专利名称：用来检测纸制品及纸生产过程中孢子形成细菌的引物的制作方法
技术领域：
本发明的背景纸产品的微生物学质量对必须符合强制标准的食物包装等级材料和液体板的生产商来说是至关重要的。其它纸等级产品例如棉纸或纸杯通常也遵守这些规定。在美国关于食物包装等级材料的最新规定是每千克纸250个孢子，这是通过Dairyman的方法来测定的，它是一种对48小时孵育过程的平板计数法。一种对污染问题的更快速诊断能够显著减少废品的产生及提高工厂的整体生产力。
纸制品给一系列微生物提供了许多良好的生长环境。其中对孢子形成细菌(SFB)的控制是费用最高和最持久的问题之一。与其它细菌不同，SFB能通过产品的干燥阶段，而当纸产品用于食品包装时，造成污染。孢子对除毒性最大的杀菌剂以外的大多数杀菌剂具有抵抗性。这些化合物在工厂里涉及到健康及安全，在工厂外涉及环境问题。许多芽孢杆菌及类芽孢杆菌可产生与食物腐坏有关的酶，例如酪蛋白酶及淀粉酶。大规模的工业化趋势对用于食物包装纸的微生物质量越来越关注。通常含有淀粉及表面盖覆物质的再生纤维能支持微生物的生长。随着在生产中使用再生物质的增加，最终产品的污染机会也相应增加。再生纤维增加的同时，要求减少用于控制微生物生长的杀菌剂的使用。在有必要同时使用杀菌剂时，用于控制(污染)问题数量的对产品质量的快速、可靠、简单及节约费用的监测可以提高整体的生产效率。
在具体实施方案中，本发明涉及下列序列片段1、命名为BCF的正向引物，其核苷酸序列为5’CAA GAA GAT GTG ACG AAA 3’(SEQ ID NO.1)2、命名为BCR1的反向引物，其核苷酸序列为5’GTT GTA TTA TAT TTC TTT GC 3’(SEQ ID NO.2)3、命名为BCR2的反向引物，其核苷酸序列为5’GTT GTG TTA AAT TTT TTG GC 3’(SEQ ID NO.3)本发明的一个重要方面是制备用于PCR扩增的样品的方法。孢子对大多数细胞裂解的方法具有极强的耐受性，因此造成了提取DNA的复杂化。本发明方法包含一个孢子发芽(或复活)过程。这一步是将静止的孢子转变为有生长能力的细胞，随后通过煮沸来裂解。从裂解细胞中释放的DNA可以作为PCR扩增合适的模板。此外，煮沸裂解法不要求用溶剂提取或样品的乙醇沉淀。这些特点加快了裂解时间，减少了花费并且不需要处理溶剂。
通过是否出现大小在346到365个碱基对范围内的基因片段来判定孢子形成细菌的存在。这个片段可通过琼脂糖凝胶电泳并通过与DNA标准分子量的比较看到。本发明的详细描述本发明涉及用来快速检测纸产品，添加剂，加工过程中孢子形成细菌的核苷酸引物及PCR方法。这些引物被设计成可用来扩增出所有孢子形成细菌中共有的而与特殊的种群无关的基因(例如本发明引物可从枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌或产气荚膜梭菌中扩增出基因)。由于不要求在实验基质中培养细菌，所以极大地减少了检测孢子形成微生物所需的时间。这些因素使这种方法可用于现场检测。
该方法以DNA的碱基互补为基础。DNA是由核苷酸“碱基”组成的两条反向平行链构成。这些碱基，包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，互相形成特有的氢键。腺嘌呤与胸腺嘧啶配对及鸟嘌呤与胞嘧啶配对的DNA双链能通过碱处理或加热的方法变性或转变成单链。当条件合适时，DNA将重新形成双链。聚合酶链式反应即PCR法(Mullis，U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202，及4,800,159)是将目标DNA区段扩增到可检测水平所通常使用的方法。近来它被用来检测许多病原细菌。在这个过程中，与目标区的两侧区域互补的包含特异序列的DNA引物通过一种DNA聚合酶来引导DNA的酶促合成。DNA聚合酶要求引物来启动互补DNA链的合成。引物是核苷酸短片段(15-22碱基)。在PCR过程中通过温度在退火步骤中控制引导过程。每个引物的退火条件根据试验来确定，以便提高特异性。退火后，当聚合酶合成互补DNA链时聚合发生。聚合后，PCR反应物被加热到使所有双链DNA变性。通过使用从高度耐热的栖热水生菌分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶进行退火，聚合，变性的反复循环可以保证酶不失活。PCR扩增是使用自动热循环设备的常规试验方法。结果可以使目标DNA片段指数倍的扩增。扩增的目的片段可通过琼脂糖凝胶电泳检测到。
本发明侧重于介导孢子形成过程中进化上保守的基因。种系发生各异的细菌的一个亚群可形成孢子。目前发现的孢子形成细菌大多数为芽孢杆菌属(好氧菌)及梭菌属(厌氧菌)的成员。孢子的形成是复杂的发育过程，是对不利的环境条件及在严格的细胞生理条件下的反应。热，饥饿及化学干扰是一些但不是全部可诱导孢子形成的因素。涉及早期孢子形成的基因在种与种之间具有高度的同源性。spoOA是这样的基因，它被称为是孢子形成中的“主要开关”。spoOA编码与信号传导有关的激酶，通过磷酸化使这个过程中其它基因活化。spoOA激酶的磷酸化状态提示它在细胞中的活性。由于在启动孢子形成中的重要作用，spoOA是高度保守基因并成为用于PCR检测的良好靶基因。
