本发明属于烟草烘烤技术领域，具体涉及一种能有效降低烤烟tsnas含量以提高烟叶品质的利用菌种降低不同品种烤烟tsnas的烘烤方法。
背景技术：
tsnas是烟草特有的n-亚硝胺基类化合物，同时也是影响人体健康的主要有害物质之一。在目前已鉴定出的8种tsnas中，nnn、nat、nab和nnk4种含量较高，其nnn与nnk均为动物强致癌物，其危害性在通过不吸烟而长期闻鼻烟者口腔癌的高发率研究中得到证实。研究表明，烟草种类、烟草结构组织、烟草栽培、烟草烘烤及土壤微生物群落、施肥用量等因素均对烟草中tsnas含量有关。此外，大量研究还表明tsnas在成熟采收的鲜烟叶中含量极低，其主要在调制和烘烤过程中产生和积累。前人虽从农业技术、调制技术、生物技术等多方面探索了降低烟叶中tsnas的方法，虽然现有技术中使用菌种降解tsnas的方法有用于污染物的定向清理、饮用水的净化等，烟草中也有将菌液用于白肋烟晾晒和沉降，但利用菌种在烘烤过程中降低烟叶中tsnas较为少见，针对特定品种烤烟降低tsnas含量的方法鲜有报道。
因此，针对烘烤过程中烟叶内的水、热交换特点，通过探索利用特定菌种，结合烟叶烘烤过程中烤房干燥室内环境温湿度阶段变化，在密集烤房烘烤过程中定向降解tsnas，从而对提高烟草品质，减低烟草tsnas对人体健康及生活环境带来的危害均具有非常重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种能有效降低烤烟tsnas含量以提高烟叶品质的利用菌种降低不同品种烤烟tsnas的烘烤方法。
本发明是这样实现的：包括采收、编杆、接种、装炉、烘烤步骤，具体步骤如下：
a、采收：采收成熟度适宜的烤烟鲜烟叶；
b、编杆：将采收的鲜烟叶进行分类后编竿；
c、接种：用05-101、j45、j54中至少一种菌种配制od600值为1的菌液，然后将菌液均匀喷洒接种于已编杆的烟叶表面；
d、装炉：将接种后的已编杆烟叶装入密集烤房；
e、烘烤：将装炉后的烟叶进行烘烤，经过变黄期、定色期和干筋期，即可得到低tsnas的烟叶。
本发明的有益效果为：
1、本发明首次将菌种用于烟叶烘烤过程中以降低烤烟中tsnas含量，在提高烤烟质量的同时，也证明了菌种在烟叶烘烤中的独特作用。
2、本发明通过特别筛选的05-101（保藏编号为cctccno：m2019665）、j45（保藏编号为cctccno：m2019666）、j54（保藏编号为cctccno：m2019667）菌种，将其分别以及混合使用来降低烤烟中tsnas含量，效果明显，从而有利于提高烟草品质，也扩宽了菌种的使用范围。
3、本发明针对特定的烤烟品种：红花大金元、k326、krk26，其中红花大金元和k326为云南本地品种，krk26为津巴布韦引进品种，都是目前主栽的优质烤烟种植品种，对保障并提高核心烟叶原料具有重要作用。
4、本发明基于05-101、j45、j54菌种自身繁衍特性，通过在变黄期调控温、湿度计温度和烘烤时间，并与定色期和干筋期烘烤工艺进行优化组合，给菌种提供了适于生存的环境，从而提高接种菌种的存活率及活跃度，特别是通过延长适宜菌种降解tsnas活性的变黄期烘烤时间，提高了tsnas的降解率，从而显著降低了烟草tsnas对人体健康及生活环境带来的危害。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
本发明包括采收、编杆、接种、装炉、烘烤步骤，具体步骤如下：
a、采收：采收成熟度适宜的烤烟鲜烟叶；
b、编杆：将采收的鲜烟叶进行分类后编竿；
c、接种：用05-101、j45、j54中至少一种菌种配制od600值为1的菌液，然后将菌液均匀喷洒接种于已编杆的烟叶表面；
d、装炉：将接种后的已编杆烟叶装入密集烤房；
e、烘烤：将装炉后的烟叶进行烘烤，经过变黄期、定色期和干筋期，即可得到低tsnas的烟叶。
所述05-101菌种的分类命名为alcaligenesaquatilis05-101，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为cctccno.m2019665。
所述j45菌种菌种的分类命名为bacillusaltitudinisj45，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为cctccno.m2019666。
