专利名称：一种延缓慢性肾衰的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蒽醌化合物，具体地说是含大黄素的治疗糖尿病肾病的药。
糖尿病是因胰岛素分泌绝对或相对缺乏而导致的一种代谢性疾病。作为具有重要生物学活性的激素，胰岛素能够调节机体血糖水平，促进体内蛋白质和脂肪酸的合成。糖尿病患者由于缺乏胰岛素，在患者体内出现一系列代谢紊乱的同时，重要的生命器官，如心脏、肾脏、外周神精组织，及视网膜等可出现严重的结构与功能的损伤，其中糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，而糖尿病肾病又是慢性肾功能不全终末期肾衰(即称尿毒症)的主要原因之一。
除胰岛素治疗外，糖尿病，尤其是糖尿病肾病迄今仍缺乏行之有效的治疗药物。
本发明的目的是提供一种对糖尿病肾病的治疗有显著疗效，进而能延缓慢性肾衰的药物。
本发明的技术方案如下一种治疗糖尿病肾病的药，它含有大黄素 是制成含大黄素的口服胶囊或含大黄素的口服水溶液。给药的剂量为100～200mg/日大黄素为宜。
一种延缓慢性肾衰的药，它含有大黄素，它是制成含大黄素的口服胶囊或含大黄素的口服水溶液，给药的剂量为100～200mg/日大黄素为宜。
本发明延缓慢性肾衰的药也可以制成复方，即含有大黄素和巯甲丙脯酸。它也可以制成口服胶囊和口服水溶液。给的剂量为100～200mg/日大黄素和50～150mg/日巯甲丙脯酸。
大黄系蓼科植物，为我国重要的药材之一。主产于我国青海、甘肃、宁夏、内蒙一带。大黄素是大黄所含蒽醌衍生物中的一种成份。掌叶大黄中，含蒽醌衍生物总量为3.5％，其中大黄素的含量为1.27％。已有的研究证实，大黄素具有一定的抗菌、消炎、抗肿瘤等作用。实验证明，雌性SD大鼠(体重200±30g)服用10mg/kg大黄素，给药后30min血中即可测出50ng/mL的大黄素，4小时达到血药浓度高峰，达350～50Ong/mL,12小时降至50ng/mL以下。大黄素的毒性极小，实验表明单项给药3.0g/kg仍未观察到动物的死亡。我们的研究发现，大黄素不仅能够治疗糖尿病肾病，而且可以延缓慢性肾衰。
口服大黄素能控制糖尿病的大鼠甘油三脂和胆固醇的升高，用离体肾灌注技术，糖尿病大鼠经大黄素治疗后，其肾组织代谢水平明显得到控制，表现为氧耗量和菊粉清除率都有降低。大黄素治疗组的大鼠肾脏重量及肾组织中蛋白质、DNA、RNA含量明显小于对照组。
糖尿病肾病大鼠肾脏血流动力学研究表明，服用大黄素能使菊粉清除率和肾血流量减少，滤过分数也呈减少趋势。
糖尿病肾病大鼠的组织形态学分析表明，服用大黄素能使肾小球体积和系膜区面积明显减小。并且能明显抑制系膜细胞产生纤维连接蛋白(FN)，能使系膜细胞小丘减小，减少。
总之，(1)大黄素能够防治糖尿病肾病大鼠肾脏的肥大，纠正其血流动力学异常；(2)大黄素能够减轻糖尿病肾病大鼠肾脏的损伤，保护肾功能；(3)大黄素能够纠正糖尿病时血脂代谢异常；(4)大黄素能够减少糖尿病时肾脏组织中细胞外基质的生长，减缓肾小球的硬化。
进一步研究表明，大黄素对大鼠慢性肾衰有延缓作用。口服大黄素能减小肾脏指数；能降低肾组织中RNA、DNA及蛋白质的含量；能降低血清肌酐和尿素氮；能降低血脂水平；能降低尿蛋白水平；能降低氧耗量和菊粉再生量；能抑制系膜细胞的生长；能抑制肾小管上皮细胞的增殖。因此大黄素能延缓慢性肾衰。
