组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体及应用的制作方法

专利名称：组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能用于组建腺病毒伴随病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)包装系统的自主复制型载体及其用途，特别涉及将AAV全基因组但不包含其两端反向重复(Inverted terminal repeats，ITR)的191--4484核苷酸共约4.3kb序列，克隆于以EB病毒复制子为基础的自主复制型载体而产生的AAV-EBV嵌合质粒型载体，它可作为助手质粒转染人细胞表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能用于包装携带外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombrant adeno-associated virus，rAAV)，或转染培养人传代细胞系构建稳定的高效反式包装细胞用于生产rAAV。
AAV属于微小病毒科，它的基因组是单链DNA，由4682个核苷酸组成，两端各有145个核苷酸的反向重复序列，是与AAV基因组的复制起点和与复制及整合染色体相关的顺式序列元件的所在，病毒基因组的编码信息从蛋白的功能可分成两部分，左端编码与病毒复制、转录必需的蛋白，右端编码的是病毒的结构蛋白。
AAV是非自主复制的病毒，它的产毒性复制需要有辅助病毒如腺病毒ADV或单纯疱疹病毒HSV的协助才能进行。当辅助病毒不存在时，AAV感染人细胞后，病毒DNA整合于宿主染色体的特定位置，会建立了一种隐性感染的状态，不会产生子代病毒；但当宿主细胞被腺病毒或单纯疱疹病毒感染时，可将AAV从整合于染色体的原病毒状态激活并从中拯救出来，从而破坏了AAV的隐性感染，复制产生子代AAV毒粒。
AAV分子生物学的一个重要特点是被克隆化于大肠杆菌质粒的AAV全基因组，转染进细胞的时候，当存在腺病毒或单纯疱疹病毒的感染，质粒中的AAV基因也可被拯救出来，进行产毒性复制，产生野生型的AAV毒粒。这一特性构成了制备重组AAV病毒载体的理论基础。
克隆了AAV全基因组的质粒，通过遗传工程的方法，去除了基因组中用于编码病毒蛋白的部分或全部序列元件，但保留AAV基因组中两端的ITR，插入了相当于被删去AAV基因片段大小的外源DNA，可得到含外源基因的重组AAV病毒表达载体质粒(I)；同时，除去克隆化AAV全基因组两端的ITR，保留其编码病毒蛋白的全部基因序列，可得到用于辅助重组AAV载体包装的助手包装质粒(II)，它转染细胞后，在辅助病毒如ADV或HSV存在下，可表达与AAV辅助和包装必需的病毒蛋白，但由于缺失了复制必需的顺式元件，不能进行复制和包装出野生型AAV毒粒。而当感染了辅助病毒的细胞共转染(I)和(II)这两种质粒时，(转染方法可以是磷酸钙共沉淀发或脂质体介导的转染)，助手包装质粒(II)表达的反式蛋白，识别重组AAV病毒表达载体质粒(I)中AAV的ITR顺式作用元件，将重组AAV两端的ITR连同外源基因一起从质粒(I)中拯救出来，进行复制和包装出重组AAV病毒颗粒。采用化学或物理手段除去和灭活辅助病毒，得到的重组AAV毒粒可作为一种转导性载体，通过病毒感染的方式将外源基因导入到细胞中，并可整合于宿主染色体得到稳定的表达。与逆转录病毒载体相比，重组AAV载体能转导有丝分裂后细胞和分化终端细胞，AAV具有超感染的特性，可进行重复感染，同时在人类至今还为发现于AAV直接相关的疾病，这些特点使它具有在人类疾病的基因治疗的应用前景。
目前制备重组AAV毒粒的方法基本上是按上述原理进行，也就是采用两种不同的AAV质粒共转染细胞，一种载体提供AAV的反式作用蛋白，另一种提供复制和包装必需的顺式序列元件和外源基因，在辅助病毒的协助下，获得携带外源基因的AAV毒粒。
为提高重组AAV载体的包装效率，Samulski将克隆化野生型AAV基因组的两端ITR以腺病毒5型基因组两端的重复序列所取代，获得的AAV包装质粒pAd8，(Samulski et alHelper free stocks of recombinant adeno-associated virusnormal intergration does not require viral gene expression.J.Virology 633822-3828)，虽然ADV的末端重复能允许被导入已感染ADV的细胞中的pAd8按腺病毒复制的机制进行有限的扩增，但还未能离开上述的工作模式，尽管这过程相对简单，但操作起来较为繁琐，表现为由于没有获得一种能支持重组AAV复制和包装的细胞系的存在，每次操作都需要将两种载体共转染细胞，由于共转染两种载体同时到大量的细胞个体的频率较低，因此也影响到产生高滴度重组AAV病毒的效率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science，Inc.)，提出了一种改进，将带外源基因的重组AAV载体克隆于自主复制的EB复制子载体中，转化细胞后，细胞内可维持多拷贝的重组AAV载体的存在，该转化细胞感染上一种将AAV全基因组的蛋白编码序列重组于腺病毒E3区的重组腺病毒时，该重组腺病毒不仅能提供辅助病毒的功能，同时也表达出AAV包装所必需的反式蛋白，使细胞中多拷贝存在的，位于EB载体上的带外源基因的重组AAV可被包装出重组AAV病毒颗粒，(US-5173414，US-5354678)。这过程看起来相当简化，但使用起来对于克隆不同外源基因的重组AAV载体，都需要分别转染细胞，获得不同的转化细胞系后，才能进一步以重组腺病毒感染以包装出重组病毒。