所述j54菌种的分类命名为bacillusaltitudinisj54，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为cctccno.m2019667。
所述c步骤中od600值为1的菌种溶液均匀喷洒烟叶的用量为烟叶重量的3～5%。
所述c步骤中烟叶表面喷洒菌液后直接装炉烘烤。
所述a步骤中烤烟的烟株下、中、上3个部位烟叶适宜成熟度对应的鲜烟叶spad值分别为8.6～11.4、17.9～18.6和13.2～20.3，或者适宜成熟的鲜烟叶标准为茎叶角度87～93°，或者适宜成熟的鲜烟叶标准为主脉变白发亮，支脉退青变白，叶片呈绿黄色、浅黄色且茸毛大部分脱落，手触摸后有丰富烟油的烤烟烟叶。
所述a步骤中的烤烟品种包括红花大金元、k326、krk26。
所述b步骤中烟叶的编烟量为90～110片/竿。
所述d步骤中密集烤房的装烟量为540～580竿/炉，装烟密度为40～45kg/m³，装烟至烤房容积的95%以上。
所述e步骤中红花大金元品种烟叶的烘烤包括变黄期控制、定色期控制、干筋期控制分步骤，具体分步骤如下：
e11、变黄期控制：变黄期包括变黄初期、变黄中期及变黄后期，所述变黄初期以1℃/h的升温速率，将烤房干燥室内的干球温度由室温升至33～34℃，湿球温度由室温升至32～33℃，然后稳定干、湿球温度烘烤16～20h；所述变黄中期在变黄初期结束后以1℃/h的升温速率，将干球温度升至38～39℃，湿球温度调整至37～38℃，然后稳定干、湿球温度烘烤24～28h；所述变黄后期在变黄中期结束后以1℃/h的升温速率，将干球温度升至42～43℃，湿球调整升至38～39℃，然后稳定干、湿球温度烘烤16~20h至底台烟叶完全变黄结束；
e21、定色期控制：底色期包括定色初期、定色后期，所述定色初期在e11分步骤结束后以0.5℃/h的升温速率，将干球温度升至47～48℃，湿球温度调整至37～38℃，然后稳定干、湿球温度烘烤12～16h至顶台烟叶完全变黄；所述定色后期在定色初期结束后以0.5℃/h的升温速率，将干球温度升至53～54℃，湿球温度升至38～39℃，然后稳定干、湿球温度烘烤20～24h至全烤房烟叶的支脉和叶肉干燥结束；
e31、干筋期控制：在e21分步骤结束后在干球温度60℃以前，烧大火，大排湿，之后逐渐改烧中火，减少进风口排湿量，以1℃/h的升温速率，将干球温度升至67～68℃，湿球温度调整至39～40℃，然后稳定干、湿球温度烘烤20～30h至全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
所述e步骤中k326品种烟叶的烘烤包括变黄期控制、定色期控制、干筋期控制分步骤，具体分步骤如下：
e12、变黄期控制：变黄期包括变黄初期、变黄中期及变黄后期，所述变黄初期以1℃/1～2h的升温速率，将烤房干燥室内的干球温度由室温升至34～35℃，湿球温度由室温升至32～33℃，然后稳定干、湿球温度烘烤14～18h；所述变黄中期在变黄初期结束后以1℃/1～2h的升温速率，将干球温度升至38～40℃，湿球温度调整至36～37℃，然后稳定干、湿球温度烘烤20～22h；所述变黄后期在变黄中期结束后以1℃/1～2h的升温速率，将干球温度升至42～43℃，湿球调整升至36～37℃，然后稳定干、湿球温度烘烤14~18h至底台烟叶完全变黄结束；
e22、定色期控制：底色期包括定色初期、定色后期，所述定色初期在e12分步骤结束后以1℃/1～2h的升温速率，将干球温度升至45～47℃，湿球温度调整至36～38℃，然后稳定干、湿球温度烘烤10～14h至顶台烟叶完全变黄；所述定色后期在定色初期结束后以1℃/1～2h的升温速率，将干球温度升至55～57℃，湿球温度升至38～40℃，然后稳定干、湿球温度烘烤24～30h至全烤房烟叶的支脉和叶肉干燥结束；
e32、干筋期控制：在e22分步骤结束后以1℃/1～2h的升温速率，将干球温度升至66～68℃，湿球温度调整至40～42℃，然后稳定干、湿球温度烘烤20～26h至全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
所述e步骤中krk26品种烟叶的烘烤包括变黄期控制、定色期控制、干筋期控制分步骤，具体分步骤如下：
e13、变黄期控制：变黄期包括变黄初期、变黄中期及变黄后期，所述变黄初期以1℃/2h的升温速率，将烤房干燥室内的干球温度由室温升至34～35℃，湿球温度由室温升至33～34℃，然后稳定干、湿球温度烘烤10～14h；所述变黄中期在变黄初期结束后以1℃/2h的升温速率，将干球温度升至37～38℃，湿球温度调整至35～36℃，然后稳定干、湿球温度烘烤16～18h；所述变黄后期在变黄中期结束后以1℃/2h的升温速率，将干球温度升至38～39℃，湿球调整升至35～37℃，然后稳定干、湿球温度烘烤10~14h至底台烟叶完全变黄和主脉变软结束；
