核酸疫苗接种的改进的制作方法

专利名称：核酸疫苗接种的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及含分离多核苷酸的核酸疫苗构建体，其编码的多肽是MUC1蛋白的糖基化变体，含该构建体的疫苗组合物及构建体或组合物用于接种哺乳动物的用途。
背景技术：
上皮细胞粘蛋白MUC1(也称为episialin或多形性上皮粘蛋白)是一种表达于多种上皮细胞的大分子量糖蛋白。该蛋白由细胞质尾、跨膜结构域和不同数目的20个氨基酸基序串联重复(此处称为VNTR单体，也可称为VNTR表位、或VNTR重复)组成，VNTR中含有高比例脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。由于MUC1基因座的遗传多态性致使重复数目可变，最常见的范围是30-100个重复(Swallow et al.，1987，Nature 32882-84)。正常管腔上皮中，MUC1蛋白仅发现于细胞的顶面，暴露于管腔(Graham et al.，1996，Cancer Immunol Immunother4271-80；Barratt-Boyes et al.，1996，Cancer ImmunolImmunother 43142-151)。MUC1分子最显著的特征之一是其高度O-连接糖基化。每个MUC1 VNTR单体上有5个O-连接糖基化位点。根据

图1的编号系统，它们是Thr-6、Ser-7、Thr-11、Ser-17和Thr-18。
由这些上皮细胞向肿瘤转化形成的恶性癌中的几个变化影响了MUC1的表达。蛋白的极性表达丢失，可在转化细胞的全部表面发现其分布。MUC1的总量也增加，经常是10倍或更多(Strous & Dekker，1992，Crit Rev Biochem Mol Biol 2757-92)。最明显的是，O-连接糖链的量和质都有很大变化。丝氨酸和苏氨酸的糖基化变少，糖链也异常的缩短，形成肿瘤相关的糖抗原STn(Lloyd et al.，1996，J BiolChem，27133325-33334)。作为糖基化改变的结果，MUC1肽链上原来被糖链掩蔽的多种表位变得可以接近。以此方式变得可以接近的一种表位由每20个氨基酸的VNTR单体上存在的序列APDTR(图1中Ala8-Arg 12)组成(Burchell et al.，1989，Int J Cancer44691-696)。
很明显MUC1的这些改变意味着可激活免疫系统，对抗肿瘤表达MUC1形式的疫苗可有效对抗上皮细胞肿瘤、以及事实上表达MUC1的其它细胞类型，如T淋巴细胞。免疫系统杀死表达异常蛋白的细胞的一种主要作用机制是细胞毒性T淋巴细胞(CTL’s)免疫应答，且在治疗肿瘤的疫苗中，像抗体应答一样，也需要这种应答。一种好疫苗将激活免疫应答的所有方面。然而，目前的糖和肽疫苗如Theratope或BLP25(Biomira Inc，Edmonton，Canada)优先激活免疫应答的一个方面，分别激活体液和细胞免疫，更优的疫苗设计需要产生更平衡的应答。
核酸疫苗提供优于传统蛋白疫苗的多种益处，因为它们便宜且容易大量生产。已有报道甚至小剂量即可诱导强免疫应答，且在诱导抗体免疫应答的同时可诱导细胞毒性T淋巴细胞应答。然而，技术障碍阻止了有效对抗MUC1的核酸疫苗的开发。
在核酸疫苗接种中，编码所选抗原的核酸分子被引入宿主的正常细胞。如果编码MUC1多肽的核酸疫苗以颗粒介导的基因转移方式递送(美国专利5371015)，转染频率最高的细胞可能是角质细胞或皮肤朗氏细胞。与之相似，如果核酸由肌内注射递送，骨骼肌细胞和骨髓起源的抗原呈递细胞是主要的靶细胞类型。这些细胞的每种都包含糖基化酶的生理平衡，由此将糖基化由疫苗编码的MUC1基因产物，以此方式使之与正常上皮细胞中的MUC1更相似，而不是转化细胞中发现的异常糖基化形式。事实上，几乎所有用编码MUC1的多核苷酸转染的细胞将糖基化该疫苗编码的基因产物。因此，仅管可以见到一些效果，疫苗不能最佳刺激抗肿瘤细胞的免疫。
因此，本发明提供编码含VNTR单体或其重复或其片段多肽的核酸疫苗接种构建体，它已经被操作使编码序列不能被正常细胞机制完全糖基化。令人惊奇的是，通过在编码多肽中制造新的氨基酸取代，本发明者在一方面已经设法达到此要求。发明人已制造出核酸疫苗接种构建体，其所含多核苷酸编码的多肽保留了MUC1的构象，这是变化多肽保持免疫原性的基本要求，并且其糖基化降低，因此更接近于肿瘤中表达的MUC1形式。
发明概述根据本发明的一个实施方案，已提供了一种核酸疫苗构建体，它所含分离的多核苷酸编码的多肽含有来自MUC1的VNTR单体的至少5个连续氨基酸残基，其中包括一或多个糖基化位点，其特征在于所述多肽包含至少一个氨基酸突变，该突变在至少一个所述糖基化位点阻止或改变糖基化。
