专利名称：结膜炎的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及从壁虱分离出的各种蛋白质对治疗结膜炎的有效性的发现。这些蛋白质最适宜局部用于受感染的区域，并且对改善此病症的症状是有效的。
结膜炎，或“红眼病”是眼由细菌、病毒或其它刺激物引起的结膜炎症的名称。结膜炎是发达国家最常见的眼病，其严重程度可从流泪的中度发炎到引起组织损伤的严重发炎。结膜炎最常见的原因是病毒感染，主要是腺病毒引起的感染。其它类型的结膜炎包括主要由流感嗜血杆菌和肺炎链球菌引起的细菌和真菌疾病。
不传染的、或过敏的结膜炎的特征是眼发红发痒，还可包括在眼中产生粘液。其它的临床症状为流泪(清泪)、眼睑结痂和畏光。这种病症通常是季节性的，在患过敏性鼻炎的患者中常见此病。
通常，过敏性结膜炎采用含局部减轻充血的、有或没有抗组胺剂的眼科制剂治疗。这种病症可对潜在过敏源的治疗作出反应，当过敏源消失后这种病症可以消失。敏感个体出现过敏性结膜炎的预防可采用色甘酸钠(Sodium chromoglycate)。这个领域内当前的发展同样支持用稳定肥大细胞药物治疗眼过敏。
季节过敏性结膜炎包括1-型超过敏(IgE)，而眼过敏的其它主要形式如常年过敏性结膜炎、春季性的和特异反应性的角膜结膜炎以及巨型乳头状结膜炎具有更复杂的免疫学原理和慢性发炎成分。为了控制由这些类型的结膜炎引起的眼科炎症，为了避免很多治疗程序带来的类固醇感染副反应，需要周到地对患者进行管理。过敏性结膜炎的广的发病率意味着这里需要不断发现新的能有效改善此病症状的药物。
抗原激活从眼内的肥大细胞的眼过敏媒剂的释放。组胺是这些媒剂中的一种，它存在于肥大细胞的分泌粒和嗜硷细胞之中并经组氨酸脱羧化形成。
组胺包含在季节眼过敏的红痒之中。曾经发现，与眼中组胺受体结合的抗组胺化合物有利于治疗眼过敏的病症和症状。这些药物的多数是在结构上与组胺有关的并与其受体结合的化合物，从而阻碍组胺和其受体的相互作用。但是现有的药物常常具有不良的副作用(例如困倦)而且不是总有效。
通常的H1受体拮抗物是广泛用作治疗过敏反应的抗组胺剂，这些过敏反应包括过敏性鼻炎(枯草热)、荨麻疹、虫咬和药物超过敏。H1受体拮抗物是针对与这些病症相关的发红和发炎。但是目前所用的H1受体拮抗物有多种不良反应。如果用于纯抗组胺作用，对中枢神经系统(CNS)的所有作用都是不希望的。如果用于它们的镇静或抗催吐作用，某些CNS作用如使头昏、耳鸣和疲劳都是不希望的。过多的剂量会使儿童受刺激并可能引起惊厥。外周抗蕈毒作用在任何时候都是不良的。其中最普遍的是口腔干燥，但视力模糊、便秘和尿滞留也可发生。也看到不良作用与药物的药剂学作用无关。因此，虽然过敏性皮炎可局部涂敷这些药物，但肠胃功能失调相当普遍。
H2受体拮抗物同样用作抗-组胺剂。这些药剂的目的是针对痒，后者与神经系统的某些方面的活化结果的病症有联系的。
除了上面指出的问题之外，如果采用醇或药物，一些组胺拮抗物还会造成麻烦。例如抗组胺Seldane与抗生素和抗真菌素联合使用可能引起危及生命的副作用。
因此，可以看出，用于控制组胺作用的药物不总是有效的。它们限制效能的原因可涉及这些药物只对组胺受体的亚类的特异性有关，特别是在某一类的病状要求干扰大类的受体的情况下尤其如此。事实上，现已查明，过敏性结膜炎与很多不同的化学引诱剂和血管活性物质有牵连，它们不仅由肥大细胞同样亦由嗜曙红细胞和其它细胞释出，使眼过敏性失调的患者染上眼过敏症。
因此，非常需要能有效缓和这种病状的药剂，但该药剂不产生有损于如治疗化合物的诱发性的副作用。针对H1和H2两种受体媒介作用的分子会对此特别有效。
先前已在供血系统的外寄生物，例如壁虱中已验明能与组胺结合的分子。例如，已发现锥蝽属虫Rhodnius prolixus的载带唾液一氧化氮的血红蛋白质(nitrophorin)能与组胺结合(Ribeiro andWalker，1994)。从壁虱分离一族与活化血管的胺相结合的蛋白质在同时待审的国际专利申请NO.PCT/GB97/01372中已有叙述，该专利亦属于本发明的申请人，其内容全部引此。这类蛋白质与组胺结合，并互相紧密相关。其中一些分子同样与血清结合。这类分子与受体家族H1、H2或H3有明显的区别，并且似乎以不同的方式与组胺结合。
