专利名称：利用微生物生产d-酒石酸的方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物生产d-酒石酸的方法。
d-酒石酸〔(2R，3R)-2，3-二羟丁烷-1，4-二羧酸〕是一种天然有机酸，在食品工业中可作为酸味剂用于糖果和清凉饮料，亦可作防腐剂和乳化稳定剂;在制药工业中除作为医药原料外，还作为拆分剂被大量使用。过去，d-酒石酸是用生产葡萄酒的付产物生酒石为原料生产的。由于需求的增加，由此获得的d-酒石酸远不能满足市场的需求。
目前利用微生物生产d-酒石酸的方法是首先，用添加顺式环氧琥珀酸或其盐为诱导物的培养基，培养具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物;然后，在上述微生物培养物或处理物中加入顺式环氧琥珀酸或其盐，经酶催化反应，生成d-酒石酸或其盐;接着，采用钙盐沉淀或离子交换的分离方法，分离提取反应物中的d-酒石酸。
已报道能水解顺式环氧琥珀酸为d-酒石酸的微生物有无色杆菌属(Achromobacter)，醋酸杆菌属(Acetobacter)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，不动杆菌属(Acinetobacter)，诺卡氏菌属(Nocardia)，根瘤菌属(Rhizobium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，棒杆菌属(Corynebacterium)。
但利用上述微生物生产d-酒石酸的方法，还未见达到工业规模试验要求的报道。
本发明的目的是提供一种适合工业规模试验要求的利用微生物生产d-酒石酸的方法。
本发明所采用的微生物是本发明者从土壤中分离获得的新菌种，是具有同化顺式环氧琥珀酸能力的节杆菌属(Arthrobacter)微生物，它们的培养物或其处理物能水解顺式环氧琥珀酸或其盐，生产d-酒石酸。本发明以顺式环氧琥珀酸为微生物生长的唯一碳源来分离获得上述微生物，其分离的具体方法如下首先将采集的土样用无菌水稀释后涂布于含顺式环氧琥珀酸二钠1%，硫酸铵1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁(含七分子水)0.05%，硫酸亚铁(含七分子水)0.001%，酵母膏0.2%，琼脂2%的培养基(PH7.0)平板上，30℃7天培养。挑取在上述平板上生长的微生物，再经初筛和复筛。本发明将获得具有生产价值的两菌株编号成JZ-1、-2。(该两菌株已以CGMCC NO.的保藏号于1992年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。上述两菌株的细菌学特征见表1。
表1
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根据表1细菌学特征，JZ-1和JZ-2菌株被鉴定属于节杆菌属的细菌。
在培养这些细菌时，培养基中含有顺式环氧琥珀酸。顺式环氧琥珀酸或其盐的添加方式可采用预先添加在培养基中，也可采用首先加入葡萄糖等物质的普通微生物培养基对上述细菌进行培养，而后在适当的时候添加的方式。通常所用的培养基含有碳源(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、顺式环氧琥珀酸及其盐)、氮源(如硫酸铵、硝酸铵)、有机营养物质(例如酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆)、无机营养成份(例如磷酸盐、镁、亚铁)等等。培养基可以是液体，也可以是固体。
培养方法可以是静置培养、振荡培养或通气搅拌培养。培养温度为20～35℃，最好为28～33℃范围。培养时的培养基PH保持在中性为好。在工业规模生产中，一般可采用三级培养方式，即首先在摇瓶中振荡培养后，再接入种子罐通风搅拌扩大培养，然后接入大罐进行通风搅拌培养，但也可根据具体情况灵活掌握。
当顺式环氧琥珀酸水解酶大量形成时，逐渐加入顺式环氧琥珀酸或其盐进行反应，一般采用顺式环氧琥珀酸二钠为好。反应可以静置、振荡或通气搅拌的方式进行。根据反应进行的程度控制顺式环氧琥珀酸二钠的加入量，一般培养24小时～36小时后，加入4%(W/v)，反应过程中再逐渐加入12%，使最终的d-酒石酸浓度最高达10%左右。反应液的PH通常为6.5～9，最好保持为7.5～8.5。反应温度通常为28～35℃。当顺式环氧琥珀酸基本上定量转化成d-酒石酸后，便可进行d-酒石酸的提取。
一般采用通用的钙盐沉淀法分离d-酒石酸，即在上述反应液中加入CaCl2水溶液，形成酒石酸钙沉淀。经过滤水涤后再加硫酸酸解，酸解形成的硫酸钙沉淀经过滤水洗后除去。酸解液经732阳离子交换树脂除阳离子，再将离交液浓缩结晶的方法。
实例1.