图1．大黄素对糖尿病肾病大鼠蛋白质排泄量的影响；图2a．不同时间两组平均肾小球体积的比较；图2b．不同时间两组平均肾小球系膜区面积的比较；图3．大黄素作用后系膜细胞培养上清液中FN水平的改变；图4．大黄素作用后系膜细胞相连FN水平的改变；图5．大黄素对系膜细胞小丘形成数目的影响；图6．灌服大黄素后不同时间血对系膜细胞增殖的抑制作用；图7．不同剂量大黄素对系膜细胞增殖的影响；图8a．不同浓度大黄素对鼠系膜细胞增殖的影响；图8b．不同浓度大黄素对人系膜细胞增殖的影响；图9．大鼠服不剂量大黄素的血清对肾小管上皮细胞增殖的影响，图10．大鼠1次或慢性服大黄素的血清对肾小管上皮细胞增殖的影响；图11．大黄素纯品对肾小管上皮细胞增殖的直接影响；以下通过实施例进一步说明本发明。实施例1．大黄素治疗糖尿病肾病的作用1．大黄素治疗大鼠实验性糖尿病肾病的作用1.1．糖尿病肾病大鼠动物模型的建立采用单侧肾切除合并链脲菌素注射的方法。建立此模型方法简述如下雌性SD大鼠，体重180±20g，腹腔麻醉及无菌条件下，行左肾切除术。手术后7天，轻度乙醚麻醉下，尾静脉注射链脲菌素(35mg/kg)。72小时测定血糖浓度，血糖水平＞250mg/100mL认为模型成立。列入实验观察对象。
1.2．实验设计及分组实验大鼠分为4组单侧肾切除大鼠对照组(n=6)；糖尿病对照组(n=18)；糖尿病大黄素治疗组(n=10)；和正常对照组(n=9)。
其中，大黄素治疗组经口灌服大黄素溶液1mL/200g(体重)(浓度2mg/mL)剂量为10mg/kg/日，连续用药120天后宰杀动物，检测治疗效果，余下各组动物给等量蒸馏水为对照。
1.3．结果1.3.1血糖体重等一般状态的变化各组大鼠实验前体重无显著差别，单侧肾切除后体重有轻度减轻，但减少幅度＜10％。链脲菌素注射后，大鼠的体重与对照组相比明显减少。大黄素治疗后，两组体重差别不明显。
实验结果表明，实验前各组血糖无明显差异。链脲菌素注射后，血糖水平显著升高与正常组差异明显，说明糖尿病动物模型成立。(17.63±1.17mmol/L Vs 6.32±0.34mmol/L P＜0.01)。经大黄素治疗后，两组血糖相比，无明显差异(22.1±3.1Vs 20.4±2.6mmol/L P＜0.05)，均显著高于正常对照组，说明大黄素无明显降低血糖的作用。
1.3.2血脂代谢的影响实验前各组血脂无显著的差异，大鼠经链脲菌素注射出现糖尿病时，血脂代谢出现明显的异常。表现为甘油三酯和胆固醇的升高。经大黄素治疗后，升高的甘油三酯和胆固醇得到明显地控制。表现为降低甘油三酯、胆固醇水平，升高高密度脂蛋白(HDL)，降低极低密度和低密度脂蛋白水平(VLDL和LDL)。见表1．1.3.3大黄素对糖尿病大鼠肾组织代谢水平的影响应用离体肾灌经技术可以研究肾组织的代谢水平，结果表明，与正常组大鼠肾脏相比，糖尿病大鼠肾脏的菊粉清除率和尿量明显增加，同时氧耗量也明显增加。糖尿在鼠经大黄素治疗后，其肾组织代谢水平明显得到控制。表现为氧耗量小于非治疗组大鼠肾脏的氧耗量，同时，菊粉清降率也低于糖尿病组。如表2所示表1．大黄素对糖尿病大鼠血脂和脂蛋白代谢的影响(x±s)类别 A组(n=9) B组(n=10)C组(n=10)甘油三脂(mmol/L) 0.67±0.131.87±0.52*1.53±0.40*△胆固醇(mmol/L) 3.49±0.715.14±1.09*3.91±1.12*△HDL-CH(mmol/L) 1.49±0.291.47±0.27 1.86±0.42*△LDL-CH(mmol/L) 1.71±0.512.70±0.69*1.38±0.47△VLDL-CH(mmol/L)0.32±0.060.99±0.13*0.82±0.19*注与A组比较，*P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05(下同)A组正常对照组 B组糖尿病组 C组大黄素治疗组表2．