e23、定色期控制：底色期包括定色初期、定色中期、定色后期，所述定色初期在e13分步骤结束后以1℃/2h的升温速率，将干球温度升至40～42℃，湿球温度调整至36～37℃，然后稳定干、湿球温度烘烤12～16h至支脉全变白、叶片1/3左右干燥；所述定色中期在定色初期结束后以1℃/h的升温速率，将干球温度升至46～48℃，湿球温度调整至36～38℃，然后稳定干、湿球温度烘烤18～22h至全烤房烟叶的主脉全变白、叶片2/3以上干燥、具闻香感；所述定色后期在定色中期结束后以1℃/h的升温速率，将干球温度升至54～56℃，湿球温度升至38～39℃，然后稳定干、湿球温度烘烤10～14h至全烤房烟叶叶片全干和高温层主脉干1/2结束；
e33、干筋期控制：在e23分步骤结束后以1℃/h的升温速率，将干球温度升至65～67℃，湿球温度调整至39～40℃，然后稳定干、湿球温度烘烤26～30h至全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
所述密集烤房为气流下降式密集烤房。
实施例1本发明烘烤工艺对红花大金元烟叶中tsnas含量的影响
s100：采收云南省大理州下关镇成熟度适宜的红花大金元烤烟鲜烟叶，成熟度适宜的鲜烟叶具有主脉变白发亮，支脉退青变白，叶片呈绿黄色、浅黄色，且茸毛大部分脱落，手触摸后有丰富烟油的特征。
s200：将上述采收的鲜烟叶按90～110片/竿的编烟量进行分类编竿。
s300：按烟叶重量3～5%的量用od600值为1的菌液均匀喷洒接种于已编杆的烟叶表面。
s400：将接种后的已编杆烟叶按540～580竿/炉的装烟量、40～45kg/m³的装烟密度，装入气流下降式密集烤房内至容积的95%以上。
s500：将装炉后的烟叶进行烘烤，经过变黄期间、定色期和干筋期，即可得到低tsnas的烟叶。
s300中的菌液采用05-101、j45、j54菌种分别配制。其中：t0为不接种前述菌种的清水空白对照液；t1菌液采用05-101菌种配制；t2菌液采用j45菌种配制；t3菌液采用j54菌种配制；t4菌液采用05-101、j45、j54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。
s500中的变黄期包括变黄初期、变黄中期和变黄后期，变黄初期是以1℃/h的升温速率，将烤房干燥室内的干球温度从26℃升到33℃，湿球温度从24℃升到32℃，稳定温度干、湿球温度烘烤18h；接着进入变黄中期，变黄中期是以1℃/h的升温速率，将烤房干球温度升到39℃，调整湿球温度升至37℃，稳定温度干、湿球温度烘烤26h；接着进入变黄后期，以1℃/h的升温速率，将烤房干燥室内的干球温度到42℃，调整湿球温度到38℃，稳定温度干、湿球温度烘烤18h，烤到底台烟叶完全变黄；定色期包括定色前期和定色后期，定色前期是以0.5℃/h的升温速率，将干球温度升至47℃，湿球温度调整至37℃，稳定干、湿球温度，烘烤14h左右，烤到顶台烟叶完全变黄；接着进入定色后期，以0.5℃/h的升温速率，将干球温度升至53℃，湿球温度调整至38℃，稳定干、湿球温度，烘烤22h，烤到全烤房烟叶的支脉和叶肉干燥；干筋期是在干球温度60℃以前，烧大火，大排湿，之后逐渐改烧中火，减少进风口排湿量，以1℃/1h的升温速率，将干球温度升至67℃，湿球温度调整至39℃，然后稳定干、湿球温度，烘烤25h，烤到全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
上述处理作为实验组a，在此基础上设立实验组b。
实验组b：变黄期中期调整湿球温度升至38℃，烘烤时间调整为24h；变黄期后期，调整湿球温度升至39℃，烘烤时间调整为20h。
实验组a、b各进行5个处理。
表1红花大金元烤烟品种优化工艺烤后烤烟tsnas含量对比
实施例2常规烘烤工艺对红花大金元烟叶中tsnas含量的影响
在实施例1的基础上设立对照实验：实施例1的变黄期中期湿球温度调整为36℃，烘烤时间调整为22h；变黄期后期湿球温度调整升至37℃，烘烤时间调整为14h；其它工艺参数不变。
表2红花大金元烤烟品种常规工艺烤后烤烟tsnas含量对比
