人细胞库及其在自体细胞移植和组织修复中的应用的制作方法

专利名称：人细胞库及其在自体细胞移植和组织修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人的细胞库，其制备方法及应用。更具体地说，本发明涉及在人的足月新生儿至婴幼生命活动旺盛时期收集、分离并冻干保存的细胞和/或组织，制备这些细胞和/或组织及建立相应的细胞库的方法。本发明进一步涉及所说的细胞库在自体修复、替代或再生同一个体在未来生命过程中特别是老年时期因各种疾病、各种物理或化学或生物学损伤，以及退行性病变所导致的缺损、老化或功能低下中的应用。
细胞是机体生命活动的基本单位。在人的整个生命活动中，机体总是不断地有些细胞衰老和死亡，同时又有许多新的细胞增殖和再生以补偿衰老和死亡的细胞。机体内绝大多数细胞在受到耗损时，常常能够自行修复和更新。对于一个特定个体来说，甚至局部许多细胞(除心肌细胞和脑细胞外)衰老或死亡几乎不影响机体的寿命。然而，细胞总体的衰老与整个机体的衰老又是密切相关的。所以，研究者们常常从细胞衰老机理入手进行老年医学的研究。
机体对细胞和组织的损伤有着巨大的修补和恢复能力，不仅可以恢复细胞和组织的结构，而且还可在不同程度上恢复其功能。这些修复过程是通过局部未受损组织细胞的分裂和增殖来完成的。目前临床上广泛采用的组织修复方法包括自体组织移植、异体组织移植和使用天然或化学合成的组织替代物。其中自体组织移植虽然避免了免疫排斥反应，但前题是需要损伤人体自身的正常组织。异体移植存在因缺乏组织相容性而导致的免疫排斥，以及供体来源有限的问题。使用人工组织替代物同样也存在异物排斥问题，并且有造成感染的危险。
随着再生医学的建立和发展，科学家们已经有可能应用细胞工程和组织工程技术，基于基质网架、相应的组织细胞和生长因子三个基本要素，模拟机体组织器官的天然条件和发育生物学规律，掺入活细胞、大然细胞成分、细胞合成产物及细胞内和细胞间调节物质等，以人工构建不同的生物组织和器官，例如软骨、骨、肌腱、肌肉、皮肤、血液、心瓣膜及血管等。再生医学包括组织器官形态再生和功能再生两个方面。一般说来，人们总是期望再生的组织不仅能够从形态学上修复或替代受到损伤的局部细胞或组织，同时更希望能够恢复和补偿受损伤细胞或组织的生理功能。
近年来，随着分子生物学技术和临床医学的不断进步，基因治疗这一医疗方法已引起了越来越多的医学研究和临床工作者的关注和积极参与。目前，已出现了许多将遗传材料转移或修饰技术与细胞工程或组织工程技术相结合，用于修复或补偿局部组织或器官的遗传缺陷或功能缺失(退下)的研究报导(如参见美国专利6,077,981、6,103,230、6,264,941等)。然而，这些技术非常复杂，所需成本很高，目前仍处于早期实验室研究阶段，且成功率很低。
为了有效地修补和恢复局部受损伤细胞的正常形态与功能，除了目前尚存在大量的技术问题有待解决和选择使用即有良好的组织相容性，又能极好地模拟体内环境的细胞外基质(ECM)外，顺利地取得并培养移植后持续保留其固有形态与功能的种子细胞，仍是细胞工程和组织工程领域内一个亟待解决的问题。
本发明的一个目的是提供一个包括由不同组织或器官来源分离、纯化并冻干保存的细胞的自体细胞库。
根据本发明的一个优选实施方案，其中细胞库的种子细胞包括表皮角朊细胞、上皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、已分化完全或未分化的外周血细胞、骨髓造血干细胞、骨膜细胞、软骨细胞、脐带血干细胞、软骨细胞、肌细胞、免疫系统细胞、神经鞘膜细胞、合体滋养细胞及毛细胞血管内皮细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的细胞库中的种子细胞来源于新生儿或其附属物，以及婴幼儿。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的新生儿附属物包括脐带、胎膜和胎盘。