将培养24小时的节菌JZ-2的斜面菌体接一环于种子培养基中，34℃振荡培养12小时。吸取2.5ml上述种子液于装有35ml产酶培养基的500ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，加PPE(聚醚类消泡剂)1滴，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠水溶液10.5ml，共经86小时振荡培养。
合并各摇瓶培养液共得1100ml，平均含d-酒石酸7.3%(W/V)。在上述培养液中逐渐加入40%(W/V)CaCl2水溶液160ml，同时不断搅拌。室温放置过夜，真空吸滤，水洗后得91克酒石酸钙(干计)。加自来水400ml，加热至60℃时，逐渐加入浓H2SO4约26ml，继续加热搅拌至95℃，加活性炭2克，95℃保温30分钟。真空吸滤水洗得到含15.2%(W/V)d-酒石酸的酸解液420ml，经732阳离子交换柱除去阳离子，将离交液减压浓缩，最终得到63.3克d-酒石酸，总得率为78.8%。
精确称取20.0克样品，配制成浓度为20%(W/V)的溶液，用WZZ-1型旋光仪测得旋光度α20℃D＝+4.92(20cm旋光管)，其比旋光度为〔α〕20℃D＝+12.3，用1.0048M NaOH溶液滴定，其含量为99.65%。
斜面培养基组成(%) 种子培养基组成(%) 产酶培养基组成(%)葡萄糖 1.0 葡萄糖 1.0 葡萄糖 0.5牛肉膏 1.0 玉米浆 2.0 (NH4)2SO40.3蛋白胨 1.0 (NH4)2SO40.2 K2HPO4·3H2O 0.1Nacl 0.5 K2HPO4·3H2O 0.1 MgSO4·7H2O 0.05琼脂 2.0 MgSO4·7H2O 0.05 FeSO4·7H2O 0.001PH 7.2 FeSO4·7H2O 0.001 顺式环氧1.0121℃灭菌20分钟 PH 7.2 琥珀酸二钠121℃灭菌20分钟 PH 7.2121℃15分钟蒸气灭菌实例2.
在20只1000ml三角瓶中装200ml如实例1的种子培养基，接入经24小时培养的节杆菌JZ-2斜面菌体各一环，30～34℃振荡培养15小时，倾入接种瓶中。
在1500l发酵罐中，盛900l如实例1的产酶培养基，PH7.2，121℃灭菌20分钟，冷却后接入上述种母，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPE1l，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠水溶液430l，继续通气搅拌培养48小时，得反应液1400l。反应液中d-酒石酸含量为11.0%(W/V)。顺式环氧琥珀酸对d-酒石酸的克分子转化率为99.8%。
实例3.
采用如实例2同样的方法培养6瓶节杆菌JZ-2种子液，并倾入接种瓶中。
在250l种子罐中，加入200l如实例1同样的种子培养基，PH7.2，121℃灭菌20分钟，冷却后接入摇瓶种母，33℃通气搅拌培养12小时。
在8000l发酵罐中，盛4500l如实例1同样的产酶培养基，PH7.2，121℃灭菌20分钟，冷却后将种子罐中的种母接入，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPE5l，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠溶液1650l，共通气搅拌培养66小时，得反应液7320l，反应液中d-酒石酸含量为7.71%(W/V)。顺式环氧琥珀酸对d-酒石酸的克分子转化率为93.8%。
采用如实例1同样的分离精制方法，得d-酒石酸结晶160kg，含量为60%(W/V)d-酒石酸母液约440l，总得率为75.1%。
产品经轻工业部食品质量监督检测中心南京站检验〔α〕20℃D＝+12.2°，含量99.6%。
实例4.
采用1500l种子罐对节杆菌JZ-2进行种子培养，培养方法同实例3。
在25000l发酵罐中，盛15000升如实例1同样的产酶培养基，PH7.2，121℃灭菌10分钟，冷却后接入种子罐种母约1000l，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPE 15l，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠共5250l，通气搅拌培养120小时，得反应液23000l。反应液中d-酒石酸含量为8.05%(W/V)。顺式环氧琥珀酸对d-酒石酸的转化率为96.5%。
采用如实例1同样的分离精制方法，得d-酒石酸结晶527kg，含量为60%(W/V)d-酒石酸母液约1400l，总得率为73.8%。产品经测定，其比旋光度为〔α〕20℃D＝+12.5，含量为99.8%。
实例5.
将培养24小时的节杆菌JZ-1的斜面菌体接一环于如实例1同样的种子培养基中，32～34℃振荡培养12小时，吸取5ml上述种子液于装有100ml下列产酶培养基的1000ml三角瓶中，30～33℃振荡培养24小时，加PPE 2滴，并逐渐加入顺式环氧琥珀酸二钠16克，30℃振荡培养至72小时。反应液中d-酒石酸含量为9.8%(W/V)。
采用如实例1同样的分离精制方法，所得d-酒石酸结晶经测定，其比旋光度〔α〕20℃D＝+12.4°(20%(W/V))，含量为99.8%。
产酶培养基组成(%)葡萄糖 0.5(NH4)2SO40.5K2HPO4·3H2O 0.1MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001顺式环氧琥珀酸二钠 1.0PH 7.2121℃灭菌20分钟实例6.