由表1可知，红花大金元在本发明的优化工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了21.29～23.97%；由表2可知，红花大金元常规工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了17.41～20.43%，故接种菌种能够显著降低烤烟tsnas含量，而本发明的优化工艺比常规工艺效果更显著。
实施例3本发明烘烤工艺对红花大金元烟叶菌种活性的影响
根据实施例1、2，在烘烤变黄初期结束进入变黄后期时测定此时烟叶单位叶片的菌种活菌数以及no2-含量。
表3单位面积烟叶有效活菌数和no2-含量对比
由表3可知，本方法工艺和常规工艺相比，其单位面积有效活菌数明显要高，其清除亚硝胺的前体物质no2-的能力更强，故证实了本方法工艺能够提高菌种的成活率。
实施例4本发明烘烤工艺对k326烟叶中tsnas含量的影响
s100：采收云南省大理州下关镇成熟度适宜的k326烤烟鲜烟叶，成熟度适宜的鲜烟叶具有主脉变白发亮，支脉退青变白，叶片呈绿黄色、浅黄色，且茸毛大部分脱落，手触摸后有丰富烟油的特征。
s200：将上述采收的鲜烟叶按90～110片/竿的编烟量进行分类编竿。
s300：按烟叶重量3～5%的量用od600值为1的菌液均匀喷洒接种于已编杆的烟叶表面。
s400：将接种后的已编杆烟叶按540～580竿/炉的装烟量、40～45kg/m³的装烟密度，装入气流下降式密集烤房内至容积的95%以上。
s500：将装炉后的烟叶进行烘烤，经过变黄期间、定色期和干筋期，即可得到低tsnas的烟叶。
s300中的菌液采用05-101、j45、j54菌种分别配制。其中：t0为不接种前述菌种的清水空白对照液；t1菌液采用05-101菌种配制；t2菌液采用j45菌种配制；t3菌液采用j54菌种配制；t4菌液采用05-101、j45、j54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。
s500中的变黄期包括变黄初期、变黄中期和变黄后期，变黄初期是以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度由室温升至34℃，湿球温度由室温调整至32℃，稳定干、湿球温度，烘烤16h；接着进入变黄中期，变黄中期是以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度升至39℃，湿球温度调整至36℃，稳定温度干、湿球温度烘烤22h；接着进入变黄后期，以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度升至42℃，湿球温度调整至36℃，稳定干、湿球温度，烘烤16h，烤到底台烟叶完全变黄；定色期包括定色初期、定色后期，定色初期是以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度升至46℃，湿球温度调整至37℃，稳定干、湿球温度，烘烤12h到顶台烟叶完全变黄；接着进入定色后期，以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度升至56℃，湿球温度调整至39℃，稳定干、湿球温度，烘烤28h，烤到全烤房烟叶的支脉和叶肉干燥；干筋期以1℃/1~2h的升温速率，将干球温度升至67℃，湿球温度调整至41℃，稳定干、湿球温度，烘烤24h，烤到全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
上述处理作为实验组a，在此基础上设立实验组b。
实验组b：变黄期中期调整湿球温度升至37℃，烘烤时间调整为20h；变黄期后期，调整湿球温度升至37℃，烘烤时间调整为14h。
实验组a、b各进行5个处理。
表4k326烤烟品种优化工艺烤后烤烟tsnas含量对比
实施例5常规烘烤工艺对k326烟叶中tsnas含量的影响
在实施例4的基础上设立对照实验：实施例4的变黄期中期湿球温度调整为35℃，烘烤时间调整为18h；变黄期后期湿球温度调整升至35℃，烘烤时间调整为12h；其它工艺参数不变。
表5k326烤烟品种常规工艺烤后烤烟tsnas含量对比
由表4可知，k326在本发明的优化工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了21.37～23.90%；由表5可知，k326常规工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了16.88～20.32%，故接种菌种能够显著降低烤烟tsnas含量，而本发明的优化工艺比常规工艺效果更显著。