一方面，由本核酸疫苗构建体编码的多肽由一个拷贝的MUC1 VNTR单体构成。另一方面，由本核酸疫苗构建体编码的多肽由MUC1 VNTR单体的一个片段组成。
在本发明的进一步实施方案中，提供了一种疫苗组合物，其中含有如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体，并组合有可药用的载体。
在本发明的另一实施方案中，提供了如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物，它们用于哺乳动物抗肿瘤疫苗接种。
另外在本发明另一实施方案中，提供了如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物在制造用于哺乳动物抗肿瘤疫苗接种的药物中的用途。
在本发明另一实施方案中，提供了一种哺乳动物抗肿瘤疫苗接种的方法，包括向所述哺乳动物施用此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物。
附图简述本发明将进一步通过实施例的方式描述，并参考以下附图图1表示一种MUC1 VNTR单体元件(此处称VNTR)的野生型氨基酸序列。
图2表示由优选的分离多核苷酸编码的一种称为Mut5I的多肽序列，本发明的一种核酸疫苗接种构建体含有该多核苷酸。与野生型序列对应的突变表示为黑体。图2也包括编码该多肽的一种代表性核苷酸序列。
图3表示由优选的分离多核苷酸编码的一种称为Mut5V的多肽序列，本发明的一种核酸疫苗接种构建体含有该多核苷酸。与野生型序列对应的突变表示为黑体。图3也包括编码该多肽的一种代表性核苷酸序列。
图4表示在一系列抗体浓度范围内，结合到野生型MUC1多肽及表1所示的突变多肽上的抗体。这些结果证明抗体SM3(它识别8-13位残基的APDTRP基序)识别未糖基化多肽的能力。Mut5P、Mut5A和Mut5N表现出与Mut5W基本相同的结果。
图5表示用于产生包含Muc1突变形式的核酸疫苗构建体的克隆策略。
图6用编码MUC1突变形式的核酸疫苗构建体免疫小鼠得到抗体血清。该图表示该血清结合到合成肽形式的野生型MUC1上。这表明本发明的核酸疫苗构建体可在体内产生识别未突变MUC1形式的抗体。
图7表示来自编码MUC1突变形式的核酸疫苗构建体免疫小鼠的抗体血清结合到人乳腺癌细胞上的FACS分析。
这些结果表明本发明的核酸疫苗构建体可在体内产生识别肿瘤表达MUC1形式的抗体。
图8表示实施例3中描述的pVAC1-stc的N端部分的序列。
图9表示用于构建如实施例3所示的MUT4突变MUC1质粒的寡核苷酸。所有序列都是从5’到3’。划线部分指出限制性位点，斜体表示用作短PCR引物的序列。小写字母表示编码期望突变必需的不同于野生型序列的部分。符号“A上部”、“A下部”等指图5所示的策略。
图10表示用于构建如实施例3所示的MUT5N突变MUC1质粒的寡核苷酸。所有序列都是从5’到3’。划线部分指出限制性位点，斜体表示用作短PCR引物的序列。小写字母表示编码期望突变必需的不同于野生型序列的部分。符号“A上部”、“A下部”等指图5所示的策略。
发明详述在本说明书及其所附权利要求书中，除非语境要求，词“含有(comprise)”和“包括(include)”或其变体如“含有(comprising)”、“含有(comprises)”、“包括(including)”、“包括(includes)”等应广义地理解，也就是说，使用这些词意味着可能包括未具体列举的整数或元素。
如此处所述，本发明涉及含有分离的多核苷酸的核酸疫苗构建体，该构建体用于抗肿瘤疫苗接种。在本发明内容中，名词“分离的”含义是多核苷酸不在其天然状态，至少已经进行了一定程度的纯化或由合成产生，例如通过重组方法或机械合成。因此，名词“分离的”包括多核苷酸与其它生物学或非生物学物质组合在一起的可能性，如细胞、细胞悬液或细胞碎片、蛋白、肽、表达载体、有机或无机溶剂、或其它适用物质，但不包括多核苷酸处于天然状态的情况。
在本说明书和权利要求书中，本发明中核酸疫苗构建体所含的分离多核苷酸编码的多肽被称为“被编码多肽”。所述被编码多肽含有来自MUC1的VNTR单体的至少5个连续氨基酸残基，其中一或多个所述氨基酸是糖基化位点，且在至少一个所述糖基化位点上糖基化已被阻止或改变。优选地，所述被编码多肽含有至少10个来自MUC1的VNTR单体的氨基酸，例如13、15、16、17、18或19个。特别优选地，所述被编码多肽含有至少20个来自MUC1的VNTR单体的氨基酸。连续氨基酸可以完全来自一个VNTR单体，或可以跨单体，例如三个所述连续氨基酸可以来自一个VNTR单体的N末端，下两个氨基酸可以来自另一个VNTR的C末端。