大黄素对糖尿病肾病大鼠整体肾功能和离体肾氧耗量的影响(x±s)类别 A组(n=5) B组(n=6) C组(n=6)平均动脉压(kPa) 16.26±1.2221.06±3.17*20.23±3.67*菊粉清除率(mL/min)1.04±0.27 1.42±0.30**1.37±0.21(mL/min×g-1) 0.48±0.11 0.58±0.18 0.67±0.13△尿量(mL/min) 0.026±0.014 0.082±0.031*0.058±0.029*氧耗量 (n=4) (n=6)(n=4)基础氧耗量(μmol/min)2.48±0.37 4.37±0.97*3.10±0.52*△总氧耗量(μmol/min) 3.03±0.62 4.86±1.06*3.79±0.89*△注与A组比较，*P＜0.01,**P＜0.05；与B组比较△P＜0.051.3.4大黄素对肾脏肥大的作用肾脏肥大是糖尿病肾病最显著的组织形态学变化之一。本组实验中，糖尿病大鼠肾重量明显增加，同时肾组织中蛋白质、RNA、DNA含量也明显增加。但是，蛋白质与RNA升高的幅度明显大于DNA升高的幅度。大黄素治疗组大鼠肾脏重量，及组织中蛋白质、DNA、RNA含量则明显少于对照组。见表3．表3．大黄素对糖尿病大鼠肾重量和组织中蛋白质、RNA及DNA的影响(x±s)类别A组(n=9) B组(n=10)C组(n=10)肾重 (g) 2.23±0.172.94±0.27*2.54±0.25*肾重/体重 (％) 6.85±0.6213.5±0.83*10.4±0.47*△肾组织中 (mg/g肾)蛋白质 183.7±22.0 251.0±34.9**207.2±34.5*△RNA 4.26±0.295.82±0.41*5.36±0.67*DNA 3.04±0.423.51±0.29*3.40±0.23*RNA/DNA 1.41±0.631.76±0.44*1.57±0.53*注与A组比较，*P＜0.01,**P＜0.05；与B组比较△P＜0.051.3.5大黄素对尿蛋白质排泄量的影响
与正常组大鼠相比，糖尿病组大鼠尿24小时蛋白质排泄量明显增多。经大黄素治疗后，尿24小时蛋白质排泄量显著减少。见图1．2．大黄素对糖尿病大鼠肾脏血流动力学异常的作用。
2.1．糖尿病大鼠动物模型雌性SD大鼠，体重170～190g。尾静脉注射链脲菌素(40mg/kg)。72小时后测定血糖水平，血糖浓度在15.3～27.7mmol/L之间的列入实验观察对象。
2.2实验设计与分组大鼠分为3组，正常对照组(n=6)，糖尿病大鼠组(n=11)，和糖尿病大黄素治疗组(n=9)。其中大黄素治疗组在注射链脲菌素18小时给大黄素10mg/kg，随后按10mg/kg/日经口灌服大黄素，连续用药4周。
2.3．结果2.3.1血压的变化实验前三组大鼠血压无明显差别，在11.2～14.0kPa范围内。大鼠在注射链脲菌素后，血压明显升高(15.9±0.5 Vs 13.8±0.8KPa P＜0.05)。经大黄素治疗后，大鼠血压无明显地变化。