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的细胞库中的种子细胞是自体细胞。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的细胞库中的种子细胞是经过或未经过遗传修饰的。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的细胞库中的种子细胞基本上是通过无损伤方法获得的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的细胞库至少保存30年。
本发明的另一个目的是提供如上限定的细胞库中的相应组织细胞在同一个体成年或老年之后进行细胞移植或组织修复中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的应用还包括用于作为基因治疗中外源DNA的宿主细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的应用还包括用于整容手术。


图1显示Wistar新生大鼠原代表皮角朊细胞体外培养10天后长成的典型铺路石状细胞单层(×100)。
图2显示Wistar新生大鼠真皮原代成纤维细胞体外培养7天后长成的密集细胞单层(×100)。
图3显示使用胶原蛋白-壳多糖的2∶1(v/v)混合物制备的复层人工皮肤的基质网架的扫描电镜超微结构照片(×300)。
图4显示老年大鼠皮肤创面植入基于动物出生时收集的自体表皮和真皮细胞的复层人工皮肤后第6天的组织学观察结果(HE染色，×200)。
图5显示老年大鼠皮肤创面植入基于动物出生时收集的自体表皮和真皮细胞的复层人工皮肤后第15天的组织学观察结果(HE染色，×400)。
本发明涉及人细胞库，特别是涉及包括来源于快速生长发育的足月新生儿或其附属物或婴幼儿的相关组织或器官之细胞的细胞库。本发明进一步涉及制备所说的细胞和细胞库的方法，以及当相应个体成年或老年后，所说的细胞库细胞在自体细胞移植、组织损伤修复及基因治疗中的应用。
在细胞和组织工程领域中，目前所存在的关键问题包括种子细胞的组织相容性、细胞行为特征(包括合成和分泌细胞外基质成分、产生并分泌相应细胞因子、细胞受体、细胞间介质、信号蛋白及激素的能力在内的各种细胞功能)，以及细胞分裂和增殖能力等。虽然自体细胞移植可以有效地克服免疫排斥和相关不良免疫反应问题，但对于成年后期特别是老年时期的个体来说，当需要进行细胞组织移植或重新构建新的待移植组织时，一般只能利用发生疾病或组织损伤当时的细胞和/或组织。然而，此时人体的某些组织已发生不同程度的退行性变或老化，表现为细胞活力和增殖能力降低，以及正常生理功能的衰退。例如，人胚胎成纤维细胞可传代40～60代，出生到15岁可培养20～40代，而15岁以上只能在体外传10～30代。已有证据表明，胚胎成纤维细胞的群体传代数与该物种的寿命大致呈正比关系。在活体组织移植实验中，也已得到相似的结果。
细胞衰老最显著的结构改变是细胞内原生质和水份的减少，以及细胞核固缩和核外染色物质的减少。细胞衰老的另一个显著特征是细胞内色素或蜡样物质沉积。例如，皮肤细胞中这些物质的沉积可表现为“老年斑”的形成。
除上述结构和形态改变外，随着细胞衰老，细胞还发生一系列生化代谢能力的改变，特别是表现为氨基酸和蛋白质合成速率下降。另外，衰老细胞内酶的活性与含量也有所改变，例如老年神经细胞硫胺素焦磷酸酶活性降低，导致高尔基体的分泌功能和囊泡的运输功能低下。另外已証实，造血细胞的端粒长度随着年龄的增长而缩短，而且端粒酶活性提高，从而起到延长细胞寿命的作用(Engelhardt M et al，Blood，90182-193，1997)。
仅就最易于观察和研究的皮肤组织而言，随着年龄增长而出现皮肤老化的形态和代谢特征主要表现为皮肤增厚、成纤维细胞失去活力、胶原合成减少、弹性蛋白含量降低、氨基聚糖含量减少及皮肤血管减少和扩张等。其中，由于胶原蛋白合成及翻译后加工相关的酶类减少，而导致皮肤中胶原蛋白含量下降。由于老化皮肤中血管减少并且表皮与真皮间的连接变厚，所以老年人皮肤更易于遭受机械损伤。另外，由于老年人皮肤中可产生并释放淋巴因子、白细胞介素和细胞生长因子的炎性细胞及肥大细胞缺少，所以皮肤更易于遭受外界致病因子的侵害。