术语“至少5个连续氨基酸”包括一或多个所述氨基酸经过氨基酸突变已由野生型改变的情况。例如，其序列包含三个野生型序列氨基酸，然后是接着的野生型氨基酸的一个氨基酸取代，然后又是三个野生型氨基酸，这种被编码多肽被认为有至少5个来自MUC1 VNTR单体的连续氨基酸。
本发明包括含分离的多核苷酸的核酸疫苗构建体，其编码的多肽具有VNTR单体或单体片段的任何改变，其中含有至少一个糖基化位点且在至少一个糖基化位点糖基化被阻止或改变。在一个实施方案中，本发明的核酸疫苗构建体含有的分离多核苷酸是这样的，其编码的多肽由1到10个拷贝的VNTR单体组成。在另一个实施方案中，本发明的核酸疫苗构建体含有的分离多核苷酸是这样的，其编码的多肽由10或更多拷贝的VNTR单体组成，例如20，30，50，60，75，90或100或更多拷贝VNTR单体。在进一步的实施方案中，本发明核酸疫苗构建体含有的分离多核苷酸是这样的，其编码的多肽由重复和片段的组合组成，例如，一个VNTR单体和一个片段，1到10个重复和1到10个片段，10个或更多重复和10个或更多片段，10个或更多重复和10个或更少片段，或10个或更多片段和10个或更少重复。在进一步的实施方案中，本发明核酸疫苗构建体含有的分离多核苷酸是这样的，其编码的多肽由片段的组合组成，例如一定拷贝数的一种片段，或一定拷贝数的不同片段。在超过一个片段存在于被编码多肽上的每种情况下，这些片段可以相同或不同。
在一个优选实施方案中，被编码多肽由单个VNTR单体组成。在另一个优选实施方案中，被编码多肽由VNTR单体的单个片段组成，特别优选的是当片段具有序列APDTRP(图1中8-13位残基)时，在此片段中糖基化位点T可以被突变。
优选地，糖基化改变或阻止由被编码多肽内组成糖基化位点的氨基酸突变获得。本说明书及权利要求书所用的术语“氨基酸突变”意思是被编码多肽中的一或多个氨基酸不同于图1所示的野生型MUC1VNTR单体序列。这种改变可以是，例如，一或多个氨基酸的缺失、插入或取代。
这些突变通过设计核酸疫苗构建体所含分离多核苷酸的序列而获得，由此被编码多肽在一或多个糖基化位点上具有氨基酸突变。当所需氨基酸突变是取代时，野生型序列中编码该氨基酸的三个核苷酸将变成编码所需氨基酸的核苷酸。当所需氨基酸突变是缺失时，野生型序列中编码该氨基酸的三个核苷酸将被删除。当所需氨基酸突变是插入时，编码所需氨基酸的三个核苷酸将插入野生型核苷酸序列中。
通过将遗传密码应用于期望的被编码多肽，本领域技术人员很容易确定所需多核苷酸的序列。一旦所需序列已经确定，包含具有期望序列的分离多核苷酸的核酸疫苗构建体可以按实施例中描述的方法得到。技术人员容易采用任何必要的参数，如引物和PCR条件。本领域技术人员也将明白，由于遗传密码的简并性，潜在地有超过一种分离多核苷酸序列可用于产生期望的被编码多肽。
优选地，核酸疫苗构建体含有一种含以下序列的分离多核苷酸GC# CC# GA* G(T/U)# CG# CC#其中#可以是核苷酸A，G，C，或T/U，*可以是核苷酸T/U或C。
符号T/U用于表示该序列可以是DNA或RNA。当序列是DNA时，此位置碱基是T，当序列是RNA时，此位置碱基是U。
替代性地，核酸疫苗构建体包含具有以下序列的核苷酸序列GC# CC# GA* AT/U@ CG# CC#其中，#可以是核苷酸A，G，C，或T/U
*可以是核苷酸T/U或C@可以是核苷酸T/U，A或C。
符号T/U意思同上。
特别优选的是核酸疫苗构建体包含具有图2或图3所示序列的核苷酸序列。
在一个优选实施方案中，分离多核苷酸的序列使得氨基酸突变为取代。在一个更优选实施方案中，分离多核苷酸的序列使氨基酸突变是用另一种缺乏羟基的氨基酸取代丝氨酸或苏氨酸残基，羟基形成O-连接糖基化的结合位点。优选地，分离多核苷酸的序列使丝氨酸或苏氨酸替换为缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸或色氨酸。更优选地，分离多核苷酸的序列使苏氨酸或丝氨酸取代为缬氨酸或异亮氨酸。甚至更优选地，分离多核苷酸的序列使苏氨酸取代为缬氨酸或异亮氨酸。在特别优选的实施方案中，分离多核苷酸的序列是这样的，由其编码的多肽的11位苏氨酸取代为缬氨酸或异亮氨酸，且特别优选的序列示于图2或3，其中氨基酸取代被标出。优选地，分离多核苷酸的序列是这样的，由其编码的多肽已经突变，使得在多肽中存在的至少60％，例如，70％，75％，80％，85％，90％或100％的糖基化位点上的糖基化已被改变或阻止。
