专利名称：鉴定适于移植的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及适合移植入脊椎动物脑中的细胞的鉴定。具体地说，本发明涉及在移植入脑之后能修复神经损伤的多能神经细胞的鉴定。
背景技术：
人们越来越了解到，脊椎动物的脑损伤能通过细胞移植技术得到修复。一般，移植入受损脑中的细胞是神经干细胞，例如，能分化成具有神经细胞表型的细胞的多能神经上皮干细胞。
例如，Sinden等人，神经科学(neuroscience)(1997)81599-608,公开，可以将条件性永生化的海马神经上皮干细胞移植入局部缺血损伤的海马，以用于提高空间学习。也可参阅WO-A-97/10329。
但是，发现不是所有的神经干细胞都能通过移植，成功地修复神经损伤。
例如，虽然MHP36细胞(Sinden等人，supra)的确有助于修复，但另一个与之明显类似的细胞系，MHP15，却不能修复损伤。尽管这两个MHP细胞系都有相同的组织来源(即海马)，并且两者都是多能神经前体细胞系，即，这两个细胞系都有能力形成全部种类的脑细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞，但却存在上述差异。
因此，能在早期鉴定适合用于移植，或者能修饰细胞系，从而获得成功的移植和修复的细胞，这是大有益处的。
发明概述本发明以适合移植和修复的细胞能根据它们的基因表达图谱得到鉴定的认识为基础。
举例，本发明运用了称为差异显示(DD)的技术，来研究修复和非修复细胞系的差别。差异显示常被用于显现两个或更多的细胞系之间在基因表达上的差别，并且发现修复细胞系之间有着非常相似的基因表达图谱，而与非修复细胞系之间的图谱有很大差别。这代表一个重要而出乎意料的发现，因为除了它们之间修复能力的不同外，这些细胞系通常在形态学、生长特点和对生长因子的反应性上是惊人的相似。
根据本发明的一个方面，选择适合移植入脊椎动物受损脑中的细胞的方法，包括(i)分离是或有能力分化成具有神经细胞表型的细胞的细胞；(ii)获得这些细胞的基因表达图谱；(iii)将这些细胞的基因表达图谱与已知适合移植的对照细胞的基因表达图谱比较；并且(iv)选择与对照细胞具有相似基因表达图谱的细胞。
在本发明的一个实施方案中，对照细胞来自于MHP36细胞系。步骤(ii)采用差异显式。
本发明不仅对鉴定适合移植的细胞有用，而且可被用于鉴定可能参与或不参与决定神经细胞能否被修复的基因或基因产物。
根据本发明的第二个方面，鉴定参与决定移植入受损脑中时神经细胞能否帮助修复的基因的方法，包括(i)分离是或有能力分化成具有神经细胞表型的细胞的细胞；(ii)获得这些细胞的基因表达图谱；(iii)将这些细胞的基因表达图谱与已知适合移植的对照细胞的基因表达图谱比较；并且(iv)分离与对照细胞表达相同(或不同)的基因。
运用这个方法，已有可能鉴定许多在修复细胞系中表达，而在非修复细胞系中不表达的基因。
根据第三个方面，选择适合移植入受损脑中的细胞的方法，包括确定在此鉴定为SEQ ID NOS.1至5的任何基因序列的存在情况。
发明详述本发明提供了一个方便的方法，来鉴定不能用于在受损的脊椎动物脑中进行移植和修复的细胞。运用差异显式技术，可参照对照筛选细胞系，并选择合适细胞系用于进一步发展。
虽然已知有其它技术可获得基因表达图谱，但差异显式技术是优选的。简单的说，这个技术依赖于从一群细胞中分离mRNA，然后据此确定特定基因的表达水平。这通常是使用反转录来获得拷贝DNA(cDNA)，再通过专一和半定量的引物序列共同扩增来完成。然后将这个结果与对照比较，以评价基因表达的差异。
用于实施差异显式的试剂盒可以购买得到。
此方法中用到的细胞必须具有分化成有神经细胞表型的细胞的能力，即，分化成的细胞应具有神经元、星形胶质细胞或少突神经胶质细胞表型。优选地，在未分化状态的细胞是多能的，即它们具有发育成上述神经细胞表型中的至少两种的能力。多能细胞是已知的，并且本领域技术人员清楚这些细胞的方法。
差异显式技术可以对已分化或未分化状态的细胞进行。但是，优选的是在该操作过程中保持细胞处于未分化状态。保持细胞处于未分化状态的条件在本领域是已知的，包括利用生长因子的培养方法、用于插入如癌基因或条件性可诱导的癌基因进入细胞的重组DNA技术。