将AAV基因组的所有编码病毒蛋白的序列元件转化到细胞，构建出一种能提供包装重组AAV的反式包装细胞系，能提供一种可行的包装重组AAV的简单通用的包装体系，Vincint等将AAV的基因组转化Hela细胞，获得了整合了AAV基因组的包装细胞系，但包装重组病毒的效率很低，可能是受制于该转化细胞系中AAV基因组的低拷贝数存在和整合于受体细胞染色体中的AAV基因组的低效率表达所致，(Vincint et alReplication andpackaging of HIV envelope genes in a novel adeno-associated virus vector，Veccine 90353-359)。
本发明的目的是目的是提供一种能用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体，它克隆了不含两端包装信号ITR的AAV全基因组编码序列，被导入细胞后，在辅助病毒存在时，能支持携带外源基因的重组AAV载体包装成重组AAV病毒颗粒；特别是该载体转染细胞后，能在潮霉素B选择压力下获得一种能高效提供反式包装重组AAV病毒的所有病毒蛋白的包装细胞系，AAV的全基因组蛋白编码信息在宿主细胞的染色体外以多拷贝的附加子形式稳定存在并自主复制，当此包装细胞系感染辅助病毒后，自主复制载体上的AAV的编码蛋白就能表达，如再转染进该细胞系含外源基因的重组AAV载体质粒，就能从质粒中拯救出来并包装成重组病毒。
本发明的特点是采用EB复制子载体荷载AAV的基因组序列，EB复制子载体能游离于人细胞染色体外自主复制，能以较高的频率转染进细胞，很容易通过抗药性筛选得到转化细胞系，只要培养液中加以抗生素压力，就能维持EB复制子载体在细胞的稳定存在，AAV的基因不需整合到宿主细胞的染色体上，载体上目标基因的表达由于处于附加子的环境，能保证AAV基因组中所有编码蛋白质的表达，不受细胞染色体的影响。
本发明的用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体，由以下DNA元件组成1，AAV病毒蛋白编码序列AAV基因组191--4484核苷酸。
2，EB病毒质粒型复制子OriP及其反式作用因子EBNA-I。
3，真核细胞抗性选择标志(潮霉素B磷酸转移酶基因)。
4，大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因)。
按AAV基因的转录方向和质粒骨架上EBNA-I的转录方向，本发明的用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体，有两种，见附

图1，都是将AAV的全基因(除去两端ITR的191--4484)的序列，克隆于自主复制的EB复制子载体中，一种是AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与EBNA-I的转录方向一致的pEB-AAV(+)，另一种是AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与EBNA-I的转录方向相反的pEB-AAV(-)(两种质粒均寄存于大肠杆菌DH5α株，含该质粒的菌种命名为Escherichiacoli DH5α/pEB-AAV(+)和Escherichia coli DH5α/pEB-AAV(-)，已于1996年5月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为CGMCC NO.0266)本发明用于构建可组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)的原始质粒有pSub201Samulski et al，A recombinant plasmid from which an infectiousadeno-associated virus genome can be excited in vitro and its use to study viralreplication。
pBV101颜子颖等，中国专利申请号96 101408.3，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为CGMCCNO.0255)。
从pSub201中以XbalI酶切，回收4.293bp的AAV基因组191--4484核苷酸片段，插入pBV101质粒的多克隆位点的XbalI处，通过限制酶切分析，得到AAV转录方向与pBV101载体上EBNA-I转录方向相同或相反的pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)。
本发明提出的用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)，可作为助手包装质粒转染人细胞表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能用于包装携带外源基因的AAV病毒颗粒，也可以首先转染进入细胞系，经抗性筛选构建AAV基因组稳定于细胞中的反式包装细胞系，用于生产重组AAV病毒颗粒。
本发明提出的用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)，可寄存在大肠杆菌DH5α株，含pEB-AAV(+)质粒的菌株命名为大肠杆菌DH5α/pEB-AAV(+)(Escherichia coliDH5α/pEB-AAV(+)；含pEB-AAV(-)质粒的菌株命名为大肠杆菌DH5α/pEB-AAV(-)(Escherichia coli DH5α/pEB-AAV(-)，上述两菌种均可在含50----100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1％tryptone，0.5％yeast extract，1％NaCl)传代培养。