被编码多肽优选保留与肿瘤中MUC1形式的免疫学相似性。术语“免疫学相似性”是指尽管一或多个氨基酸突变，被编码多肽中一或多个表位的构象充分保持不变，使得识别肿瘤上表达的MUC1形式的VNTR单体中表位的抗体也将识别被编码多肽中的该表位。术语“免疫学相似性”不仅包括识别肿瘤中表达MUC1形式的所有抗体也识别被编码多肽的情况，而且包括这种情况，对于至少一个识别被编码多肽的抗MUC1抗体，其中至少一个表位充分保持不变。特别优选的是由被编码多肽产生的抗体可区分肿瘤细胞上表达的MUC1形式和正常细胞上表达的MUC1形式，例如通过结合到前者而不结合到后者。
优选的被编码多肽是能被抗MUC1抗体SM3、ATR1、HMFG2或HMFG1识别的那些。特别优选的被编码多肽是能被抗MUC1抗体SM3识别的那些。
本发明的核酸疫苗构建体也可含有另外的分离多核苷酸，它编码一种异源多肽，优选一种免疫原性多肽。该分离多核苷酸位于核酸疫苗构建体上，由此当表达时，异源多肽连接或融合到表达的被编码多肽。优选地，编码异源多肽的分离多核苷酸与编码该被编码多肽的分离多核苷酸相邻。
在一个实施方案中，被编码的异源多肽可以起载体作用以定向于被编码多肽，例如异源多肽可以结合到靶细胞上的受体上。在另一个实施方案中，异源多肽可以起免疫原作用，以增强被编码多肽引起的免疫应答。适用的异源多肽包括匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、乙肝病毒表面蛋白、乙肝病毒核心蛋白、破伤风毒素、谷胱甘肽S转移酶或鸽细胞色素C。在一个优选实施方案中，异源多肽是破伤风毒素或乙肝病毒核心蛋白。编码这些多肽的核苷酸序列对于本领域技术人员很容易获得。
另外，核酸疫苗接种构建体将含有适当的起始子、启动子、增强子及其它元件，例如可能是必需的聚腺苷酸化信号，定位于正确方向，以使蛋白在哺乳动物细胞内表达。
启动子可以是一种真核启动子例如CD68启动子、Ga11、Ga110或NMT1启动子，一种原核启动子例如Tac、Trc或Lac，或病毒启动子例如巨细胞病毒启动子、SV40启动子、多角体蛋白启动子、P10启动子或呼吸道合胞病毒LTR启动子。优选的启动子是病毒启动子。特别优选的是巨细胞病毒立即早期启动子。
转录调节元件可含有增强子，例如乙肝表面抗原3，非翻译区、CMV增强子，内含子，例如CD68内含子或CMV内含子A，或调节区，例如CMV5’非翻译区。
核酸疫苗构建体骨架可以是RNA或DNA，例如质粒DNA，病毒DNA，细菌DNA，细菌人工染色体DNA，酵母人工染色体DNA，合成DNA。核酸疫苗构建体也可以是人工核酸，例如硫代磷酸RNA或DNA。优选的构建体是DNA，特别优选的是质粒DNA。
核酸疫苗构建体上所含的编码多肽的分离多核苷酸可以是RNA，例如mRNA，或可以是DNA，例如基因组DNA，cDNA或合成DNA。优选的多核苷酸是DNA，特别优选的是cDNA。多核苷酸优选可操作地连接到核酸疫苗构建体上的启动子上，由此当构建体插入哺乳动物细胞时，多核苷酸表达产生一段被编码多肽。
当表达于哺乳动物细胞时，本发明的核酸疫苗构建体产生被编码多肽。所述哺乳动物细胞可以是体外的实验室培养的细胞系，例如HEK293T，CHO，HeLa或COS细胞。在此情况下，可以收获被表达多肽并将其自身用于疫苗接种。更优选的是体内哺乳动物细胞，并且将核酸疫苗构建体直接施用于哺乳动物，例如小鼠，狗，猫，兔，猪，牛，马或大鼠或特别优选地，人。
本发明也包括疫苗组合物，其中含有治疗有效量的本发明核酸疫苗构建体，优选与可药用的载体组合，如磷酸缓冲液(PBS)，盐水，右旋糖苷，水，甘油，乙醇或其组合。该疫苗组合物可以替代性地含有治疗有效量的本发明核酸疫苗构建体，配制到金珠上。替代性地，该组合物可以含有与脂质体配制的核酸疫苗构建体。核酸疫苗构建体将是这样的，当施用于哺乳动物时，多肽在该哺乳动物内表达。被表达或施用的多肽然后将产生免疫应答，其中优选同时包括体液和细胞免疫。
本发明也包括如此处所述的核酸疫苗构建体或疫苗组合物用于对哺乳动物进行抗肿瘤接种，以便预防和治疗。优选的哺乳动物是人。疫苗接种可以针对表达MUC1的任何细胞类型的肿瘤，由此肿瘤可以应答识别MUC1 VNTR单体的抗体。在一个实施方案中，肿瘤来自T淋巴细胞。优选地疫苗接种针对上皮细胞肿瘤，更优选地疫苗接种针对乳腺癌或非小细胞肺癌。
核酸疫苗构建体及包括它们的疫苗组合物可以以多种方式给药，例如经口、鼻、肺、肌内、皮下或皮内途径。它们可以作为可注射组合物向个体给药，例如作为无菌水分散液，优选等渗的。一种特别优选的技术涉及粒子轰击(也称为“基因枪”技术，并描述于美国专利5371015)。在此惰性颗粒(如金珠)用核酸包被，并加速到足以使之穿透接受者表面(例如皮肤)的速度，例如用投射装置高压发射的方式。(包被本发明核酸疫苗构建体的颗粒，以及装载这种颗粒的装置在本发明范围内)。其它直接给予接受者核酸疫苗构建体或含所述构建体的组合物的方法包括超声、电刺激、电穿孔和微种植，它描述于美国专利5,697,901。