相反，年青的细胞特别是得自胎儿期至婴儿期儿童的细胞则不存在上述老化细胞的种种缺陷。这些细胞代谢旺盛、增殖能力极强，而且功能完善。特别是随着细胞学和细胞工程技术的不断进步，目前不仅能够分离、纯化得到并长期保存(例如保存10年以上)这些生命力旺盛的年青细胞，而且也完全有能力体外大量增殖这些细胞，并利用目前成熟的和未来进一步发展的技术，将这些细胞作为一个十分有价值的最佳细胞来源，用于构建各种人工组织甚至器官，以治疗各种病原因子导致的机体各种器官和组织的缺损、功能失调和疾病。
根据本发明，用于建立细胞库的种子细胞包括但不仅限于上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、已分化完全或未分化的外周血细胞、骨髓造血干细胞、脐带血“干”细胞、免疫系统细胞、肝细胞、神经鞘膜细胞、骨膜细胞、软骨细胞、肌细胞、合体滋养细胞和毛细胞血管内皮细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的上皮细胞包括皮肤表皮细胞及口腔和胃肠道上皮细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的免疫系统细胞包括胸腺细胞和脾细胞。
根据本发明，用于建立本发明细胞库的细胞来源包括足月新生儿或婴幼儿的正常机体组织细胞。
本说明书中使用的术语“新生儿”是指孕龄达到37周至42周，体重大于或等于2500g出生的足月新生儿。从出生到1月龄的儿童称为新生儿期。本说明中使用的术语“婴幼儿”是指出生1个月至3岁的儿童。术语“胎儿附属物”包括胎膜、构成胎盘之胎儿部分的叶状绒毛膜，以及包括脐带血在内的脐带。一般说来，这些材料均可以在胎儿出生后直接取得。
本说明书中使用的短语“基本上无损伤方法”是用于说明收集个体新生儿或婴幼儿细胞的方法，其中包括但不只限于使用拭子或玻片直接刮取皮肤组织的表皮细胞，或口腔、鼻腔、肠道、阴道、尿道上皮细胞，以及角膜细胞；使用静脉穿刺法收集外周血细胞；使用经皮穿刺法收集皮肤表皮细胞、真皮细胞、肌细胞和末梢神经鞘膜细胞；使用骨(如髂骨)穿刺法收集骨膜细胞和骨髓造血干细胞；使用组织穿刺法收集胸腺细胞、软骨细胞、肝细胞或脾细胞。包括胎膜、胎盘和脐带在内的胎儿附属物则可在胎儿出生后直接获取，并可使用简单的常规方法从这些组织中分离并纯化所需的细胞。这些细胞可包括脐带血中的血细胞、羊膜组织中的上皮细胞和成纤维细胞，以及叶状绒毛膜中的合体滋养细胞和血管内皮细胞。
在某些特殊情况下，也可以在出生至少年期(例如14岁以前)的任何发育成长时期，当个体经受各种创伤或手术(如扁桃体切除术、阑尾切除术等)时，在创伤治疗或手术过程中，并在不致于造成明显的额外损伤的前提条件下，从创伤或手术局部采集所需的组织并从中分离相应的细胞。
作为建立本发明细胞库的一个重要细胞来源，这里应特别提到的是脐带血。胎儿出生后留在脐带和胎盘中的血液即通常所说的脐带血。由于脐带血与骨髓一样，其中含有可再生的“干”细胞，即由之衍生白细胞、红细胞及血小板等其它血细胞的原始细胞，所以具有十分重要的医疗价值。目前人们已认识到，脐带血干细胞是一种独特的未成熟免疫细胞。当将可用于移植(无论是自体还是同种异体移植)时，这些细胞被识别为外来物质而引发免疫反应程度很小。当植入病人体内后，即使单个干细胞也可对病人因肿瘤放疗或化疗造成的造血功能障碍，以及其它及免疫系统疾病等发挥很好的治疗作用。由于骨髓干细胞来源的不足，所以如能常规建立同样含有再生“干”细胞的脐带血库，将会有更多的生命得到救治。在某些情况下，脐带血可能比骨髓更为有效。理由包括(1)移植后脐带血细胞引发不良反应的可能性更小。例如，当供体和受体是胞亲时，其引发移植物抗宿主反应(GVHR)的发生率要比使用骨髓低10倍；(2)脐带血干细胞比骨髓细胞的增殖和再生能力约强8～10倍；(3)收集脐带不会伤及母婴机体；(4)脐带血含有病毒(如HIV、HV)的可能性要比从成年供体获得的骨髓更小；(5)脐带血干细胞更适用于基因治疗。