2.3.2肾脏血流动力学变化实验结果如表所示，与正常大鼠相比，糖尿病组大鼠的菊粉清除率和肾脏血流量均明显升高，同时肾血管阻力明显减少，滤过分数(FF)也明显升高。经大黄素治疗后，菊粉清除率和肾血流量明显减少，同时FF也呈减少的趋势。见表4．表4．大黄素对糖尿病大鼠肾血流动力学的影响正常对照组糖尿病组 大黄素治疗组n=6 n=11 n=9平均动脉压 KPa 13.8±0.8 15.9±0.5 16.0±0.9菊粉清除率 mL/min 1.67±0.223.30±0.942.15±0.44肾血流量ml/mL 6.01±0.238.63±0.487.14±0.31肾血管阻力mmHg/min/mL 7.31±0.289.06±0.418.11±0.37滤过分数 0.28±0.030.38±0.070.33±0.04尿量uL/mL 7.3±2.1 34.7±16.328.6±14.23．大黄素治疗糖尿病大鼠作用的肾组织形态学分析3.1动物模型同前3.2实验设计与分组大鼠分为三组，正常对照组(n=12)，糖尿病大鼠组(n=12)和大黄素治疗组(n=12)，用药方法同前，在大黄素治疗的第3、7及14天宰杀动物，取肾组织常规病理检查。应用镜下图像分析技术，定量分析各组肾组织形态学变化。
3.3结果大鼠注射链脲菌素后，肾小球体积较正常对照组明显增大。大黄素治疗组在糖尿病发生后3天，7天及14天时，肾小球体积和膜区面积均较糖尿病组明显减小。见图2。
4．大黄素对系膜细胞纤维连接蛋白产生的影响4.1系膜细胞培养正常人肾组织经机械网筛法分离出肾小球，0.1％胶原酶消化处理后，置含20％小牛血清的DMEM培养液中培养，以3～5代细胞进行下列实验。
4.2纤维连接蛋白(FN)的测定以双抗体夹心ELISA法检测培养上清液及与细胞相连的FN水平。
4.3结果4.3.1大黄素对系模细胞产生FN的影响
大黄素能够明显抑制系膜细胞产生FN，当其浓度为20mg/L时，几乎完全抑制由转化生长因子β而致的FN合成。见图3、图4．4.3.2大黄素对培养系膜细胞小丘形成的影响长期培养的系膜细胞可叠层生长而形成小丘，是系膜细胞增殖及细胞外基质积的结果。无大黄素时，系膜细胞形成小丘大而多，经大黄素处理后，小丘数小而少。20mg/L的大黄素几乎完全抑制系膜细胞小丘的形成。
小结(1)．大黄素能够防治糖尿病大鼠肾脏的肥大，纠正其血流动力学异常；(2)．大黄素能够减轻糖尿病肾病大鼠肾脏的损伤，保护肾功能；(3)大黄素能够纠正糖尿病时血脂代谢异常；(4)大黄素能够减少糖尿病时肾脏组织中细胞外基质的生长，减缓肾小球硬化的程度。
实施例2．大黄素延缓慢性肾衰的作用1．大黄素延缓慢性肾衰的作用．1.1．慢性肾衰动物模型雄性SD大鼠，体重150～200g，腹腔麻醉和无菌条件下，先期结扎左肾动脉分枝上、下各1枝，随后在结扎血管的第7天行右肾切除，并开始记录手术后时间。
1.2，实验设计与分组术后第4周开始分组，正常对照组(n=10)；5/6肾切除大黄素治疗组(简称大黄素组，n=16)；和5/6肾切除对照组(简称实验对照组，n=17)。
大黄素治疗组每日给大黄素10mg/kg，经口灌服，其余两组给等量的蒸溜水。
1.3．结果1.3.1．大黄素对体重、肾重等的影响实验前，各组大鼠体重无明显差异，术后体重有一过性降低。随实验进展，各组大鼠体重均增加，且无明显差异。术后12周时大黄素组肾重量呈减少趋势，肾重/体重明显少于实验对照组。同时肾组织中RNA、DNA及蛋白质含量也明显减少。如表5所示表5 体重、肾重和肾组织中蛋白质，RNA及DNA含量的变化正常对照组大黄素组 实验对照组体重 g 372±34 350±31 369±38肾重 g 2.01±0.312.75±0.633.03±0.36肾重/体重 ％ 5.31±0.666.50±1.037.61±0.91肾组织中 mg/肾蛋白质 134.3±9.5156.2±17.1 183.8±19.5RNA 4.13±0.174.25±0.214.87±0.45DNA 3.51±0.233.38±0.304.18±0.43RNA/DNA 1.25±0.371.15±0.421.26±0.26摄食量g/24h 28.5±8.2 26.7±9.5 25.3±8.31.3.2大黄素对肾功能的影响各组大鼠实验前，血肌酐和尿素氮水平无差异，手术后血肌酐和尿素氮水平急剧上升。