉素4″-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株的发酵液中，分离到一种螺旋霉素酰化产物，经紫外光谱，高压液相层析，质谱及核磁共振等化学分析鉴别为丙酰螺旋霉素Ⅲ，丙酰螺旋霉素Ⅱ(及其同分异构体乙酰螺旋霉素Ⅲ)，乙酰螺旋霉素Ⅱ，其部分理化性质的有关数据见(表一)结构式见图8，紫外吸收光谱见(图3)，高压液相层析图谱见(图4)，红外吸收光谱-丙酰螺旋霉素Ⅲ见(图5)，FD质谱结果见(图6)。
组份Ⅰ由FD质谱测得基峰为977(M+-Na+)，故其分子量为954，由FD及EIMS所得碎片峰分析201碎片峰表明，在碳霉糖4″位上接有丙酰基，故组份Ⅰ为丙酰螺旋霉素Ⅲ。
组份Ⅱ由FD质谱测得基峰为962(M+-H+Na+)，故其分子量为940，又根据FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上为乙酰基，200(M+-H)碎片峰4″位则为丙酰基，故组份Ⅱ为同分异构体，丙酰螺旋霉素Ⅱ和乙酰螺霉素Ⅲ的混合物。
组分Ⅲ由FD质谱测得基峰为946(M+-H+Na+)故其分子量为926，又根据FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上为乙酰基，故组分Ⅲ为乙酰螺旋霉素Ⅱ。
克隆菌株产物丙酰螺旋霉素Ⅲ的核磁共振1H谱(AM-500)见[图7(1)]，13C谱(AM-500)见[图7(2)]，丙酰螺旋霉素Ⅱ，乙酰螺旋霉素Ⅱ的1H谱(AM-500)分别见[图7(3)，(4)]。丙酰螺旋霉素Ⅲ的13C(AM-500)碳原子化学位移的数据和文献资料对照的结果见(表2)。
(表2)数据表明，克隆菌株产物中丙酰螺旋霉素Ⅲ和文献中报导的碳原子的化学位移是吻合的。其中9.3，27.7，170.9 PPM为丙酰基的化学位移，并根据质谱碎片峰201m/e，表明其丙酰基接在4″-0-位上。
四、基因工程丙酰、乙酰螺旋霉素的制造方法含麦迪霉素4″-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株，在含5-30ug/ml硫链丝菌素的黄豆饼粉-淀粉培养基上，于25-35℃培养5-14天，用挖块法接种于种子培养基(葡萄糖0.5-2%，淀粉2-4%，黄豆饼粉1-3%，Nacl 0.4%，CaCO30.3-0.8%)，28℃培养40-80小时，以2.5-10%接种量种入发酵培养基(葡萄糖 1-3%，淀粉2-6%，鱼粉1-3%，玉米浆0.5-1.5%，NH4NO30.6%，KH2PO40.01-0.08% MgSO40.1%，NaCl 1.0%，CaCO30.3-0.6%)，26-30℃培养72-120小时，发酵液按图9所述提取流程进行分离、提纯。
一般发酵液中未酰化的螺旋霉素仅点7-8%。
丙酰、乙酰螺旋霉素的体内抗菌活性见(表三、四)。由结果可见，丙酰、乙酰螺旋霉素的体内外试验对金黄色葡萄球菌、甲类链球菌、肺炎双球菌抗菌效果较好，对某些菌如乙类链球菌A12，即使在体外试验的抗菌效果与螺旋霉素、红霉素等接近，但在体内试验中表现出明显优越性，因此酰化螺旋霉素在体内外，尤其是在体内的抗菌效果优于螺旋霉素。
本发明的优点与积极效果是利用基因工程菌，直接产生酰化螺旋霉素，酰化位置定向，产品质量可以保证，发酵与提取工艺与螺旋霉素相似，酰化产物可达80-90%，并可避免化学半合成工艺的工序，降低成本，能较好地适应工业生产的要求。
