专利名称：溶栓剂的制作方法
技术领域：
本发明系溶栓剂，属于生物工程技术领域。
血栓栓塞性疾病如心肌梗塞，肺梗塞、冠状动脉梗塞、脑梗塞中风以及动静脉脉管梗塞等心脑血管疾病已经成为严重危害人们身体健康和生命安全的头号杀手。人们在攻克这种疾病的过程中，逐渐了解血栓形成的主要原因之一是人体血液中的纤维蛋白原在凝血酶作用下形成网状结构的纤维蛋白。因此，人们希望找到能溶解这些纤维蛋白的溶栓剂，使网状结构的纤维蛋白溶解，达到血液畅通流动的效果。如目前已经商品化的溶栓剂主要有从溶血链球菌培养液中分离获得的链激酶(简称SK)和从人尿液中提取纯化的尿激酶(UK)，以及采用基因工程方法生产的人组织型纤维溶酶激活剂(简称tPA)，由于这些溶栓剂均为人体内纤维溶酶原激活剂，故不能直接溶解血栓中的纤维蛋白。同时，这些溶栓剂在使用上均为静脉注射剂型，不能口服，只能用作治疗急性血栓病，不能用于血栓病的预防。在其制备上，由于制备工艺复杂，价格昂贵，难以广泛推广使用。
日本学者Sumi H等曾报道从日本传统发酵食品“纳豆”中分离到一种能分解纤维蛋白的蛋白酶，此称为纳豆激酶(简称NK)，并对其基因结构，理化性质等作了较为详细的研究，但至今仍未商品化，(Sumi.H，et al.Experientia，43(10)1110-1111，1987；Fujita.M，et al.Biol Pharm Bull 18(10)，1387～1391，1995)。
在中国专利(申请号97106442.3)一文中，提到从土壤、干草中定向分离到一大批细菌，并从中筛选到一株能大量产生并分泌到体外具有强烈降解纤维蛋白水解酶菌株，但该菌株的产酶能力仍较低，需进一步提高，且需对酶的基因结构，酶的主要特性，药理药效进一步进行研究。
基于目前溶栓剂发展的现状，本发明试图研制一种溶栓剂，它具有原料来源广泛，制备容易，纯化方便，价格较便宜，特异性强、疗效较显著，副作用小，适于口服，具有治疗和预防双功效的一种溶栓剂。
本发明的技术特征在于用基因工程的方法，将分离出的溶栓酶基因克隆到特定的载体上并转入经过改造的枯草杆菌受体中，获得能正确高效表达溶栓酶的基因工程菌。然后采用微生物发酵工程方法，经菌种接种培养发酵，分离纯化等步骤，使工艺简化、产量提高、质量符合口服制剂要求的溶栓剂。
本发明所用的菌株为从干草中定向筛选获得，并命名为MBL-1，其特征在于在固体或液体培养基中，通过培养可以产生分泌一种强烈溶解纤维蛋白的蛋白水解酶，按《伯杰氐细菌鉴定手册》方法，对菌株形态特征，生理生化特性等进行试验，根据试验结果进行综合分析比较，将MBL-1菌鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)MBL-1，其所产生的纤维蛋白水解酶称为芽激酶(Bacillus-Kinase，BK)。
本发明所述的溶栓剂-溶栓酶基因来自于MBL-1菌株，根据Nakaomura T.et al.报道(Biosci Biotec Biochem 56(11)1869-1871，1992)，设计一对引物，用常规方法提纯MBL-1染色体DNA，用基因扩增技术(PCR)扩增出DNA片段，用限制性核酸内切酶同时切PCR产物和pUB18质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳分离回收所需DNA片段，用T4DNA连接酶进行连接反应，得到重组DNA分子，转化受体菌，获得转化子，用含1％脱脂奶粉和卡那霉素(5μg/ml)的选择性平板筛选含有溶栓酶基因的转化子(带有透明圈的单克隆)，经鉴定获得基因工程菌。将基因工程菌的插入溶栓酶基因片段进行序列分析，由ABI自动测序仪完成，所得溶栓酶的结构基因序列如
图1所示。