本发明的核酸疫苗构建体也可以通过基因治疗中所采用的专用递送载体的方式给药。基因治疗方法讨论于，例如Verme et al.，Nature1997，389239-242。病毒和非病毒系统都可使用。基于病毒的系统包括基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和痘苗病毒的系统。非基于病毒的系统包括核酸直接给药和基于脂质体的系统。例如，载体可以用脂质体包裹或包裹于聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)颗粒内。
本发明的核酸疫苗构建体也可以用转化细胞的方式给药。这种细胞包括由患者收获的细胞。核酸疫苗构建体可以体外引入这种细胞，随后被转化细胞可以再返回患者体内。通过同源重组，本发明的核酸疫苗构建体可以整合入细胞内已存在的核酸内。如果需要，转化细胞可以在体外生长，且一或多个所得细胞可用于本发明。通过已知的外科或显微外科技术(例如，移植术、微注射等)，可在患者适当的位点提供细胞。
根据待免疫哺乳动物的物种和体重、待治疗/阻止的疾病状态的性质、所采用的疫苗接种程序(即单次给药或重复剂量)、给药途径和所选佐剂化合物的效力和剂量，核酸疫苗构建体或包含它们的组合物的量在递送时将有很大变化。基于这些变量，医师或兽医实施者很容易确定合适的剂量水平，它可以是，例如0.5-5μg/kg核酸疫苗构建体或包含它们的组合物。特别地，剂量将根据给药途径而变化。例如，当皮内给予金珠时，优选总剂量范围是1μg到10ng，特别优选的总剂量范围是10μg到1ng。当核酸疫苗构建体直接给药时，总剂量通常较高，例如从50μg到1或更多毫克。以上剂量是常见情况的例子，当然可以有个别情况应使用更高或更低剂量范围，并且这种情况也在本发明的范围内。
对于含编码抗原性肽的多核苷酸序列的核酸疫苗构建体或含有该核酸疫苗构建体的组合物，可以单次给药或重复给药，例如，1到7次，优选1到4次，间隔从约1天到约18个月，优选1个月。可选地，可以在一段时间直至患者余生定期间隔1到12个月给药。然而，再次提到，根据相关动物体形和物种、核酸疫苗构建体或组合物的给药量、给药途径使用的任何佐剂化合物的效力和剂量及兽医师或医师显知的其它因素，该治疗方案将发生很大变化。
在以下实验部分将通过实施例方式描述本发明。实施例在本发明以下实施例中，用到多种众所周知并经实践检验的分子和细胞生物学技术。其具体细节可以在多种教科书中发现，包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press。
对MUC1 VNTR内残基的编号是根据图1。实施例1缺乏O-连接糖基化位点的MUC1变体的抗体结合能力设计含糖基化位点突变的合成肽。在此序列中应对苏氨酸残基的取代特别注意(T11)。下表1给出设计的肽及其突变糖基化位点。含两个相同拷贝的设计VNTR的肽在Genemed Synthesis公司(SanFrancisco，CA)合成。然后用ELISA筛选这些肽对多种抗MUC1单克隆抗体的结合能力。
表1
将肽在pH9.6的50mM碳酸氢钠缓冲液中制成水溶液，并以50μg/ml到25ng/ml的浓度4℃过夜包被到Nunc Maxisorp板上。用TBS-Tween(Tris缓冲盐水，pH7.4，含0.05％Tween20)彻底清洗后，将板用封闭溶液(含3％w/v牛血清白蛋白的TBS-Tween)室温封闭2小时。用封闭液稀释抗MUC1抗体HMFG1(Novocastra，Newcastle，UK)、HMFG2(Novocastra)、SM3(Girling et al.，1989，Int JCancer 431072-1076)和ATR1(Bynum et al.，1995，Hybridoma14587-591)，加入板内，室温孵育1小时。清洗后，通过与用封闭缓冲液1/2000稀释的偶联HRP的抗小鼠IgG(P260，Dako，Denmark)共同孵育来标记结合抗体。再次清洗板，用Fast OPD显色试剂(Sigma，Poole，UK)检测结合的偶联抗体。加入3M硫酸终止反应，测量490nm处的吸光度定量OPD产物。
该试验结果示于表2。根据半定量标准对每种抗体和多肽组合的ELISA信号进行评分，其中+++表示强结合，++表示中等结合，+表示弱结合，-表示无显著结合。
表2