表一麦迪霉素4″-酰化酶基因在螺旋霉素产生菌中表达产物的理化性质组分 化合物名称 分子式 分子量 熔点 旋光值 紫外吸收Ⅰ 丙酰螺旋霉素Ⅲ C49H82N2O16954 135～136C -52.7 232Ⅱ 丙酰螺旋霉素Ⅱ C48H80N2O16940 124～125C -68.0 232(乙酰螺旋霉素Ⅲ)Ⅲ 乙酰螺旋霉素Ⅱ C47H78N2O16926 135～137C -81.8 232＊[α]14D(C1.0，CHCl3)＊＊UVλMeOHmaxnm
表二、13C NMR中克隆菌株产物丙酰螺旋霉素Ⅲ和文献资料中丙酰螺旋霉素Ⅲ(Pr-SPMⅢ)碳原子的化学位移碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ 碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ(PPM) (PPM) (PPM) (PPM)C-1 169.9 169.9 C-1′ 104.0 104.0C-2 37.2 37.3 C-2′ 69.2 69.2C-3 71.7 71.5 C-3′ 69.2 69.4C-4 77.8 77.8 C-4′ 74.9 76.7C-5 84.5 84.7 C-5′ 73.0 73.0C-6 28.9 29.0 C-6′ 19.0 19.0C-7 30.2 30.1 C-7′ 42.0 42.0C-8 31.9 32.0 C-8′ 42.0 42.0C-9 79.7 80.0 C-1″ 96.4 96.9C-10 126.7 126.6 C-2″ 41.0 41.0C-11 135.4 135.4 C-3″ 69.5 69.7C-12 132.3 132.4 C-4″ 76.4 77.0C-13 131.9 131.9 C-5″ 66.1 66.4C-14 40.6 40.6 C-6″ 18.3 18.2C-15 68.9 69.0 C-7″ 25.4 25.4C-16 20.3 20.3C-17 42.5 42.5 C-1′′′ 100.3 100.2C-18 201.3 201.3 C-2′′′ 31.2 31.0C-19 15.4 15.4 C-3′′′ 18.3 18.8C-20 170.8 107.9 C-4′′′ 64.9 64.9C-21 29.7 27.7 C-5′′′ 73.7 73.3C-21a 9.0 9.3 C-6′′′ 18.7 18.9C-22 62.4 62.4 C-7′′′ 41.0 41.6C-8′′′ 41.0 41.6碳原子位置参见图8
表三、丙酰螺旋霉素、乙酰螺旋霉素的抗菌谱MIC(ug/ml)试验菌丙酰螺 乙酰螺 螺旋霉 红霉素旋霉素 旋霉素 素金黄色葡萄球菌 15 0.78 1.56 0.78 0.09金黄色葡萄球菌 209P 0.78 3.125 3.125 0.39金黄色葡萄球菌 83-0 0.78 3.125 3.125 0.045表皮葡萄球菌 26069 0.78 0.78 3.125 0.19表皮葡萄球菌 8710 0.78 3.125 0.19 25白色葡萄球菌 Y-7 1.56 3.125 1.56 0.19白色葡萄球菌 Y-14 1.56 3.125 1.56 0.39八叠球菌 0.19 0.19 0.19 0.045枯草杆菌 6633 0.78 1.56 0.78 0.09乙类链球菌 A12 0.78 0.78 0.78 0.19乙类链球菌 556 0.78 0.78 1.56 0.19乙类链球菌 Y-38 0.78 1.56 1.56 0.19乙类链球菌 Y-44 0.78 1.56 1.56 0.78甲类链球菌 32209 0.19 0.39 3.125 0.78甲类链球菌 10 0.19 0.39 0.19 0.19甲类链球菌 Y-68 0.78 3.125 3.125 3.125肺炎双球菌 31109 0.78 0.78 0.39 25肺炎双球菌 010064 0.19 0.39 0.19 25肺炎双球菌 010069 0.19 0.39 0.19 12.5肺炎双球菌 010074 0.19 0.39 0.19 12.5肠球菌 75-5 0.39 0.78 3.125 50肠球菌 75-10 0.19 0.78 6.25 100肠球菌 Y-63 100 100 100 100肠球菌 333 50 50 25 6.25