本发明溶栓酶的结构基因由825个核苷酸构成，从核苷酸序列推导的氨基酸序列如图1所示。对溶栓酶的理化特性研究表明该酶为碱性丝氨酸蛋白酶，分子量为28000(SDS-PAGE电泳法)，进一步质谱分析，精确测定分子量为27735.37+6.99；其等电点为8.6。
本发明所述的溶栓剂-溶栓酶基因结构还包括其变体。技上述方法设计一对引物，用常规方法分离纯化MBL-1菌株染色体DNA，用严格控制反应条件的基因扩增技术扩增出DNA片段，用限制性核酸内切酶Bam HI和EcoRI同时切PCR产物和pUB18质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳分离回收所需DNA片段，用T4DNA连接酶进行连接反应，得到重组DNA分子，转化枯草杆菌受体细胞，获得转化子，用含1％脱脂奶粉和卡那霉素(5μg/ml)的选择性平板，筛选含有溶栓酶基因的转化子(带有透明圈的单克隆)，经鉴定获得基因工程菌。将基因工程菌的溶栓酶基因片段进行序列分析，由ABI自动测序仪完成，所得溶栓酶的结构基因序列与图1相比，第61位碱基为C，第21个密码子为CAC，其对应的氨基酸为H。第581位碱基为T，第194个密码子为TTT，其对应的氨基酸为F。这一基因结构变体所编码的酶具有强烈溶解纤维蛋白和溶解血栓能力。
本发明溶栓酶制剂，按陈奇方法(中药药理研究方法学，北京人民卫生出版社，1994年第一版)测定溶栓剂溶解人纤维蛋白和血块的实验结果表明该溶栓剂有很强的溶解人纤维蛋白和人血凝血块的能力；将溶栓剂作口服制剂给实验小白鼠和大白鼠口服试验结果表明，该溶栓剂能明显缩短血浆优球蛋白溶解时间，提高体内纤溶酶活性，提高tPA的分泌量；采用本发明溶栓剂对小鼠进行口服试验，其结果表明有明显降低全血粘度，抑制血栓的形成；按本发明实施例1、2方法制备的溶栓剂装入肠溶性胶囊给48-65岁人群自原者口服3天，经测试表明人血浆优球蛋白溶解时间缩短33～50％。这些结果显示本发明溶栓剂能明显诱导血管内皮细胞分泌tPA，提高人体的纤溶活性，从而起到防止血栓形成和溶解血栓的效能。
本发明溶栓剂来自于微生物发酵产物，可无限生长发酵，克服如UK那样原料来源困难，溶栓酶的菌为枯草芽孢杆菌，基因产物为外分泌型，这样可简化纯化工艺，同时安全性更好。本发明溶栓剂口服有效，可克服现有溶栓剂多为静脉滴注，起到预防和治疗双重疗效。
实施例1 将精选的优质大豆淘洗干净，以2-10％(W/V)浓度量放入盛有含无机复合盐的缓冲液容器中，经1.1-1.2kg/cm2压力高压蒸煮制备大豆浸出液，作发酵培养基，经高压灭菌后接入一定量的含有纤溶酶基因的基因工程菌，置于25-40℃条件下通气培养20-48小时，3000-8000转/分4℃离心10-30分钟，弃沉淀得上清液，加入分析纯固体硫酸铵，使其为30-85％的饱和度(或分级沉淀)，4℃静止沉淀过夜，3000-5000转/分4℃离心20分钟，弃上清液取沉淀物，将其溶解在含有2-10mM CaCl2的0.01MTris-HCl PH 7.0-7.5的缓冲液中，装入透析袋，用同样缓冲液4℃透析12-36小时，将透析液浓缩，冷冻干燥，制得溶栓酶制品。可直接用于制备口服制剂。
实施例2 按实施例1方法制备溶栓酶粗制品，将其溶解于5mMPH6.0磷酸缓冲液中，上样在预先用同样缓冲液平衡过的CMSepharose Fast Flow柱。上样后用含0～1M Nacl的同样缓冲液进行线性梯度洗脱，收集纤溶酶活性峰。用50-80％饱和度的固体硫酸铵沉淀纤溶酶，再上Sephadet G-75柱进行凝胶过滤，流动相为含0.05M Nacl的0.1M PH 7.5的磷酸缓冲液，收集活性峰，硫酸铵沉淀透析脱盐，冷冻干燥，得溶栓酶精制品。