本发明提供了一个方便的方法，可用来鉴定能用于在受损的脊椎动物脑中进行移植和修复的细胞。运用本发明的方法，可以参照对照筛选细胞系，并选择合适的细胞系用于进一步开发。
在非修复细胞系中差异表达的基因可以得到鉴定。可通过例如定点突变修饰这些基因，使这些基因失活，从而产生新的适合移植的细胞系。例如，可破坏Pax6或者3R2C基因，以制备适于移植的细胞。技术人员明确修饰或失活这些基因的方法。
修饰过的细胞系，或经本发明方法鉴定为适合移植的细胞系，可以用于常规移植方法。例如，Sinden等人，supra，说明了用于移植入小鼠脑中的干细胞的制备。
本发明涉及本发明的细胞在制备适于治疗脊椎动物脑损伤的组合物中的使用。依据用于治疗目的的细胞的性质，采用适当的递送细胞进入脑中的制剂，技术人员对此是清楚的。根据常规制剂方法，技术人员知道治疗使用的合适的细胞量，以及适合的赋形剂、稀释剂或载体。
下述的实施例说明用差异显式实验来鉴定细胞系MHP36、MHP15、MHP3和SVE10的基因表达图谱。
实施例将细胞系于175cm3锥形瓶中，在含有bFGE的标准MHP培养基中于33℃培养。使细胞达到90％汇合，之后转移细胞系到39℃，在缺乏干扰素的条件下进一步培养七天。
用20mlHBSS(GibcoBRL)洗涤细胞5分钟。加入20ml Trizol(LifeTechnologies)，37℃孵育10分钟，使细胞裂解。然后将溶胞产物转移到一个50ml Falcon管(Stardts)中，加入5ml氯仿。用力混合试管中的物质1分钟，然后通过在4,000转/分的条件下离心15分钟分离各相。将上层水相转移到一个新的50ml试管中，加入7ml异丙醇。将试管在-20℃下放置1小时，使RNA沉淀。在4,000转/分的条件下离心20分钟，RNA成片状沉淀。用70％乙醇(由DEPC处理的水配成)洗涤片状沉淀，在上述条件下离心，并室温下风干10分钟。然后将片状沉淀重新悬浮在439μl的DEPC处理的水中，转移到没有核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管里。
为除去RNA样品中的任何污染DNA，在重新悬浮的RNA溶液中加入下列物质MgCl2至终浓度为5mM；DDT至终浓度为100mM；核糖核酸酶抑制剂500单位和脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)700单位。然后37℃孵育1小时。加入等体积的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(125∶24∶1)，涡流式混合1分钟，然后在14,000转/分(4℃)的条件下离心6分钟，纯化RNA。将得到的上层水相转移到一个新的Eppendorf管中，重复酚/氯仿抽提，直到界面清晰。加入8M LiCl至最后的水层，使之达到终浓度为2.5M，然后将试管置于-20℃过夜。
在14,0000转/分(4℃)的条件下离心15分钟，使RNA成片状沉淀。用1ml 70％的乙醇(DEPC)洗涤片状RNA，在空气中干燥5分钟。然后将RNA重新悬浮在100μl DEPC水中。通过测定260nm和280nm吸收值确定RNA的浓度和纯度。然后稀释RNA，获得浓度为200ng/μl的等分试样，将其保存在-70℃。
差异显式分析所有3’端锚定引物、5’端随机引物均获自Genomyx HieroglyphmRNA profile试剂盒制备。差异显式方法可分为三步cDNA合成、PCR扩增和凝胶电泳。
cDNA第一条链合成通过Qiagen Omniscript反转录酶进行。
取12种Hieroglyph寡聚(dT)锚定的3’引物中的一种和400ng总RNA，组成一个20μl的反应体系，利用它产生足够量的cDNA。将相同寡聚(dT)引物与所有四种Hieroglyph随机5’引物配对组合，利用上述cDNA进行双份差异显式PCR(differential displayPCR，DD-PCR)。
将2μl浓度为200ng/μl的RNA溶液加到0.2ml薄壁PCR管中，同时加入2μl Hieroglyph T7(dT12)锚定引物(AP)(2μM)。70℃加热5分钟，然后置于冰上。向变性RNA/引物溶液中加入10×Omniscript反转录酶(RT)缓冲液，2μl；5mM dNTP’s，2μl；0.1M DTT；0.5μl RNASEOUT核糖核酸酶抑制剂(40μ/μl)(Gibco BRL)；1μlOmniscript(1单位/微升)和DEPC水，至总体积为20μl。将该反应混合物42℃孵育1小时。