以下实施例对本发明的用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。在实施例中，所用的重组AAV载体质粒pAAVlac是pSub201质粒中AAV编码病毒蛋白部分4.3kb XbalI片段为一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表达单位所取代，A549细胞是人肺癌上皮细胞系(ATCC CCL185)实施例1质粒的制备。
大肠杆菌DH5α/pEB-AAV(+)或大肠杆菌DH5α/pEB-AAV(-)接种于200ml LB培养液，37℃培养24小时，离心收菌体，加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重悬菌体，冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，5分钟后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml〕混匀，15000rpm离心15分钟，上清加0.6倍体积异丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH5.0)溶解，等体积酚-氯仿-异戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提除蛋白质，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝胶过滤，收集流出的质粒峰。
实施例2用作助手包装质粒制备重组AAV颗粒。
A549细胞传代于100mm培养皿，当细胞呈40％汇片时，接种5型腺病毒(ADV5)，接种的感染复数(multiplicity of infection，mio)可在1-5，感染2-4小时后，将10μg重组质粒pAAVlac和15μg包装质粒pEB-AAV(+)或pEB-AAV(-)采用lipofectin试剂(BRL公司)，以脂质体转染法导入细胞；或以磷酸钙共沉淀法导入细胞，1天后，更换新鲜培养液继续培养，2-3天后，当细胞出现明显的细胞毒效应时，可收获混合了辅助病毒ADV5的重组AAV。收毒时，细胞培养液和细胞都回收，反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解，离心去掉细胞碎片，65℃加热1小时以灭活腺病毒，再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，得到可用与转导细胞的重组AAVlac。
实施例3用于构建AAV反式包装细胞系。
A549细胞以加10％的DMEM培养液培养，传代于100mm培养皿，当细胞呈70％汇片时，pEB-AAV(+)或pEB-AAV(-)采用lipofectin试剂(BRL公司)，以脂质体转染法导入细胞，2-3天后，按1∶4稀传细胞于含200μg潮霉素B的培养液中，期间隔2、3天换新鲜的含潮霉素的培养液，除去死细胞，2-3周后长出细胞集落，挑出细胞集落扩增，获得质粒pEB-AAV(+)或pEB-AAV(-)在其中以附加子形式存在，并随细胞分裂周期自主复制的AAV反式包装细胞系。这些细胞系的传代培养应使用含200μg潮霉素B的DMEM培养液，以确保质粒在细胞传代过程的维持。
实施例4利用构建的反式包装细胞系制备重组AAV病毒颗粒。
实施例3所获的细胞系在使用时不加潮霉素B，传代于100mm培养皿，当细胞呈40％汇片时，接种5型腺病毒(ADV5)，接种的感染复数(multiplicity of infection，mio)可在1-5，感染2-4小时后，将10μg重组质粒采用lipofectin试剂(BRL公司)，以脂质体转染法导入细胞；或以磷酸钙共沉淀法导入细胞，1天后，更换新鲜培养液继续培养，2-3天后，当细胞出现明显的细胞毒效应时，可收获混合了辅助病毒ADV5的重组AAV。收毒时，细胞培养液和细胞都回收，反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解，离心去掉细胞碎片，65℃加热1小时以灭活腺病毒，再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，得到可用与转导细胞的重组AAVlac。
实施例5重组AAV病毒颗粒转导培养人细胞系。
实施例2和实施例4所获的带报道基因β半乳糖苷酶的重组腺病毒伴随病毒颗粒AAVlac可用于感染培养细胞系，在培养的A549细胞感染AAVlac，48小时后，以细胞化学的方法检测β半乳糖苷酶的表达，(Somatic Cell Mol.Genet.，13(3)，253--265，1987.)，细胞以磷酸钠缓冲液洗涤2遍，加入含X-Gal的染色液，30分钟或更长时间后观察，可见被感染细胞因外源基因的表达而呈蓝色，其典型的转导效率为当病毒滴度为107时，感染培养有106个细胞的培养皿，可见培养皿的细胞全部变蓝。
实施例6含质粒pEB-AAV(+)或pEB-AAV(-)的包装细胞系用于扩增重组AAV。
实施例3所获的细胞系在使用时不加潮霉素B，传代于100mm培养皿，当细胞呈80％汇片时，感染从实施例2和实施例4所获的带报道基因β半乳糖苷酶的重组腺病毒伴随病毒颗粒AAVlac，24小时后，感染接种5型腺病毒(ADV5)，接种的感染复数(multiplicity of infection，mio)可在1-5，再过24-72小时后，当细胞出现明显的细胞毒效应时，可收获混合了辅助病毒ADV5的重组AAVlac。收毒时，细胞培养液和细胞都回收，反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解，离心去掉细胞碎片，65℃加热1小时以灭活腺病毒，再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，得到可用与转导细胞的重组AAVlac，经此过程，可使AAVlac的滴度进一步提高。