这些数据证明MUC1 VNTR单体的所有O-连接糖基化位点都可以改变，以此方式阻止糖基化，而不影响抗原的整体结构，正如其保持结合多种抗MUC1抗体的能力所显示。特别惊奇及有用的发现是，VNTR的Mut5I和Mut5V版保持结合SM3抗体的能力。当用于临床样本的免疫组化研究时，SM3对肿瘤细胞表达的MUC1表现为强选择性染色，而对于周围正常组织表达的MUC1却相反(Girling et al.，1989)。这些发现清楚地表明，有可能衍生出采取与肿瘤形式MUC1所形成表位构像相似的VNTR变体，而这对于疫苗免疫原是高度期望的特性。实施例2突变多肽的抗体结合曲线上表1所述的多肽再次用于本试验，除了将这些肽以固定浓度3μg/ml包被到ELISA板上，同时使用不同浓度的抗体SM3以外，方法基本与实施例1相似。结果示于图4。Mut5P、Mut5A和Mut5N表现出与Mut5W基本相同的抗体结合模式。
图4中的数据不仅确证了以上所显示的结果，而且举例说明了Mut5I和Mut5V中Thr-11向Ile和Val的突变很少降低SM3抗体对肽的亲合性，这表明非糖基化突变事实上可以非常近似地模仿天然序列。实施例3用MUC1突变体进行核酸疫苗接种质粒制备。
表3所用引物
构建pVAClstc质粒质粒pVAC1(Thomsen et al.，Immunology 95S1，OP106，1998)是一种优化用于DNA疫苗的真核表达载体，它包含一个操作性连接到一个多克隆位点的CMV启动子，在多克隆位点内可置入编码抗原的插入片段。一种插入片段包含一个Kozak翻译起始信号、哺乳动物分泌信号和克隆位点，用pMNM1质粒(Ellis et al.，J.Immunology1562700-2709，1996)作模板及引物SSF和SSR(表3)通过PCR制备该插入片段。用Rsr II和XhoI剪切PCR片段得到一个120bp的插入片段，将其克隆进pVAC1的Rsr II和XhoI位点得到质粒pVAC-1ss2。用PCR扩增引物作测序引物确证其DNA序列。第二步是引入“框内”破伤风毒素片段C，(FrC)，基因在引物SSR编码的SgrA I位点融合，在此位点允许“框内”加入抗原性表位。这通过用附带编码肽铰合部和SgrA I和XhoI限制酶位点(分别在FrCF和FrCR)的DNA作引物从pIC9Tet15质粒PCR扩增FrC基因完成，(Clare et al.，Methods in Molecular Biology 103193-208，1998)。1.3kb SgrAI/Xho I酶切PCR片段克隆进pVac-1ss2的SgrA I和Xho I位点产生pVac-1stc质粒。用PCR扩增引物和内部FrC衍生序列FrCS1到FrCS6作荧光测序以确证其DNA序列(表3)。FrC融合蛋白N端表示表位融合位点的DNA序列和氨基酸序列示于图8。构建pVAC1ss2 MUC-1 2TR片段C质粒设计几组合成寡核苷酸，经退火及随后克隆进pVac-1stc质粒，将使之编码一个5拷贝MUC1 VNTR表位(PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)的串联阵列。设计两个变体都是突变版，其中每拷贝表位中可以糖基化的4或5个苏氨酸和丝氨酸残基被不可修饰的氨基酸取代PAHGVVAAPDTRPAPGAVAP，四个突变，(MUT4)和PAHGVVAAPDNRPAPGAVAP，5个突变，(MUT5N)。在所有情况下，MUC1序列将被表达为分泌的FrC融合蛋白的一部分。寡核苷酸列于图9和图10(限制酶位点SgrA I和SalI用下划线标出，小写字母表示与野生型序列不同的突变)。为产生串联重复而用的策略(经T4多核苷酸激酶处理而磷酸化寡核苷酸的5’端以后)示于图5。该策略用于产生一种质粒，其中含“框内”融合到FrC的Muc-1 MUT5N VNTR的两个串联阵列，(pVAC-1stcMUC-1MUT5N)，它通过同源重组和5个重复序列的缺失而形成。为产生类似的含MUT4 VNTR的质粒，使用图5中描述的修饰策略，由此经连接后将寡核苷酸进行PCR扩增。所用引物是图9和图10中斜体的DNA序列，PCR条件是94℃45秒，69-75℃45秒和72℃1分钟，共25个循环。然后如图5进行PCR反应，但只对最大的清晰产物(一般约150-200bp大小)进行凝胶纯化和克隆。用这种方法得到一种质粒，其中含1.5个Muc-1 MUT4重复，(pVAC-1stcMUC-1MUT4)，产生“框内”融合到FrC的VNTR。它通过PCR介导的链跳跃和5个重复序列的缺失而形成。
产生所述序列的替代性方法将是经与上述类似的消化和克隆策略直接合成含更少拷贝VNTR重复的寡核苷酸。构建pVAC1ss2 HepB核心质粒质粒pPA1含有在E1环区带唯一NheI位点的HBV核心抗原的基因(ADW血清型)(Chambers et al.，J.Virol.704045-4052，1996)。该克隆位点允许插入编码外源蛋白关键表位的小片段DNA。蛋白的E1环暴露于所表达核心抗原的表面。用引物HBV1F和HBV1R(表3)通过PCR扩增工程化HBV核心插入片段，并通过TA-悬突方法克隆进pCR2.1(Invitrogen)得到pCR2.1-HepBE1。使用前对构建体测序。