实施例3 按实施例1或2制备的溶栓酶溶解在0.03M PH7.8的磷酸缓冲液中成一定浓度，分别取10ul加入三种经不同处理的纤维蛋白平板上(参照Astrup T.et al.Biochem.Biophs，40346-351，1952)。即含有纤溶酶原的人纤维蛋白平板和经80℃处理2小时使纤溶酶原失活的人纤维蛋白平板及不含纤溶酶原的牛纤维蛋平板，并与UK样品作对照，37℃保温5小时，用卡尺精确测量样品孔周围透明圈的大小。结果表明在含有纤溶酶原的不加热人纤维蛋白平板上，BK溶栓酶和UK都能产生大小相似的透明圈；在加热平板(纤溶酶原失活)上UK样品周围无透明圈出现，BK样品周围仍然有透明圈，表明BK溶栓酶有直接纤溶酶活性；而在不含纤溶原的牛纤维蛋白平板上，同时加有BK溶栓酶和纤溶酶原的样品孔周围透明圈明鲜大于只加BK溶栓酶样品孔周围的透明圈，只加纤溶酶原样品孔周围无任何透明圈，表明BK溶栓酶具有激活纤溶酶原成纤溶酶的能力。
实施例4 按实施例1，制备的BK溶栓酶溶解在生理盐水中，制成一定浓度的溶栓酶溶液，按5400u/kg/天给昆明种小白鼠口服，连续3天，取血测定血浆纤溶酶活性和血浆中tPA(按检测试剂说明书进行操作)。结果表明，药组血浆纤溶活性比对照组增加30％，tPA含量增加51％。
实施例5 按实施例2制备的BK溶栓酶溶解在生理盐水中，制成不浓度的溶栓酶溶液，用微电脑血栓检测仪在体外试验BK溶栓酶抑制血栓形成和溶解血栓的效果(具体方法按血栓检测仪说明书进行)。结果见表1、2。
表1，BK溶栓酶抑制血栓形成作用
表2，BK溶栓酶溶解血栓作用
表1、2结果说明BK溶栓酶在体外能明鲜抑制血栓形成和溶解已经形成的血栓并随着酶浓度的增加，血栓长度、湿重、干重均随之减少，具有一定量效关系。
权利要求
1.本发明系溶栓剂，其特征在于该溶栓剂的主要有效成份是由特异性枯草芽孢杆菌产生的纤维蛋白水解酶，后者系采用基因工程方法从干草中获得的枯草芽孢杆菌染色体DNA中，克隆出目的基因片段，与载体连接组成重组DNA分子，转化特定受体菌获得基因工程菌，再经微生物发酵，分离纯化获得。具体步骤包括(1)按常规方法提取纯化枯草杆菌MBL-1染色体DNA；(2)根据特定DNA顺序设计一对特异性引物，通过基因扩增(PCR)技术扩增出特定DNA片段；(3)用BamHI和EcoRI限制性核酸内切酶切开PCR扩增产物和质粒载体pUB18DNA；(4)用1％浓度琼脂糖凝胶电泳分离回收所需DNA片段；(5)将回收的DNA片段与pUB18载体DNA混和并通过T4DNA连接酶进行连接，得到重组DNA分子；(6)用重组DNA分子转化枯草杆菌DB403；(7)在含有脱脂奶粉(1％浓度)和卡那霉素(5μg/ml)的选择性平板筛选带有透明圈的单菌落；(8)经鉴定获得带目的基因的基因工程菌；(9)用ABI DNA自动测序仪测定基因工程菌中表达溶栓酶基因的核昔酸顺序，获得的顺序为，GCGCAATCTG TTCCTTATGG CATTTCTCAA ATTAAAGCGC CGGCTCTTCA CTCTCAAGGCA Q S V P Y G I S Q I K A P A L H S Q GTACACAGGCT CTAACGTAAA AGTAGCTGTT ATCGACAGCG GAATTGACTC TTCTCATCCTY T G S N V K V A V I D S G I D S S H PGACTTAAACG TCAGAGGCGG AGCAAGCTTC GTTCCTTCTG AAACAAACCC ATACCAGGACD L N V R G G A S F V P S E T N P Y Q DGGCAGTTCTC ACGGTACGCA TGTCGCCGGT ACGATTGCCG CTCTTAATAA CTCAATCGGTG S S H G T H V A G T I A A L N N S I GGTTCTGGGCG TAGCGCCAAG CGCATCATTA TATGCAGTAA AAGTGCTTGA TTCAACAGGAV L G V A P