在7只1000ml三角瓶中装200ml如实例1同样的种子培养基，接入经24小时培养的节杆菌JZ-1斜面菌体各一环，32～34℃振荡培养12小时。
在150l发酵罐中盛70l如实例5同样的产酶培养基，PH7.2，121℃灭菌15分钟，冷却至32℃时接入上述种母，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPE 60ml，并逐渐加入40%(W/V)24l，经91小时通气搅拌培养，得反应液95l。反应液中d-酒石酸含量为9.0%(W/V)，顺式环氧琥珀酸对d-酒石酸的克分子转化率为97.3%。
实例7.
采用如实例6同样的方法培养7瓶节杆菌JZ-1种子液，并倾入接种瓶中。
在150l种子罐中盛80l如实例1同样的种子培养基，PH7.2，121℃灭菌15分钟。冷却至34℃时接入摇瓶种母，32～34℃通气搅拌培养12小时，冷却至20℃，等待接种。
在1500l发酵罐中，盛800升如实例5同样的产酶培养基，pH7.2，121℃灭菌15分钟，冷却至32℃时接入种子罐种母，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPH 1l，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠191.4l，经30～33℃ 107小时通气搅拌培养，得反应液1100l，反应液中d-酒石酸含量为5.60%(W/V)，顺式环氧琥珀酸的克分子转化率为85.5%。
实例8.
采用1500l种子罐，盛350l如实例5同样的种子培养基，对节杆菌JZ-1进行种子培养，培养方法同实例7。
在10000l发酵罐中，盛6000l如实例5同样的产酶培养基，PH7.2，121℃灭菌15分钟，冷却至32℃时接入种子罐种母，30～33℃通气搅拌培养24小时，加PPE 6l，并逐渐加入40%(W/V)顺式环氧琥珀酸二钠2200l，经61小时通气搅拌培养，得反应液10600l。反应液中d-酒石酸含量为7.0%。(W/V)，顺式环氧琥珀酸对d-酒石酸的克分子转化率为92.5%。
采用如实例1同样的分离精制方法，得到d-酒石酸结晶124kg，60%(W/V)含量的d-酒石酸母液约480l，总得率为59.8%。产品经测定其比旋光度〔α〕20℃D＝+12.2℃(20%(W/V))，含量为99.7%。
d-酒石酸最初是由葡萄酒的付产物-酒石中提炼获得的。由于受原料来源的限制，不能满足市场需求。后来出现了化学合成法和微生物直接发酵法。采用化学合成法生产的d-酒石酸中往往混有其光学异构体l-酒石酸。用微生物直接发酵法生产d-酒石酸，发酵液中异性物质多，提取困难，收率低，很难实现工业化生产。
本发明采用可大量供给的顺式环氧琥珀酸为原料，在微生物的作用下，专一地、高效率地将其转化成d-酒石酸，所生产的酒石酸为纯的天然酒石酸，安全可靠，并且在技术上和经济上通过了工业规模试验。
权利要求
1.一种利用微生物生产d-酒石酸的方法，它包括a.首先，用添加顺式环氧琥珀酸或其盐为诱导物的培养基，培养具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物；b.然后，在上述微生物培养物或其处理物中加入顺式环氧琥珀酸或其盐，经酶催化反应，生成d-酒石酸或其盐；c.接着，采用钙盐沉淀或离子交换的分离方法，分离提取反应物中的d-酒石酸；其特征在于d.所说a和b中的微生物是具有同化顺式环氧琥珀酸能力的节杆菌属(Arthrobacter)微生物。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物生产d-酒石酸的方法，它包括首先，用添加顺式环氧琥珀酸或其盐为诱导物的培养基，培养具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物；然后在上述微生物培养物或其处理物中加入顺式环氧琥珀酸或其盐，经酶催化反应，生成d-酒石酸，或其盐；接着，采用钙盐沉淀或离子交换的分离方法，分离提取反应物中的d-酒石酸。所说的微生物是具有同化顺式环氧琥珀酸能力的节杆菌属微生物。本发明生产的酒石酸，为纯天然酒石酸，安全可靠，并且通过工业规模试验。
文档编号C12P7/46GK1081714SQ9210893
公开日1994年2月9日 申请日期1992年7月30日 优先权日1992年7月30日
发明者张建国, 刘晓婷 申请人:浙江大学