然后用PCR从pVAC-1stcMUC-1MUT4和pVAC-1stcMUC-1MUT5N质粒扩增编码两个串联重复MUC1 VNTR的片段。用pVAC-1stcMUC-1MUT5N作模板和引物MUT5NF和MUT5NR(表3)经PCR制备两个串联重复的MUT5N插入片段。
质粒pVAC-1stcMUC-1MUT4只包含一个完全的串联重复的MUC1VNTR单体。该质粒用作两阶段PCR的模板，其中使用共同的正向引物(MUT4F)和两个不同的反向引物。第一步反应中，反向引物(MUT4R1)添加所需的部分附加序列到已有的串联重复上，以产生另一个完全重复的MUT4版的MUC1序列(即半个串联重复)。所得PCR产物然后用作第二轮PCR的模板，其中使用另一个反向引物(MUT4R2)，以添加完成重复所需的残基以及所需的NheI克隆位点。
用NheI消化MUT4或MUT5 PCR产物，并克隆进用NheI切割的pCR2.1 HepBE1载体。所得克隆经定向并用荧光双脱氧测序法验证序列。然后用SalI和XhoI切除全部HepB核心+MUC-1 TR盒区，并克隆进XhoI切割的pVAC1ss2。最终的构建体通过全序列分析验证，得到pVAC1.ss2.MUT4.MUC1.HepB(在HBV核心蛋白的E1环中编码两拷贝的MUC1 VNTR单体的MUT4变体)；和pVAC1.ss2.MUT5N.MUC1.HepB(在HBV核心蛋白的E1袢环中编码两拷贝的MUC1 VNTR单体的MUT5N变体)。用突变MUC1构建体进行DNA疫苗接种用氯化钙和精胺将质粒DNA沉淀到2μm直径的金珠上。按下文所述将负载珠包被到Tefzel管上(Eisenbraum et al.，DNA CellBiology 12791-797，1993；Pertmer et al.，J.Virol706119-6125，1996)。用Accell基因递送系统进行颗粒轰击(PCTWO 95/19799)。对每种质粒，在第0、21和42天3次给予质粒来免疫5只雌性C56BI/6小鼠。每次给药由两次DNA/金轰击组成，提供总剂量约2.5μg质粒。
在第1、20、41和55天经静脉穿刺从动物获得血清样品，并测试抗MUC1抗体的存在。Nunc Maxisorp板用3μg/ml wt MUC1序列4℃包被过夜(40个单元对应2个串联重复)。用TBS-Tween(Tris缓冲盐水，pH7.4，含0.05％Tween20)清洗后，将板用含3％BSA的TBS-Tween缓冲液室温封闭2小时。所有血清按1∶100稀释在TBS-Tween缓冲液中室温孵育1小时。用1∶2000稀释于TBS-Tween缓冲液中的偶联HRP的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako，Denmark)检测抗体结合。再次清洗板，用Fast OPD显色试剂(Sigma，Poole，UK)检测结合的偶联抗体。加入3M硫酸终止反应，测量490nm处的吸光度定量OPD产物。
该分析结果示于图6。它们表明本发明的糖基化突变序列可用作疫苗，来引起可识别野生型MUC1序列的免疫应答。
为证明由这些疫苗引起的抗体可识别肿瘤细胞，用这些小鼠的抗血清样品标记多种肿瘤细胞系，并用流式细胞仪显示标记。
用补充5％FCS的PBS缓冲液清洗细胞(T67-D，MCF-7，B16F0和B16F0MUC1；1×106)，并与1∶100稀释的小鼠血清4℃孵育15分钟。清洗后，在相同条件下细胞与第二抗体一起孵育(羊抗鼠IgG，Dako，Denmark，1∶10稀释)。在用第二步试剂染色之前，用FACS缓冲液代替第一步的抗体与对照细胞一起孵育。用FACScan(BectonDikinson)进行FACS分析。对每个样品中的一千个细胞同步测量FSC(前角光散射)作为SSC(整体光散射)，以及绿色(FL1)和红色(FL3)荧光(表达为积分光散射的对数)。仅对碘化丙啶阴性(活)细胞的红色荧光作记录，排除FCS超范围的聚集体。数据表达为柱状图，对于结合到肿瘤细胞表面的不同类型小鼠血清，用细胞数(Y轴)对荧光强度(X轴)绘制。