本发明中描述的引物是通过大量孢子形成细菌的spoOA的序列对比得到的。核酸序列比较软件阐明了基因的高度保守区。从这些区域选择特定的引物位点并合成合适的引物。通过反复试验来决定引物的最佳序列。引物最后的确定遵循以下标准i.从鉴定的孢子形成细菌扩增出spoOA产物ii.非孢子形成细菌不能产生目的产物iii.从纸或纸产品样品分离出的未鉴定的孢子形成细菌中扩增出spoOA。
所有的细菌通过标准试验方法来测定孢子形成的能力。培养物80℃放置10分钟，随后涂在生长培养基上，经过热处理能存活的细菌具有产生孢子的能力。表1概述了用于在一系列不同细菌培养物包括格兰氏阳性非孢子形成细菌上进行试验的引物性质的数据。这个引物套预计可以从枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌上分别扩增出356碱基对(bp)及347碱基对(bp)的片段。在孢子形成试验被检测为阳性的所有细菌都可产生在347-356bp范围的PCR产物。
表1显示了引物套从一系列已鉴定的孢子形成细菌及未鉴定的造纸厂孢子形成细菌中扩增spoOA基因的能力。其中也包括一系列不含spoOA基因的非孢子形成细菌，其不能产生目的带。
这些引物可用来筛选从纸，纸生产流程水或添加剂提取的DNA，以检测孢子形成细菌的存在。这一方法与传统涂板技术相比极大地减少了周转时间。本发明的另一方面是孢子形成细菌DNA提取方法。
表1 在这项研究中用到的菌株
*美国典型培养物保藏中心**非孢子形成生物体下列步骤导致了在纸及纸生产基质中孢子形成细菌的成功检出。样品例如纸(用水混合)，淀粉，或蛋白能够被分析是否污染了孢子形成细菌。
i.样品中加入等体积胰胨豆胨培养基37℃放置45分钟(1毫升样品即足以对于分析液体物质)，这使孢子活化成有生长力的形式，从中提取DNA。
ii.煮沸样品10分钟以裂解细胞并释放DNA。
iii.等份的样品，通常为5微升，用于PCR扩增。
iv.等份的样品与20微升水，PCR珠(如U.S专利5,593,824中所描述，本文引入作参考)，及含有上述正向和两个反向引物的2微升引物混合物混合。
v.热循环如下94℃ 5分钟94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 30秒，反复30个循环72℃ 3分钟vi.PCR反应物与电泳上样贮存染料混合，在2％的琼脂糖凝胶上电泳。
vii.将琼脂糖凝胶染色观察目的产物。
一些样品可能含有土或防腐剂，它们能够干扰PCR的扩增。在很多情况下，将样品材料用胰胨豆胨培养基进行10倍或100倍的稀释可克服这种抑制。在检测任何样品时都需有阳性及阴性对照，电泳时需有标准分子量。
下列是说明使用本发明程序的实施例。这些实施例不认为是限制性的。
下面表1显示了在3个不同的纸样品中PCR孢子检测的限度。
表1纸样品孢子数/0.5克纸spoOA PCR结果非纸样品1171±6.0+非纸样品122±1.0 -A114.5±1.5 +A1.5±0.5-B59±6.0 +B7±7.0 -C149±1.0+C9.5±18.5 -1是蜡状芽孢杆菌孢子的培养物，没有纸样品存在尽管本发明针对具体实施方案已加以描述，但对于本领域技术人员来说本发明的众多其它形式及改进是显而易见的。附加的权利要求及本发明通常应该被解释为可以覆盖所有上述的包含在本发明的主旨范围内的明显的其它形式和改进。
权利要求
1.一种用于系统地鉴别孢子形成细菌中孢子形成基因的方法，该方法包括a)使用选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，及SEQ ID NO.3的引物从所述的孢子形成细菌的总细胞DNA中扩增出所述基因的一部分；b)检测扩增产物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的孢子形成细菌是好氧菌。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的好氧孢子形成细菌选自蜡状芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌及球形芽孢杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的孢子形成细菌是厌氧菌。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的厌氧孢子形成细菌是产气荚膜梭菌。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的孢子形成细菌是格兰氏阳性菌。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的扩增反应可以产生一个大小范围在346-365核苷酸长的多核苷酸。
全文摘要
本发明描述了一种用聚合酶链反应(PCR)技术检测纸制品、纸生产流程和添加剂中的孢子形成细菌的方法。所公开的和要求保护的是可以用来特异性扩增孢子形成细菌中共有的孢子形成基因的新核苷酸引物。这些引物所扩增的基因片段可以用于对孢子形成细菌的存在进行诊断。
文档编号C12N15/09GK1307644SQ99806669
公开日2001年8月8日 申请日期1999年4月21日 优先权日1998年5月27日
发明者亚历山大·W·布林, 弗雷迪·L·辛格尔顿 申请人:贝茨迪尔博恩公司