表四、丙酰螺旋霉素、乙酰螺旋霉素的体内活性(小鼠)ED 50mg/kg试验菌丙酰螺旋霉素 乙酰螺旋霉素 螺旋霉素 红霉素乙类链球菌556 15.28-14.38 23.8-21.64 29.6-28.5 60.4-60.1肠球菌75-5 17.12-18.16 17.77-20.5 9.97-11.92 26.08-36.7
图1、重组质粒P6F5 DNA限制性内切酶图谱图2、含P6F5重组质粒螺旋霉素产生菌克隆菌株产物薄层层析生物显迹图1、丙酰螺旋霉素标准(对照)2、克隆菌株产物3、螺旋霉素标准(对照)图3、克隆菌株产物的紫外吸收光谱1、乙酰螺旋霉素Ⅱ2、丙酰螺旋霉素Ⅱ3、丙酰螺旋霉素Ⅲ图4、克隆菌株产物的高压液相层析图1、丙酰螺旋霉素Ⅲ，Ⅱ标准(对照)2、粗提品3、丙酰螺旋霉素Ⅲ4、丙酰螺旋霉素Ⅱ5、乙酰螺旋霉素Ⅱ标准(对照)6、乙酰螺旋霉素Ⅱ图5、克隆菌株产物-丙酰螺旋霉素Ⅲ的红外吸收光谱图6、克隆菌株产物的质谱图1、丙酰螺旋霉素Ⅲ2、丙酰螺旋霉素Ⅱ3、乙酰螺旋霉素Ⅱ图7、克隆菌株产物的核磁共振图谱1、丙酰螺旋霉素Ⅲ H-NMR2、丙酰螺旋霉素Ⅲ C-NMR3、丙酰螺旋霉素Ⅱ H-NMR4、乙酰螺旋霉素Ⅱ H-NMR图8、丙酰螺旋霉素Ⅲ结构(碳原子位置图)图9、发酵液提取流程图
权利要求
1.一种利用基因工程技术制造丙酰、乙酰螺旋霉素的方法，其特征在于所说的丙酰、乙酰螺旋霉素，是利用碳霉素4″-异戊酰基转移酶基因获得麦迪霉素4″-酰基转移酶基因，将麦迪霉素4″-酰基转移酶基因转入螺旋霉素产生菌，再将含麦迪霉素4″-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株进行培养、发酵和提取而得到的。
2.按照权利要求1所说的制造方法，其特征是以碳霉素产生菌4″-异戊酰基转移酶基因为探针，与麦迪霉素产生菌基因文库进行菌落杂交及分子杂交，获得与之同源的麦迪霉素4″-酰基转移酶基因。
3.按照权利要求1所说的制造方法，其特征是用含麦迪霉素4″-酰基转移酶基因的重组质粒，在浓度为20-40%的PEG媒介下转化螺旋霉素产生菌的原生质体。
4.按照权利要求1所说的制造方法，其特征在于将含麦迪霉素4″-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株，在加有5-20ug/ml硫链丝菌素的黄豆饼粉-淀粉斜面培养基上，于25-35℃下培养5-14天。
全文摘要
本发明是利用基因重组技术，使麦迪霉素4″-酰基转移酶基因在螺旋霉素产生菌中得到表达。经过对表达产物理化性质的分析，证实该基因工程菌产生4″-丙酰螺旋霉素III，4″-丙酰螺旋霉素II，4″-乙酰螺旋霉素III的4″-乙酰螺旋霉素II，酰化螺旋霉素的体内外抗菌活性优于螺旋霉素。用本发明所述方法制造上述酰化螺旋霉素，酰化位置定向性好，工艺简便，产品质量可以保证，更加适应工业生产的需求。
文档编号C12N15/09GK1062763SQ9010602
公开日1992年7月15日 申请日期1990年12月26日 优先权日1990年12月26日
发明者王以光, 金莲舫, 曾应, 余兰香 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所