每个样品的差异显式PCR一式两份进行。使用Hieroglyph系统(Genomyx)，ClontechTaq聚合酶混合物和[α-33P]dATP(3,000Ci/mmol，Amersham)完成DD-PCR。
对于每个cDNA亚群，一个包括适当的反转录酶(RT)混合物和相匹配的锚定引物(AP)的PCR核心混合物，按满足反应数所需的体积准备。这个核心混合物包括全部的DD-PCR成分，但要用的随机引物除外，它被单独等分在适当的试管中。
每个单独的DD-PCR试管所含成分如表1所示。
表1
DD-PCR之后，在变性条件下用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离放射性标记的cDNA片段。此过程包括使用Genomyx LR测序仪和LR优化HR-1000聚丙烯酰胺凝胶制剂。4.5％和6％HR-1000凝胶根据制造商的建议制备；4.5％凝胶用于分辨大小为700bp至2kb的片段，6％凝胶用于分离大小为100bp至600bp的片段。
从每个DD-PCR样品中取7μl，与4μl上样染料(Genomyx)混合，95℃加热3分钟，置于冰上冷却。取3μl热变性的样品加入凝胶泳道。将一式两份的反应上样于相邻的泳道，并且由相同引物对产生的样品上样于连续的泳道中。6％凝胶在2,500V、100W、50℃下，电泳6小时；4.5％凝胶在1,500V、100W、50℃下，电泳16小时。
电泳后，按制造商的方案，将凝胶干燥于Genomyx-LR测序仪的玻璃板上。放置BioMax MR(Kodak)超高分辨率胶片于凝胶上，曝光16小时，得到凝胶的放射自显影照片。
放射自显影照片显示对应于在非修复细胞SVE10和MHP15中表达，但在修复细胞系MHP36和MHP3中不表达的基因的条带。照片上也显示了对应于在修复细胞系中表达，但在非修复细胞系中不表达的基因的条带。
从凝胶中切下条带之前，将放射自显影照片用90％乙醇洗涤，且晾干。在自显影标记(Stratgene)的帮助下，使放射自显影照片对齐于凝胶的顶部。沿着凝胶长边，固定放射自显影照片。鉴定出差异表达的转录本(DET)，并且根据Genomyx方案切下条带。将切下的条带置于100μl洗脱缓冲液(EB，10mM TrisHCl，pH7.5)中，使DNA在室温下洗脱6小时。洗脱的DNA保存在-20℃。
利用单链构象多态性(SSCP)凝胶分析消除可能由于相同大小、不同序列片段的共迁移造成的假阳性结果。这个方法包括，对分离片段进行有限再扩增(SSCP-PCR)，随后在SSCP凝胶上分离扩增产物。PCR的条件与DD-PCR的类似，不同之处为低退火温度(50℃)的循环数减至2，高退火温度(60℃)的循环数为10。取4μl SSCP-PCR反应物，加入10μl SSCP上样缓冲液(80％甲酰胺，0.01％溴酚蓝，0.01％二甲苯腈蓝，1mM EDTA，10mM NaOH)，95℃变性10分钟，然后上样于琼脂糖凝胶。样品在Genomyx-LR测序仪上在0.6×tris硼酸EDTA缓冲液(TBE)中，8W电泳16小时。放射自显影后，切下凝胶中对应于差异表达转录本的候选区域，且置于100μl洗脱缓冲液(EB)中。测序和鉴定DET回收的差异表达cDNA通过PCR再次扩增，以提供用于直接测序的有效模板原料。PCR反应包含的成分如表2所示。
表2
根据制造商的方案，用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的产物用60μl洗脱缓冲液洗脱。纯化的PCR产物用Thermosequenase放射标记末端循环测序试剂盒(Amersham)测序。根据制造商的方案，利用M13反向引物(-48)(Genomyx)完成该反应。将测序产物上样于含6％Long Ranger(FMC)、8M尿素、1×GTB(甘油耐受缓冲液)的凝胶，在2,500V、100W、50℃、1×GTB中电泳4小时。放射自显影后，手工读取测序梯度，得到的序列数据用于查找Genbank数据库(已发表的和EST)。