S A S L Y A V K V L D S T GAGCGGCCAAT ATAGCTGGAT TATTAACGGC ATTGAGTGGG CCATTTCCAA CAATATGGATS G Q Y S W I I N G I E W A I S N N M DGTTATCAACA TGAGCCTTGG CGGACCTACT GGTTCTACAG CGCTGAAAAC AGTAGTTGATV I N M S L G G P T G S T A L K T V V DAAAGCGGTTT CCAGCGGTAT CGTCGTTGCT GCCGCAGCCG GAAACGAAGG TTCATCCGGAK A V S S G I V V A A A A G N E G S S GAGCACAAGCA CAGTCGGCTA CCCTGCAAAA TATCCTTCTA CTATTGCAGT AGGTGCGGTAS T S T V G Y P A K Y P S T I A V G A VAACAGCAGCA ACCAAAGAGC TTCATTCTCC AGCGTAGGTT CTGAGCTTGA TGTAATGGCTN S S N Q R A S F S S V G S E L D V M ACCTGGCGTGT CCATCCAAAG CACACTTCCT GGAGGCACTT ACGGCGCTTA TAACGGAACGP G V S I Q S T L P G G T Y G A Y N G TTCCATGGCGA CTCCTCACGT TGCCGGAGCA GCAGCGCTAA TTCTTTCTAA GCACCCGACTS M A T P H V A G A A A L I L S K H P TTGGACAAACG CGCAAGTCCG TGATCGTTTA GAAAGCACTG CAACATATCT TGGAAACTCTW T N A Q V R D R L E S T A T Y L G N STTCTACTATG GAAAAGGGTT AATCAACGTA CAAGCAGCTG CACAAF Y Y G K G L I N V Q A AA Q(10) 在上述第(2)步PCR扩增操作中，在严格控制反应条件下获得溶栓酶基因结构变体，与图1相比，该变体的第61位碱基为C，第21个密码子为CAC，其对应的氨基酸为H。第581位碱基为T，第194个密码子为TTT其对应的氨基酸为F。这一基因结构变体所编码的酶具有强烈溶解纤维蛋白和溶解血栓能力。
2.根据权项1所述的溶栓剂，其特征在于由含有溶栓酶基因的基因工程菌，通过微生物液体发酵，分离纯化获得，将溶栓酶与淀粉等辅料以重量比1∶50～1∶300的比例混和，灌装成胶囊作为预防和治疗血栓栓塞性疾病的药物。
3.根据权项1、2所述的溶栓剂，其特征在于将溶栓酶与淀粉等辅料以重量比1∶50～1∶300的比例混和，灌装成肠溶性胶囊，以口服溶栓剂剂型作为预防和治疗血栓栓塞性疾病的药物。
4.根据权项1所述的溶栓剂，其特征在于作为保健食品的组成成份。
全文摘要
本发明涉及采用基因工程技术,通过PCR基因扩增从特定枯草芽孢杆菌中“钓“出能强烈分解纤维蛋白的蛋白水解酶基因,再经转化获得基因工程菌,由基因工程菌经培养发酵分离,纯化,获得溶栓酶制剂。经试验,表明本溶栓剂具有溶解纤维蛋白(原),特别是溶解交联纤维蛋白的能力,有效抑制血栓形成和溶解血栓基质,使血流畅通,作口服液,可预防和治疗心脑血管疾病,本发明溶栓剂原料来源广经济,工艺成熟,提取简便,成本低。
文档编号C12N15/00GK1263778SQ99125780
公开日2000年8月23日 申请日期1999年12月27日 优先权日1999年12月27日
发明者吴自成, 戚蓓静, 彭欣夏, 黄静, 方为军, 王林发 申请人:华东师范大学