可使用脐带血治疗多种遗传病和血液病，以及其它许多疾病。可使用脐带血治疗的疾病包括恶性血液病(如白血病、骨髓瘤)、再生障碍性贫血、范可尼贫血、浆细胞病变及遗传性红细胞异常等。目前，脐带移植物主要是用于治疗白血病。根据本发明，特别令人感兴趣的是可以以脐带血库的方式在液氮中长期冷冻保存脐带血，以备在同一个体成长到儿童期甚至成年之后用于治疗可能发生的各种严重疾病。一般说来，两岁后使用时，个体的自身脐带血是最为有效的移植物材料。收集脐带血的方法及装置可参见美国专利5,619,149、5,916,202和5,919,202等。
可使用各种已建立的或正在发展中的细胞分离和纯化方法，在无菌条件下，从组织材料中分离并纯化出用于建立本发明细胞库的各种不同类型或来源的0～3岁新生儿和/或婴幼儿的游离细胞。这些方法例如包括但不仅限于酶解分离法(如使用胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原蛋白酶等)、非酶解分离法(如使用EDTA等螯合剂、甘氨酸和双糖等)；基于细胞大小和密度差异的密度梯度离心法；基于细胞表面所带静电荷不同的细胞电泳法；基于细胞表面特征成分(如特异性细胞表面抗原、受体)的亲和层析法，以及基于细胞对某些物质特异亲和粘着性的细胞分离技术等。再者，还可使用特定的荧光染料(如使用荧光染料偶联的特异性抗体)标记细胞，然后使用流式细胞分选仪高效、准确地分离细胞群体中的两种或多种具有不同形态及生物学表征的细胞。
分离并纯化的细胞可在经过传代培养或简单地增殖后，制成可供冷冻保存的“特征性”细胞。这些细胞在冷冻保存之前必须经过的特征鉴定包括细胞存活性检查、污染检查、细胞类型鉴定、同功酶和细胞核学分析、克隆形成率和特异性生物学活性物质生成与分泌功能鉴定，以及免疫学鉴定等。至少使用上述前三种方法鉴定后，将细胞分出大部分作为种子细胞，并取少量细胞供当前的研究使用。必须保证所有传代细胞的特征都是相同或相近的，即保存10年、20年、30年或更长时间后的细胞应是与建立细胞库时的细胞相同或相近的。保证细胞基因的稳定性，避免细胞系的形态学改变和衰老是建立本发明细胞库的必要前提条件。在制备脐带血细胞库的情况下，一般只须经过简单的分离纯化及细胞分析过程后即可直接冻存。有关细胞的冷冻保存和定量复苏与再建、细胞系的特征鉴定、细胞传代培养和大规模培养、以及含血清或无血清培养基的选择及培养方法，例如可参见Animal Cell Cultrue a Practical Approach，Edited by R.Ian Freshney，Oxford University Press，1992。
本发明基于从新生儿(包括胎盘、脐带血)至婴幼儿时期机体内收集的各种年青体细胞所建立的细胞库，主要用于同一个体在继后的生命过程中(包括采集细胞或相应组织后的少年、成年和老年期)的自体细胞或组织移植以及新的人工组织和器官的构建，以修复或治疗机体因各种创伤或疾病所导致的组织或器官的缺损、各种病理改变及相应的功能紊乱、低下或丧失。在某些肿瘤、贫血、局部组织或器官损伤的治疗和修复中，以及用于整容和美容目的时，使用本发明的脐带血干细胞库，骨髓干细胞库，以及其它组织或器官来源的细胞库，不仅在极大程度上甚至完全避免了使用其它供体种子细胞可能引起的不良反应，而且这些细胞均保留了年青细胞的形态和功能特征，因而当同一个体在成年、中年和老年时期使用这些细胞时，被增殖或重新构建的局部组织或器官将会保持这些年青细胞的基因调控和代谢状态、细胞生物学行为(如增殖与分化、细胞运动、形态维持、物质运输、生长与代谢调控、细胞识别、细胞粘合与连接、信号表达与传递、能量交换、离子通透、抗原呈递等)，以及合成与释放特殊的生物学活性物质(如细胞外基质、细胞因子和淋巴因子、细胞粘附物质、生长因子、激素及信号递质等)的功能。