表3显示了实验中用到的细胞系的基因表达图谱。MHP36和MHP3是适合移植入受损脑中的细胞。可以清楚地看到，MHP36和MHP3的表达图谱相似。同样的，MHP15和SVE10的图谱相似。但MHP36/3的图谱，以及MHP15/SVE10的图谱明显不同。这表明这两类细胞在功能上有差别，MHP15和SVE10不具有修复能力。
表3
对表达产物的分析显示，非修复的MHP15细胞表达名为Pax6的基因(Gotz等人，神经元(Neuron)(1998)，21；1031-1044)，而来自MHP36的细胞不表达该基因。
因此，预计表达Pax6基因的神经细胞不能修复脑损伤，相反，不表达该基因的神经细胞系能够帮助修复。
Pax6被认为是一个定位基因，对决定胚胎细胞在脑发育中注定要处的位置有重要作用(Fernandez等人，发育(Development)(1998)1252099-2111)。
进一步分析显示，非修复、非多能细胞表达3R2C基因(Genbank编号25216)。在允许的条件下培养时，MHP36细胞不表达该基因。
序列表<110>ReNeuron Limited<120>鉴定适于移植的细胞<130>REP06134Wo<140>未知<141>2000-10-24<150>9925210.8<151>1999-10-25<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>273<212>DNA<213>小鼠<400>1gtggcctcaa ccacattggt actagtcaat agcgcatgtg gcttcccctg gacaacaagt 60gagtttatgc cctggaatgt gtttgatggc aagcttttcc atcagaagta ccgcagtctg 120aaaagggata tgccgtggaa gttcttttgg aacaaaatag atcgtggctc accaagttcc 180acaacctgaa ggcagtggtc tgcaaggcct gctccaagga gaaccggcgc atcgtaggca 240gaacgcattg ggactctcct tacacaggga ggc 273<210>2<211>325<212>DNA<213>小鼠<400>2cataatttag aagaccgttt gaaaagatat gaaaagaatg catgtgcagc aactgtgggg 60acaccttaca aaggtggcaa tttgtaccac actgaggtct cactcttcgg agaacctacc 120gagtttgagt atttgcgaga agtgatgttt gaatatatga tgggtcgcga gactaagacc 180atggccaaag ttataaccac tgtcctgaaa ttccctgatg atcaggctca gaaaattttg 240gaaagagaag atgctcgtct gatgttgctt ttctgttgat tctgtgaaat agactgatac 300atggactaac agccaccaag aatgg 325<210>3<211>272<212>DNA<213>小鼠<400>3ttgtagtggg ctgccttcat ccataggaag tgtgtgtaaa ttagatgaga gcagtgctga 60ggaggccgac aaatcgcgag aaagatctca gtgtgctgtg aaagctgcta ataaagattc 120cagtgtcaca ccaaaaggga atttaagcaa tggaaacagt ggctctaaca gcaaagctgt 180taaggaaaat gacaaagaaa agggcaaaga aaaagaaaaa aaagaaaaga ccccagctgt 240tatccagagg ccgggtactt ggtaaagaca gt 272<210>4<211>438<212>DNA<213>小鼠<400>4taccagttca agcactgccc atggttgtcc cacctcagga gcctgacaaa ccacctgcca 60accttgctgc tactcttccc gttaggagta aagcagtcag tggaagagca tctgcaatgt 120caaacactcc tacccacagt atcgctgctt