实施例6本发明烘烤工艺对k326烟叶菌种活性的影响
根据实施例4、5，在烘烤变黄初期结束进入变黄后期时测定此时烟叶单位叶片的菌种活菌数以及no2-含量。
表6单位面积烟叶有效活菌数和no2-含量对比
由表6可知，本方法工艺和常规工艺相比，其单位面积有效活菌数明显要高，其清除亚硝胺的前体物质no2-的能力更强，故证实了本方法工艺能够提高菌种的成活率。
实施例7本发明烘烤工艺对krk26烟叶中tsnas含量的影响
s100：采收云南省大理州下关镇成熟度适宜的krk26烤烟鲜烟叶，成熟度适宜的鲜烟叶具有主脉变白发亮，支脉退青变白，叶片呈绿黄色、浅黄色，且茸毛大部分脱落，手触摸后有丰富烟油的特征。
s200：将上述采收的鲜烟叶按90～110片/竿的编烟量进行分类编竿。
s300：按烟叶重量3～5%的量用od600值为1的菌液均匀喷洒接种于已编杆的烟叶表面。
s400：将接种后的已编杆烟叶按540～580竿/炉的装烟量、40～45kg/m³的装烟密度，装入气流下降式密集烤房内至容积的95%以上。
s500：将装炉后的烟叶进行烘烤，经过变黄期间、定色期和干筋期，即可得到低tsnas的烟叶。
s300中的菌液采用05-101、j45、j54菌种分别配制。其中：t0为不接种前述菌种的清水空白对照液；t1菌液采用05-101菌种配制；t2菌液采用j45菌种配制；t3菌液采用j54菌种配制；t4菌液采用05-101、j45、j54三种菌种按1：1：1的重量比混合配制。
s500中的变黄期包括变黄初期、变黄中期和变黄后期，变黄初期是以1℃/2h的升温速率，将干球温度由室温升至34℃，湿球温度由室温调整至33℃，稳定干、湿球温度，烘烤12h；接着进入变黄中期，变黄中期是以1℃/2h的升温速率，将干球温度由升至38℃，湿球温度调整至35℃，稳定温度干、湿球温度，烘烤18h；接着进入变黄后期，以1℃/2h的升温速率，将干球温度升至39℃，湿球温度调整至36℃，稳定干、湿球温度，烘烤14h，烤到底台烟叶完全变黄，主脉变软；定色期包括定色初期、定色中期、定色后期，定色初期是以1℃/2h的升温速率，将干球温度升至42℃，湿球温度调整至36℃，稳定干、湿球温度，烘烤14h，烤到支脉全变白，叶片1/3左右干燥；接着进入定色中期，以1℃/h的升温速率，将干球温度升至47℃，湿球温度调整至37℃，稳定干、湿球温度，烘烤20h，烤到全烤房烟叶的主脉全变白，叶片2/3以上干燥，具闻香感；接着进入定色后期，以1℃/1h的升温速率，将干球温度升至55℃，湿球温度调整至38℃，稳定干、湿球温度，烘烤10~14h，烤到全烤房烟叶叶片全干，高温层主脉干1/2；干筋期以1℃/h的升温速率，将干球温度升至66℃，湿球温度调整至39℃，稳定干、湿球温度，烘烤28h，烤到全烤房烟叶的主脉干燥为止，最后随炉冷却后出炉。
上述处理作为实验组a，在此基础上设立实验组b。
实验组b：变黄期中期调整湿球温度升至36℃，烘烤时间调整为17h；变黄期后期，调整湿球温度升至37℃，烘烤时间调整为10h。
实验组a、b各进行5个处理。
表7krk26烤烟品种优化工艺烤后烤烟tsnas含量对比
实施例8常规烘烤工艺对krk26烟叶中tsnas含量的影响
在实施例7的基础上设立对照实验：实施例7的变黄期中期湿球温度调整为34℃，烘烤时间调整为14h；变黄期后期湿球温度调整升至35℃，烘烤时间调整为12h；其它工艺参数不变。
表8krk26常规工艺烤后烤烟tsnas含量对比
由表7可知，krk26在本发明的优化工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了16.90～19.03%；由表8可知，krk26常规工艺下烤烟tsnas含量在接种菌种情况下降低了20.69～22.78%，故接种菌种能够显著降低烤烟tsnas含量，而本发明的优化工艺比常规工艺效果更显著。
实施例9本发明烘烤工艺对krk26烟叶菌种活性的影响
根据实施例7、8，在烘烤变黄初期结束进入变黄后期时测定此时烟叶单位叶片的菌种活菌数以及no2-含量。
表9单位面积烟叶有效活菌数和no2-含量对比
由表9可知，本方法工艺和常规工艺相比，其单位面积有效活菌数明显要高，其清除亚硝胺的前体物质no2-的能力更强，故证实了本方法工艺能够提高菌种的成活率。