除作为未来用于同一个体的组织培养、自体细胞或组织移植，以及人工组织构建中的细胞来源外，本发明的细胞库还可作为将来核移植和体细胞基因治疗的自体或异体(如用于有血缘关系的家族个体成员)细胞或DNA来源。当然，取自本发明细胞库的各种类型细胞或其遗传修饰产物，也可用于分子生物学和基因工程、细胞工程和组织工程学等领域的各种实验室研究目的。
如前所述，使用本发明细胞库的细胞进行自体细胞移植和组织工程研究，不仅取材方便，细胞分离和纯化手段以及培养方法相对简便，而且不存在任何伦理问题。
下列实施例旨在举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
(1)新生大鼠皮肤细胞的制备和培养选择健康的足月产新生Wistar大鼠并在麻醉下从动物背部切除小面积全层皮肤。75％乙醇浸泡3分钟后，用D-Hanks液洗3次。将皮肤切成5×5mm小块，并用中性蛋白酶(40g/L)室温下消化24小时，然后机械分离表皮和真皮组织。
表皮组织用含有胰蛋白酶(0.25g/L)和EDTA(0.1g/L)的溶液37℃消化5分钟后，将消化产物过200目网筛。用含有青霉素(105U/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM培养基将细胞洗3次后，以苔酚蓝染色法观察细胞存活性。然后在含有15％(v/v)胎牛血清、青霉素和链霉素(浓度同上)、胰岛素(80U/L)、氢化可的松(0.8mg/L)、转铁蛋白(5mg/L)和表皮生长因子(20μg/L)的DMEM培养基中和6.8％CO2环境下37℃培养之。
真皮组织用I型胶原酶(2.5g/L)37℃消化4小时后，基本上按照上述方法和步骤进行处理，并使用含有胎牛血清(15％，v/v)、HEPES(10mM)和青霉素与链霉素(浓度同上)的培养基，在5％CO2环境下37℃培养之。
待两种细胞增殖到足够的细胞密度(1～5×106细胞/ml)后，进一步进行细胞污染和细胞形态学鉴定。然后在液氮中冻存这些纯的种子细胞(如保存时间较短，也可在-70℃冰箱中冻存)。在冷冻细胞液中加入二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为保护剂，并选择合适的冷冻及冻融速度。本实施例中所用细胞冷冻液为添加了10％(v/v)DMSO的上述培养基，冷冻速度为-1℃/分钟。使用时，将冷冻管从液氮中取出并直接放入37℃水浴箱中振荡，直到内容物完全融解。低速离心并加入新鲜培养基后，按常规方法继续培养细胞。
使用丝裂霉素(4mg/L)处理的NIH3T3细胞作为滋养层细胞，接种角朊细胞(2.0×104/cm2)后于37℃和6.8％CO2条件培养之。每3天换一次培养基，约10天后长满细胞单层。反复用含有EDTA(0.1g/L)和胰蛋白酶(0.25g/L)的溶液简单消化后，继续培养细胞并传代。另外，将培养的成纤维细胞悬液按1.0×105/cm2的密度接种于玻璃培养瓶中，基本上按上述培养上皮角朊细胞的常规方法进行培养和传代。
使用噻唑蓝(MTT)染料，以常规染色排除法或集落形成率测定法定量检测两种皮肤细胞的存活率并确定生长曲线。形态学检查可见复苏后培养的细胞生长良好(参见附图1和2)。
(2)基质网架和复层人工皮肤的制备为了制备复层人工皮肤的基质网架，将在2.0％乙酸溶液中制成的2％(w/v)壳多糖溶液与从小鼠皮肤组织提取的胶原蛋白按1∶2(v/v)的比例混合，并加入少量透明质酸(1mg/L)、转化生长因子α1(TGFα1，10μg/L)和纤连蛋白0.1％(w/v)。将混合物4℃下快速搅拌至泡沫状，然后铸型并冷冻干燥，得到厚度约为1.5mm的海绵状人工皮肤基质网架。按本实施例方法制备的人工皮肤基质网架的超微形态学结构如图3所示。