ctgtttccca acctcagact ccaactccaa 180gtcccatcat ctctccttca gccatgctac ctatctaccc tgccattgat attgatgcac 240agactgagac taatcatgat actgcactaa cacttgcctg tgctggtggc catgaggaac 300tggtacaaac actactagag agaggagcta gtattgaaca tcgagacaag aaaggtttta 360ctggactcat cttggctgct acagctggtc atgttggtgt tgtagagata ttgctggaca 420atggtgcaga cattgaag 438<210>5<211>206<212>DNA<213>小鼠<400>5gccatgtact actgtgccag acacacagtg tgggaagtcc aatgagagcc tgcacaaata 60cttctctgca gggatgctca caaccagcag ggggcgctga ggacccaaag ggacttccca 120ggatctcttc tggaatctag ggagctctga cctgtgtcta tcagcatgtg tttcaatgtt 180agagttctta gttttccttc cagcaa 206<210>6<211>204<212>DNA<213>小鼠<400>6aagtcacaat tactctgata cctaaaccac acaaagaccc aataagtaaa gagaacttca 60gaccagtttc ccttatgaat atcaatgcaa aaaaagctca ataaaatttt cacaaaccga 120agccaagaat aaaataaaag ccaagaataa aaggatcatc catcatgatc aagtaggctt 180catcccaggg atgctgggat ggtt204<210>7<211>267<212>DNA<213>小鼠<400>7cgcgctttta aatgagaatg tctatagcgt tcacttcgaa aaggagcata aagctgagaa 60agtcccagcc gtagctaact acattatgaa aatacacaat tttactagca aatgcctcta 120ctgtaatcgc tatttgccta cagataccct acttcaacca tatgttaatt catggtctgt 180cttgtccgta ttgccgttcc accttcaatg atgtagagaa gatggcagca cacatgcgaa 240tggttcatat tgatgaagag atggggg 26权利要求
1.选择适合移植入脊椎动物受损脑中的细胞的方法，包括(i)选择是或有能力分化成具有神经细胞表型的细胞的细胞；(ii)获得这些细胞的基因表达图谱；(iii)将这些细胞的基因表达图谱与已知适合移植的对照细胞的基因表达图谱比较；并且(iv)选择与对照细胞具有相似基因表达图谱的细胞。
2.鉴定其表达能确定神经细胞能否修复受损脑的基因的方法，包括(i)选择是或有能力分化成具有神经细胞表型的细胞的细胞；(ii)获得这些细胞的基因表达图谱；(iii)将这些细胞的基因表达图谱与已知适合移植的对照细胞的基因表达图谱比较；并且(iv)分离与对照细胞表达相同(或不同)的基因。
3.根据权利要求1或者2所述的方法，其中对照细胞不表达基因Pax6或者3R2C。
4.根据前面的权利要求中任意一项所述的方法，其中对照细胞是MHP36。
5.根据前面的权利要求中任意一项所述的方法，其中步骤(ii)通过差异显式实现。
6.选择适合移植入受损脑中的细胞的方法，包括确定在此鉴定为SEQ ID NOS.1至5的任何基因序列的存在。
全文摘要
本发明涉及通过例如差异显示，对选择细胞的基因表达图谱与获自对照细胞的图谱进行比较，鉴定适于在移植治疗中修复神经损伤的多能细胞。
文档编号A61K35/12GK1420936SQ0081482
公开日2003年5月28日 申请日期2000年10月24日 优先权日1999年10月25日
发明者J·普赖斯, D·尤瓦诺格 申请人:兰诺龙有限公司