目前已经意外发现，从壁虱分离出的与血管活化胺相结合的蛋白质和相关蛋白质对治疗结膜炎有显著的效果。
发明简述本发明将histacalin蛋白质用于制造治疗或预防结膜炎的药物。
本发明提出一种治疗或预防结膜炎的方法，该法包括对受治疗者施用有效量的histacalin蛋白质。
术语“histacalin蛋白质”在本申请中系指(a)任一种与血管活性胺结合的蛋白质，该蛋白质专门与血管活性胺结合，其离解常数小于10-7M，而且属于如在共同待审的国际专利申请书NO.PCT/GB97/01372中所公开的MS-HBP1、ES-HBP1和FS-HBP-2等蛋白质家族，其中一种蛋白质被认为属于此类蛋白质家族，如果该蛋白质的基本的、成熟的单体序列不超过260氨基酸，而且在该类蛋白质完整的序列中至少30个氨基酸在该蛋白质和MS-HBP1，FS-HBP1和FS-HBP-2等蛋白质排列中以同样残基保留下来，该排列宜用GCG′s堆积指令得到(Wisconsin程序包的操作指南，1994；成间隙补偿＝3；间隙扩展补偿＝1，记录基质Blosum62.cmp，使用端重选择进行堆积)；(b)来自吸血节肢动物的蛋白质，该蛋白质专门与组胺结合，其离解常数小于10-7M，并包含序列基元D/EAWK/R(优选DAWK，更优选QDAWK)和Y/CE/DL/I/FW(优选Y/C ELW)；(c)上面(a)或(b)界定的蛋白质的一种天然生物变体，如等位基因变体或地域变体；(d)上面(a)、(b)或(c)界定的蛋白质的功能等效物质，该物质包含从野生型蛋白质序列单个或多个氨基酸的置换、添加、插入和/或消去和/或不影响与相应血管活性胺结合的生物功能的化学改性氨基酸的置换。
(e)上面(a)、(b)、(c)或(d)界定的蛋白质的活性断片，其中“活性断片”系指保留与相应血管活性胺结合的生物功能的截短的蛋白质；以及
(f)一种融合蛋白质，包括上面(a)、(b)、(c)、(d)或(e)界定的融合到肽或其它蛋白质的蛋白质如可能是，例如，生物活性的、放射性的、酶的或荧光的标记物或者抗体。
利用GCG’s堆积指令(Wisconsin程序包的操作指南，1994；成间隙补偿＝3；间隙扩展补偿＝1，记录基质Blosum62.cmp，利用端重选择进行堆积)得到的MS-HBP1、FS-HPB1和FS-HBP-2蛋白质的排列列于表1。
表1FS-HBP1(上排)、FS-HBP2(中排)和MS-HBP1(下排)的排列比较。同样的残基在三排的下面以“＝”表示。该顺序按上述排列。
优选地，如果蛋白质含有多于40，更优选多于50，再优选多于60残基的，最优选70或更多残基的蛋白质，则列入上述蛋白质同一家族，它们等同于上面的(a)所界定的，并按表1所列的蛋白质排列。
histacalin蛋白质宜从供血外寄生物衍生，诸如水蛭、蚊子或壁虱。最优选的histacalin蛋白质从壁虱衍生，特别是从硬壁虱物种衍生，诸如R.appendiculatus、I.ricinus和D.reticulatus。
上述的histacalin蛋白质可用于治疗任一种结膜炎病症。它们优选用于治疗非传染性结膜炎，更优选治疗过敏性结膜炎。具体而言，过敏性结膜炎系指包括季节性和常年性结膜炎，以及春季角膜结膜炎、巨型乳头状结膜炎以及特异反应性角膜结膜炎。
上面界定的，特别是(e)所界定的histacalin蛋白质可用作诊断工具诊断疑患有非传染性结膜炎患者的病症状态。
任一种哺乳动物皆适宜于用本发明的方法治疗，尤其是在患者是人的情况下。
优选地，药用可接受的载体也用于本发明的药物的制造。这种药用可接受的载体同样优选用于本发明的方法。
适宜的药用可接受的载体包括本身不诱发产生有害于单体接受该组合物的抗体的载体。典型的适宜载体是大的、慢代谢的大分子如蛋白质类、多糖类、聚乳酸类、聚乙二醇酸类、聚含氨基酸类、氨基酸聚合物类，类脂聚集体类(诸如油滴或脂质体)和非活性病毒颗粒。这类载体在本专业领域是熟知的。