实施例7自主复制载体的构建从pSub201中以XbalI酶切，回收4.293bp的AAV基因组191--4484核苷酸片段，插入pBV101质粒的多克隆位点的XbalI处，通过限制酶切分析，得到AAV转录方向与pBV101载体上EBNA-I转录方向相同或相反的pEB-AAV(+)和pEB-AAV(-)。
权利要求
1，能用于组建腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus，AAV)包装系统的自主复制型载体，其特征在于由下列DNA元件组成1，AAV病毒蛋白编码序列AAV基因组191--4484核苷酸；2，EB病毒质粒型复制子OriP及其反式作用因子EBNA-I；3，真核细胞抗性选择标志(潮霉素B磷酸转移酶基因)；4，大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因)。
2，能用于组建腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus，AAV)包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)，其特征在于载体上AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与质粒骨架上EBNA-I的转录方向一致；能用于组建腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus，AAV)包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(-)，其特征在于载体上AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与质粒骨架上EBNA-I的转录方向相反。
3，能用于组建腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus，AAV)包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)和pEB-AAB(-)的用途，其特征在于任何一种都可单独作为助手包装质粒转染人细胞表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能用于包装携带外源基因的AAV病毒颗粒；也可以首先转染进人细胞系，经抗性筛选构建AAV基因组稳定于细胞中的反式包装细胞系，用于生产重组AAV病毒颗粒。
4，根据权利要求1和2和3能用于组建腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)和pEB-AAB(-)，其特征在于它们中的任何一种，都可单独与克隆了外源基因的重组AAV载体一起共转染为腺病毒或单纯疱疹病毒感染的人细胞，从而获得携带外源基因的重组AAV病毒颗粒。
5，根据权利要求1和2和3能用于组建腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)和pEB-AAB(-)，其特征在于它们中的任何一种，都可以单独转染培养人细胞，并在潮霉素的压力选择下，获得AAV基因组中191--4484核苷酸序列能以多拷贝附加子形式稳定存在并自主复制的AAV包装细胞系，用于生产携带外源基因的重组AAV病毒颗粒。
6，根据权利要求1和2和3和5，能用于组建腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)和pEB-AAB(-)构建的包装细胞系，其特征在于，转染克隆了外源基因的重组AAV质粒载体，在辅助病毒的存在时，可支持重组腺病毒伴随病毒的包装，产生携带外源基因的重组AAV病毒颗粒。
7，根据权利要求1和2和3和5，能用于组建腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制型载体pEB-AAV(+)和pEB-AAB(-)构建的包装细胞系，其特征在于可在助手包装质粒的不存在时，也能与外加的辅助病毒一起，用于扩增携带外源基因的重组AAV病毒颗粒。
全文摘要
能用于组建腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制型载体，它是由腺病毒伴随病毒基因组编码所有病毒蛋白基因的191-4484核苷酸序列元件EB病毒质粒型复制子及其反式作用因子、真核细胞抗性选择标志、和带大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌质粒骨架所组成。可作为助手包装质粒转染进入细胞表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能用于包装携带外源基因的AAV病毒颗粒；也可以首先转染进入细胞系，经抗性筛选构建AAV基因组以多拷贝附加子形式稳定存在并自主复制的AAV反式包装细胞系，用于生产重组AAV病毒颗粒。
文档编号C12N15/34GK1140201SQ9610536
公开日1997年1月15日 申请日期1996年6月5日 优先权日1996年6月5日
发明者颜子颖, 侯云德, 张桐, 王海林, 舒跃龙 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所