结果示于图7。该图表示，用糖基化突变MUC1构建体免疫小鼠的血清事实上含有抗MUC1 IgG，它可结合到表达天然细胞表面MUC1的人和鼠肿瘤细胞。T47D是人乳腺肿瘤细胞系。B16F0是亲代B16细胞系，这些缺乏MUC1表达的细胞未被标记。然而B16-muc1(用Muc1转染的B16F0)被标记。图7注Sec only＝仅对照产生背景荧光水平的二抗Non imm＝来自未免疫动物的对照血清hepB cont＝来自于用空载体(无MUC1 DNA)免疫的动物的对照血清hepB2TR mut4 & hepB2TR mut5是来自用这些突变MUC1 DNA免疫动物的血清这些数据确证这些变异VNTR序列可用于核酸疫苗接种。
权利要求
1.一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码的多肽含有来自Muc1的VNTR单体的至少5个连续氨基酸残基，其中一或多个所述氨基酸是糖基化位点，其特征在于当所述分离多核苷酸在哺乳动物细胞中表达时，所得多肽的糖基化在至少一个所述糖基化位点被改变或阻止。
2.根据权利要求1的一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码的多肽含有MUC1的一个VNTR单体的一个片段。
3.根据权利要求1的一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码的多肽含有一拷贝MUC1的VNTR单体。
4.根据前述任何一个权利要求的一种核酸疫苗构建体，其进一步的特征在于所述分离多核苷酸的序列已被改变，导致在所得多肽上产生至少一个氨基酸突变，该突变导致所述糖基化改变或阻止。
5.根据权利要求5的一种核酸疫苗构建体，其中所述突变是氨基酸取代。
6.根据前述任何一个权利要求的一种核酸疫苗构建体，其进一步的特征在于当表达出被编码多肽时，该多肽可结合抗体SM3、ATR1、HMFG2或HMFG1。
7.根据前述任何一个权利要求的一种核酸疫苗构建体，其进一步的特征在于当表达出被编码多肽时，被编码多肽的糖基化在其上存在的至少60％的糖基化位点被阻止或改变。
8.根据权利要求7的一种核酸疫苗构建体，其中当表达出被编码多肽时，该多肽的糖基化在其上存在的至少80％糖基化位点被阻止或改变。
9.根据权利要求8的一种核酸疫苗构建体，其中当表达出被编码多肽时，该多肽的糖基化在其上存在的所有糖基化位点被阻止或改变。
10.根据权利要求7到9中任一个的一种核酸疫苗构建体，其中当表达出被编码多肽时，该多肽上至少一个苏氨酸或丝氨酸取代为缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸或色氨酸。
11.一种核酸疫苗构建体，其中含有以下序列GC# CC# GA* GT/U# CG# CC#其中#可以是核苷酸A，G，C，或T/U，*可以是核苷酸T/U或C。
12.根据权利要求11的一种核酸疫苗构建体，其中含有图3所示的序列。
13.一种核酸疫苗构建体，其中含有以下序列GC# CC# GA* AT/U@ CG# CC#其中，#可以是核苷酸A，G，C，或T/U*可以是核苷酸T/U或C@可以是核苷酸T/U，A或C。
14.根据权利要求13的一种核酸疫苗构建体，其中含有图2所示的序列。
15.根据前述任何一个权利要求的一种核酸疫苗构建体，其进一步含有一种编码异源多肽的多核苷酸。
16.根据权利要求15的一种核酸疫苗构建体，其中异源多肽是破伤风毒素、乙肝病毒核心蛋白、乙肝病毒表面蛋白、卵清蛋白、谷胱甘肽S转移酶、匙孔血蓝蛋白或鸽细胞色素C。
17.一种疫苗组合物，其中含有前述任何一个权利要求的一种核酸疫苗构建体，并组合有一种可药用载体。
18.权利要求1到16中任一个的核酸疫苗构建体，或者权利要求17的组合物在哺乳动物抗肿瘤疫苗接种中的用途。
19.权利要求1到16中任一个的一种核酸疫苗构建体或权利要求17的一种组合物在制造用于哺乳动物抗肿瘤疫苗接种的药物中的用途。
20.根据权利要求18或19的用途，其中构建体或组合物用基因枪给药。
21.根据权利要求18、19或20的用途，其中肿瘤是上皮细胞肿瘤。
22.根据权利要求21的用途，其中肿瘤是乳腺癌肿瘤。
23.对哺乳动物进行抗肿瘤疫苗接种的一种方法，包括给予所述哺乳动物权利要求1到16中任一个的核酸疫苗构建体，或权利要求17的组合物。
全文摘要
一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码来自Mucl的VNTR单体的含至少5个连续氨基酸残基的一段多肽，其中一或多个所述氨基酸是糖基化位点，其特征在于当所述分离多核苷酸在哺乳动物细胞中表达时，所得多肽的糖基化在至少一个所述糖基化位点被改变或阻止。
文档编号A61K48/00GK1434862SQ0081907
公开日2003年8月6日 申请日期2000年12月20日 优先权日1999年12月22日
发明者J·S·克罗维, J·H·埃利斯 申请人:葛兰素集团有限公司