将复苏后培养传代的新生大鼠成纤维细胞按3.0×105细胞/cm2的密度接种于上述基质网架的一侧，37℃培养5天(中间更换培养液1次)。然后将经过上述同样处理的角朊细胞按4.0×105细胞/cm2的密度接种于该基质网架的另一侧。将接种了两皮肤细胞的基质网架置于上述培养角朊细胞的培养液中37℃继续培养5大(中间换培养液2次)，然后再改用气液面培养法培养。培养完成后，即可将该复层人工皮肤移植物植入皮肤及皮下软组织缺损的同一老年大鼠的创伤部位。
按上述方法制备的以大鼠自体新生儿皮肤细胞为基本构成细胞的复层人工皮肤，形态学检查可见细胞层次随培养时间的延长而增多，并逐渐发育、分化成层次分明的基底层细胞、棘层细胞、颗粒层细胞及扁平角质细胞。同时，可见细胞间有桥粒连接，并且细胞内可见有张力细丝及处于不同发育阶段的透明角质颗粒和膜被颗粒。另外，随着培养时间的逐渐延长，可见下层成纤维细胞逐渐增多，并向表皮深入直到表皮与网架之间。同时，网架逐渐被降解，并被成纤维细胞产生并释放的大量胶原纤维、弹力纤维和相关蛋白质成份组成的细胞外基质所取代。
(3)基于自体新生细胞的复层人工皮肤的移植效果观察以生长至老年期(约30月龄)的，新生时提供全层皮肤样品的并在背部另一位置造成全层皮肤创伤的同一个Wistar大鼠作为本实施例的动物模型。创伤2小时后，以接种成纤维细胞的一侧贴近创面的方式植入如上制备的复层人工皮肤。移植后每隔3天通过大体观察、光镜、电镜和红外热像扫描方法观察并分析基于自体皮肤细胞的复层人工皮肤对老年动物皮肤创伤的修复效果。结果可见，移植术后3天移植物与正常皮肤组织融合良好，且与创面贴着紧密。6天后镜下可见有少量毛细血管长入移植物，并且长入移植物的新生皮肤与周围正常皮肤颜色十分相近。术后9天，可见移植物区域毛细血管大量增加，表皮层清晰可见层次分明的基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，并可见表层有角质化物脱落，同时可见真皮层细胞数目和细胞外基质大量增加(参见图4和5)。术后第15天可见创面已基本愈合，修复区皮肤颜色正常，并且所残留的瘢痕极少。
权利要求
1.包括由不同组织或器官来源分离、纯化并冻干保存的细胞的自体细胞库。
2.根据权利要求1的细胞库，其中细胞库的种子细胞包括表皮角朊细胞、上皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、已分化完全的或未分化的外周血细胞、骨髓造血干细胞、骨膜细胞、软骨细胞、脐带血干细胞、软骨细胞、肌细胞、免疫系统细胞、神经鞘膜细胞、合体滋养细胞及毛细胞血管内皮细胞。
3.根据权利要求1的细胞库，其中所说的细胞库中的种子细胞来源于新生儿或其附属物，以及婴幼儿。
4.根据权利要求1的细胞库，其中所说的细胞库种子细胞是自体细胞。
5.根据权利要求1的细胞库，其中所说的细胞库中的种子细胞是经过或未经过遗传修饰的。
6.根据权利要求1的细胞库，其中所说的细胞库中的种子细胞基本上是通过无损伤方法获得的。
7.根据权利要求1的细胞库，其中所说的细胞库至少保存30年。
8.根据权利要求1至7中任一项限定的细胞库的相应组织细胞在同一个体成年或老年之后进行细胞移植或组织修复中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其中所说的应用包括用于作为基因治疗中外源DNA的宿主细胞。
10.根据权利要求8的应用，其中所说的应用包括用于整容手术。
全文摘要
本发明涉及人的细胞库，其制备方法及应用。更具体地说，本发明涉及在人的足月新生至婴幼儿生命活动旺盛时期收集、分离并冻干保存的细胞和/或组织，制备这些细胞和/或组织及建立相应的细胞库的方法。本发明进一步涉及所说的细胞库在自体修复、替代或再生同一个体在未来生命过程中特别是老年时期因各种疾病、各种物理或化学或生物学损伤，以及退行性病变所导致的缺损、老化或功能低下中的应用。
文档编号C12N5/10GK1432645SQ0210007
公开日2003年7月30日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者颜炜群, 周余来, 杨同书, 侯立中, 马昭若, 杨元波 申请人:吉林圣元科技有限责任公司