2～4周回降近正常水平，尔后各组血清肌酐和尿素氮再进行性升高。大黄素治疗组血肌酐和尿素氮水平上升速度明显小于实验对照组，第12周时两组和尿素氮水平相差明显。见表6．1.3.3．大黄素对血脂和脂蛋白代谢的影响实验前及开始用药治疗前，实验对照组和大黄素治疗组的血脂及脂蛋白水平无明显差异，经12周大黄素治疗，血脂水平明显低于实验对照组。见表6．表6 大黄素对肌酐、BUN、血脂、脂蛋白及总蛋白水平的影响正常对照组大黄素组 实验对照组肌酐 μmol/L68.4±21.3190.0±69.5 272.6±56.8BUN mmol/L17.4±2.0 21.9±3.8 31.7±8.9甘油三脂 mmol/L0.67±0.131.51±0.422.06±0.51胆固醇mmol/L2.95±6.013.26±0.704.26±0.89HDL mmol/L1.27±0.251.44±0.311.10±0.18LDL mmol/L1.44±0.431.18±0.352.06±0.40VLDL mmol/L0.27±0.050.61±0.320.84±0.35总蛋白g/L 75.9±3.2 72.8±3.4 71.2±8.1白蛋白g/L 40.1±5.4 37.4±3.8 36.9±4.7白蛋白/球蛋白 1.12±0.301.07±0.411.03±0.38Na+ mmol/L141.7±1.6142.2±1.8143.7±1.7K+mmol/L6.2±0.8 6.5±0.6 6.4±0.81.3.4．大黄素对尿蛋白的影响实验前，各组大鼠24小时尿蛋白水平无差异。手术后尿蛋白排泄量明显增加(28.6±7.3 Vs 7.1±4.8mg/24h P＜0.01)。随后尿蛋白排泄进行性增多。经大黄素治疗后，尿蛋白水平明显低于实验对照组第，12周时两组相差明显。(35.6±13.7 Vs 120.8±38.2mg/24h P＜0.01)。
1.3.5．各组死亡率的比较见表7．手术后4周时死亡数较多，随着实验的进行，实验对照组略多于大黄素治疗组。第12周，结束实验时，三组大鼠的存活率分别为90％、75％、和61％。
表7．死亡只数与存活率正常对照组 大黄素治疗组 实验对照组术后第4周2 37 18 1 11211 116 1最终存活只数912 11存活率(％) 90 75 612．大黄素对5/6肾切除后残余肾功能保护作用2.1．动物模型慢性肾衰动物模型的建立采用5/6肾切除的方法，与前述相同。
2.2．实验设计与前述相同。
2.3．结果．2.3.1大黄素对正常大鼠肾功能的影响研究表明，正常大鼠经大黄素治疗后，其肾功能，如氧耗量，钠离子转运量，菊粉清除率及葡萄糖再生量无明显差异。见表8．
表8．大黄素对正常大鼠肾功能的影响正常对照组(n=24) 正常大黄素(n=4)肾重量 g 1.62+0.14 1.59+0.10氧耗量 μmol/min/g 4.49+0.72 4.66+0.59Na+转运量μmol/min/g 38.87±4.3836.21±5.67菊粉清除率 μl/min/g 282.5±48.5274.8±27.8流量 ml/min/g 21.3±2.8 22.1±1.7葡萄糖再生量 μmol/min/g 10.4±3.1 8.2±1.6尿量 51±7 55±92.3.2大黄素对残余肾功能的影响大黄素治疗后，残余肾氧耗量和葡萄糖再生量明显低于实验对照组。见表9．表9．