治疗组合物中药用可接受的载体亦可包含液体如水、盐水、甘油醇如乙醇。还可存在辅助物质如浸润剂或乳化剂和pH缓冲剂。组合物可制成可注射的，是液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介中的固体形式。也可配制成口服制剂以使活性剂有控释放。
在制造本发明的药物中，可选择性使用一种或多种其它常规抗组胺剂或抗-镇静剂。这类常规抗组胺剂或抗-镇静剂同样可用于本发明的方法中。加入这些药剂可对结膜炎产生协同作用。
有时，常规抗组胺剂会产生不良的副作用，例如困倦。对于这种意外情况，在用本方法制造药物时还可添加一种或多种抗-镇静剂。合适的抗-镇静剂对本专业技术人员是熟知的。
本发明的另一方面是提供一种药物组合物，它包括上面界定的histacalin蛋白质、抗组胺剂和用可接受的载体。具体的适宜抗组胺剂包括左旋卡巴斯汀、酮替芬和洛度沙胺。
在患季节性结膜炎情况下，治疗是应时的。在此情况下，病人可施用histacalin蛋白质或含该蛋白质的组合物，还可有与上述有关的成分，仅在结膜炎症状出现时或在看来要出现时如大气中有高花粉含量时施用。
患常年结膜炎的患者可能需要连续施用histacalin蛋白质以防止病状的发生。为能保证施用histacalin的有效剂量，患者可能需要每天一次、两次、三次或甚至四次接受药物。
histacalin蛋白质可以眼滴剂、软膏、气溶胶喷剂局部施用到感染区或以口服如以胶囊、药筒或通过注射系统施用。histacalin蛋白质宜局部性施用。局部给药，应将它以适宜的药用载体稀释，诸如用不或盐水稀释。优选以pH7.2的生理盐水稀释。
具体情况下的有效剂量可通过例行试验确定，并在专业人员判断之内。例如，为了配制成一系列剂量值，可采用细胞培养分析和动物试验。这类化合物的剂量宜处于在治疗学上对50％群体有效的剂量范围内，并且显示很小的毒性或无毒性。对于本发明的目的，对个人施用的有效剂量在0.01μg/kg-50μg/kg之间，更典型的是在0.05μg/kg-10μg/kg之间。对于眼的局部施用，histacalin蛋白质宜处于溶液之中，其量为0.1％-20％，优选1％-10％之间。适宜的单位剂量可在每只眼0.1μg-1mg的范围内，优选1μg-200μg，更优选10μg-100μg之间。曾经发现，每只眼的单位剂量为90μg是有效的。
本发明的各方面和实施方案用实施例参照附图加以阐述，其中
图1表示用1％ EV131(HBP)或盐水治疗兔眼的结果，表示对原始红度分数的平均变化；图2表示用6％ EV131(HBP)或盐水治疗兔眼的结果，表示对原始红度分数的平均变化；图3表示用10％ EV131(HBP)或盐水治疗兔眼的结果，表示对原始红度分数的平均变化；图4表示用6％ EV131(HBP)或盐水治疗兔眼的结果，表示对原始结膜水肿分数的平均变化；图5表示用10％ EV131(HBP)或盐水治疗兔眼的结果，表示对原始结膜水肿分数的平均变化；图6表示施用6％ EV131或盐水一周，然后用48/80攻击，8小时之后的结果，表示对原始红度分数的平均变化。
可以理解，在不超出本发明的范围情况下可对细节修改。
48/80化合物是N-甲基-对-甲氧基苯乙基胺与甲醛的缩合产物，它能促进从肥大细胞释放过敏介质，包括组胺。由于它具有促炎作用，48/80化合物已用于动物中筛选新的抗-过敏化合物(Udelletal.，Am.J.Ophthalmol.(美国眼科学杂志)，91，(2)，226-230，1981)。
在本研究中，曾用48/80化合物测定PCT/GB97/01372所述的hitacalin蛋白质(本文援用其内部名称“EV131”，在图中用“HBP”)在预防过敏性结膜炎方面的效果。
EV131眼药溶液的浓度为1％和6％，是用原料液制备的，该原料液约含2mg EV131和50微升dH2O。用pH7.2的生理盐水作缓冲剂来稀释。
以家兔作模式，用盐水或1％、6％或10％ EV131进行治疗。每个家兔右眼局部滴40微升EV131溶液，左眼滴40微升盐水。
对家兔给出充血、结膜水肿、粘液分泌和眼睑肿胀的基线总检查。在试验中表现出异常(＞+1充血和角膜变化)一只的家兔被排除在试验之外。
5只家兔滴用1％ EV131，4只家兔滴用6％ EV131。滴入10分钟之后局部将25微升的7.5mg/ml的48/80化合物(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO，USA)溶液滴入已滴眼药的兔眼中。
在用48/80化合物攻击之后在3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、60分钟、8小时和24小时对全部家兔进行总检查。按结膜注射、结膜水肿、流泪、粘液分泌和眼睑肿胀对眼进行评价。
曾经发现，剂量为6％(97μg)EV131在充血、结膜水肿、粘液分泌和眼睑肿胀等方面测量给出最佳的炎症减少的稳定结果。
在三周的不应期后，重复此程序。这次4只家兔滴用6％ EV131，5只家兔滴用10％ EV131。
在6％ HBP组中的1只家兔双眼皆有粘液。在6％组中3只家兔(1只家兔在攻击后20、60和240分钟，2只家兔在攻击后60分钟时)只在用空白对照剂预先治疗的眼中才有粘液。在10％治疗组中，1只家兔仅在以EV131治疗的眼中有粘液(在攻击后60分钟和8小时)，3只家兔双眼皆有粘液(在攻击后60分钟和8小时)。数据列于图1-5。实施例2本研究涉及家兔眼滴入EV131后，在确定48/80诱发炎症之前的较长周期内的作用。
研究用了8只家兔，右眼用试验物质，左眼用盐水对比。每只家兔滴入EV131共7天每天一次40μl的6％溶液，每个总剂量相当于96.0μg EV131。40μl生理盐水(pH7.2)同时滴入左眼(对比)。在最后一次滴入试验物质和对比物质后8小时时，在双眼内滴入25μl 48/80物质(7.5mg/ml)。滴入48/80之后，在3、10、20、60分钟和8小时时观察眼并记录红度分数。计算出平均值并列入图6。
结果表明，在3分钟时，滴EV131眼的红度与对比眼相比平均减小65.0％，在5分钟时，减小33.3％，在10分钟时减小40.6％。在20分钟时，试验眼与对比眼相比眼红度平均增加5％。在60分钟和8小时时试验眼和对比眼的红度无差别。
这些结果表明，在最后一次滴入试验物质和对比物质之后8小时，似乎证明与对比盐水相比在滴入48/80物质之后EV131对减小眼红的程度上有保护作用。这种作用持续至少10分钟，但在20分钟时已不明显(即最后一次滴入EV131后8小时20分钟)。这就证明，抗48/80诱发的肥大细胞结膜的脱粒作用持续至少8小时。
权利要求
1.一种histacalin蛋白质(按本文定义)在制造用于治疗或预防结膜炎的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中该histacalin蛋白质是从供血外寄生物中衍生的。
3.权利要求2的应用，其中该histacalin蛋白质是从壁虱衍生的。
4.权利要求1的应用，其中该histacalin蛋白质是MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2或D.RET6蛋白质、其功能等同物质或其活性断片。
5.权利要求1-4之一的应用，其中可接受的药用赋形剂亦用于制造该药物中。
6.权利要求5的应用，其中一种或多种抗组胺剂或抗-镇静剂亦用于制造该药物中。
7.一种药物组合物，它含权利要求1-4中之一的histacalin蛋白质、抗组胺剂和可接受药用载体。
8.一种治疗或预防结膜炎的方法，包括给被试者施用有效治疗量的权利要求1-4中之一的histacalin蛋白质或权利要求5-7之一的药物组合物。
9.权利要求1-6之一的应用或权利要求8的方法，其中该结膜炎是非传染性结膜炎，优选是过敏性结膜炎如季节性或常年性过敏性结膜炎。
全文摘要
本发明涉及从壁虱分离出来的各种蛋白质用于治疗结膜炎的有效性的发现。这些蛋白质最适宜局部用于受影响的区,并能有效地改善此种病症的症状。
文档编号A61P29/00GK1382057SQ0081477
公开日2002年11月27日 申请日期2000年8月24日 优先权日1999年9月1日
发明者P·A·努塔尔, G·C·佩森 申请人:发展技术有限公司