大黄素对残余肾功能的影响实验对照组(n=6) 大黄素治疗组(n=6)肾重 g1.26±0.111.23±0.28氧耗量 μmol/min/g 5.75±0.724.42±0.64Na+转运量 μmol/min/g 10.5±2.1 9.3±1.5菊粉清除率 μL/min/g 127.4±23.6 122.2±13.7流量μL/min/g 14.7±1.6 14.1±2.3葡萄糖再生量mol/min/g 10.6±2.9 6.0±2.5尿量μL/min 20±3 17±23．大黄素抑制系膜细胞和肾小管上皮细胞生长与功能的作用3.1．大黄素抑制系膜细胞的生长正常SD大鼠灌服20mg大黄素后的血清，对系膜细胞生长即可见抑制作用，3H-TdR掺入率为77％，6小时抑制作用最强，3H-TdR掺入率为60％,9小时后抑制作用逐渐减弱。见图6．以不同剂量的大黄素灌服大鼠，统一在灌药后6小时取血，可见随用药剂量的增加，抑制系膜生长的作用也增加。见图7。
3.2．大黄素直接抑制系膜细胞生长的作用研究发现，大黄素直接加入细胞培养体系中，其系膜细胞生长明显被抑制，见图8。25μg/mL的大黄素已使系膜细胞3H-TdR掺入率降为58％。随着大黄素浓度的增加，100μg/mL时，系膜细胞的掺入率仅为17％。
3.3．大黄素对肾小管上皮细胞增殖的作用研究表明，大黄素经口灌服后的血清能够明显地抑制肾小管上皮细胞的生长。(见图9)．而且长期灌服大黄素的血清，抑制肾小管上皮细胞生长的作用，明显大于单次灌服大黄素的血清。见图10。
将大黄素直接加入培养的肾小管上皮细胞中，也能够明显抑制上皮细胞3H-TdR的掺入。(见图11)。
实施例3．临床研究1．大黄素延缓慢性肾衰患者肾功能进行性减退的作用。
1.1．病例选择49例慢性肾衰患者，男性38例，女性11例，平均年龄40.7岁。除去造成肾功能一过性降低的因素，如电解质紊乱，酸碱失衡，感染及严重高血压后，本组患者平均基础血肌酐水平344±114μmol/L。
1.2．病人分组病人随机分为4组大黄素治疗组(n=12)，巯甲丙脯酸治疗组(n=10)，联合用药组(n=14)和对照组(n=13)。其中，大黄素治疗组每日给大黄素100～200mg/日；巯甲丙脯酸治疗组给巯甲丙脯酸75mg/日；联合用药组每日同时给大黄素100～200mg/kg/和巯甲丙脯酸75mg/日。对照组仅给安慰剂作为对照。
1.3．结果在6～20日的随访期间，对照组有5例(26.3％)发展至终末期肾衰而行透析治疗，其余3组无一例发生终末期肾衰。
经回归分析表明，肾功能衰退速度以对照组最大，巯甲丙脯酸次之，大黄素和联合用药组较好。见表10。
表10．大黄素延缓慢性肾衰患者肾功能进行性减退的作用对照组 大黄素组 巯甲丙酸组 联合用药组例数19119 10随访时间(日)11.8±3.3 11.4±4.89.3±2.8 11.7±4.7肾功能衰退指数 -100.5±46.9 -6.1±2.1-31.9±3.1 16.7±4.3(×10-4)10年内发生终未 94.7％ 36.4％ 66.4％ 30％肾衰的预测
权利要求
1．一种延缓慢性肾衰的药物，其特征是含有大黄素和巯甲丙脯酸。
2．根据权利要求1所述的药物，其特征是大黄素与巯甲丙脯酸的质量比是1∶0.25-0.75。
全文摘要
一种延缓慢性肾衰的药物,它含有大黄素和巯甲丙脯酸,它能有效地延缓慢性肾衰的过程,效果比单用大黄素明显。
文档编号A61K31/195GK1324612SQ0013655
公开日2001年12月5日 申请日期2000年12月19日 优先权日2000年12月19日
发明者黎磊石 申请人:中国人民解放军肾脏病研究所